大鼠心臟缺血再灌注后發(fā)生復(fù)雜室性心律失常對左心室功能的影響△

唐詠文，崔同濤，王 敏 ，郭 濤，許玲玲 ，劉 津，譚 寧

（1.廣東省心血管病研究所成人超聲科廣東省人民醫(yī)院（廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院），廣州510080；2.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院心血管內(nèi)科，廣州510120）

隨著社會人口老齡化，心肌梗死（myocardial infarction，MI）的發(fā)病率逐年升高。血管急性閉塞不僅導(dǎo)致心肌丟失，還會使心室重構(gòu)導(dǎo)致慢性心力衰竭［1］。盡早開通血管恢復(fù)灌注可以減輕心肌壞死、重構(gòu)并改善預(yù)后［2］。心肌組織再灌注后出現(xiàn)心肌損傷及功能惡化，誘發(fā)心肌細胞壞死和凋亡加重［3-4］，即缺血再灌注損傷（ischemia reperfusion injury，IRI）。心律失常，特別是復(fù)雜室性心律失常包括頻發(fā)室性期前收縮、室性心動過速是再灌注損傷的常見表現(xiàn)，且與心功能關(guān)系密切［5-6］。研究再灌注損傷致心律失常的特征和轉(zhuǎn)歸影響，對臨床工作有指導(dǎo)意義。臨床中發(fā)現(xiàn)急性MI 患者延遲再灌注后心功能改善不明顯，甚至出現(xiàn)病情惡化［7］。了解心律失常如何影響再灌注損傷可以幫助進一步認識延遲再灌注心肌損傷。動物心肌IRI 模型建立方法包括體內(nèi)原位冠狀動脈結(jié)扎或Langendorff 離體心臟缺血再灌注方法［8］。我們通過原位結(jié)扎法觀察大鼠心肌再灌注時心律失常與左心室功能變化及細胞凋亡改變，探討心律失常對再灌注損傷左心室功能的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

取 7～8 周 齡 、體 質(zhì) 量 180～220 g 雄 性 SD（Sprague Dawley）大鼠［許可證號：SCXK（粵）2013-0034］，按隨機數(shù)字表法分成3 組，每組至少12 只。操作遵守國家衛(wèi)生研究院實驗動物福利實驗指南。實驗已通過廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物實驗倫理審批，編號：［GDREC2014016H（R1）］，且在中山醫(yī)科大學(xué)無特定病原體（SPF）級實驗室完成（登記號：2016-218DS）。

1.2 分組及干預(yù)

實驗設(shè)計為大鼠原位心臟前降支血管結(jié)扎及釋放術(shù)。大鼠分為對照組、MI再灌注組和延遲再灌注組（n≥12）。對照組為假手術(shù)，前降支下僅穿線無結(jié)扎；MI再灌組（缺血1 h后再灌注，A組）為前降支結(jié)扎60 min 后釋放復(fù)灌注；延遲再灌注組（缺血4 h后再灌注，B 組）為結(jié)扎4 h 后釋放復(fù)灌注。觀察并記錄復(fù)灌注后大鼠心肌顏色、心電圖改變；術(shù)后24 h和3 d分別記錄大鼠心電圖及心律失常。復(fù)雜室性心律失常（complex ventricular arrhythmias，CVTA）指頻發(fā)室性期前收縮或短陣室性心動過速［9］。術(shù)后72 h 行超聲評估左心室功能變化；Masson′s 染色評估MI 區(qū)域形態(tài)及TUNEL 染色檢測心肌凋亡。

1.3 缺血再灌注模型建立

SD 鼠3 d 適應(yīng)期后禁食過夜，術(shù)前稱體質(zhì)量。10%水合氯醛以0.35 mL/100 g 劑量經(jīng)腹腔給藥麻醉大鼠后以18G 留置針經(jīng)口腔行氣管插管接呼吸機。大鼠四肢連接心電圖機導(dǎo)聯(lián)，于胸骨旁0.5 cm 處第3 至5 肋間切開皮膚約2 cm，鈍性分離皮下組織、肌肉［10］。將小棉團放在左心耳下幫助暴露左前降支（left descending artery，LAD）。以6-0 帶針眼科無損縫線于肺動脈圓錐根部進針，于左心耳下 2～3 mm 處出針過線，針寬 2～3 mm，深0.5～1.0 mm。輕提縫線如見前壁心肌顏色變淡，可初步判斷結(jié)扎有效。放置一段（5 mm）橡皮PE段于結(jié)扎處心臟表面，在橡皮PE 段上打結(jié)。前壁心肌呈蒼白色及肢Ⅱ?qū)?lián)ST 段弓背抬高1 mm 以上提示缺血成功。復(fù)灌30 s 后通過觀察前壁心肌顏色恢復(fù)及心電圖ST段回落判斷再灌注成功。

1.4 M 型超聲檢測左心形態(tài)及功能

建模72 h 后大鼠在乙醚麻醉下行M 型超聲檢測。在左心室長軸切面測量左心室舒張末期內(nèi)徑（left ventricular end diastolic dimension，LVEDD）、左心室收縮末期內(nèi)徑（left ventricular end-systolic dimension，LVESD）和左心室短軸縮短率（left ventricular fraction shortening，LVFS）；四腔心切面計算左心室舒張末期容量（left ventricular end-diastolic volume，LVEDV）、左心室收縮末期容量（left ventricular end-systolic volume，LVESV）；Simpson′s 法計算左心室射血分數(shù)（left ventricular ejection fraction，LVEF）、每搏射血量（stroke shot，SS）和心排血出量（cardiac output，CO）。檢測由專業(yè)超聲技師在Visual Sonics Vevo2100 動物超聲機上完成。

1.5 心肌組織學(xué)染色和TTUUNNEELL 法檢測細胞凋亡

再灌注后 72 h 行 Masson′s 染色及 TUNEL 染色反映各組心肌缺血危險區(qū)組織形態(tài)學(xué)及細胞凋亡改變。取結(jié)扎點下2 mm 處心肌組織于4%多聚甲醛固定，酒精脫水后石蠟包埋并切片。行Masson′s染色后在光學(xué)顯微鏡下觀察。采用改進的TUNEL方法［11］，石蠟包埋切片預(yù)處理、脫蠟后多聚甲醛固定；2 mg/mL的蛋白酶K溶液通透樣本；加入450 μL熒光素片段末端標記反應(yīng)混合物以及50 μL TdT酶行標記反應(yīng)，封片并熒光激發(fā)。在綠色熒光濾片下觀察被標記的紅色熒光凋亡細胞。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0 進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料經(jīng)Levene′s 檢驗為正態(tài)分布以（）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗或單因素方差分析（one-way ANOVA）；組內(nèi)多重比較用最小意義差異檢驗LSD法或Dummetts（方差不齊時）。計數(shù)資料以［n（%）］表示，組間比較用卡方（χ2）檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，所有檢驗均為雙側(cè)檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠左心室功能超聲指標比較

再灌注A 組和延遲再灌注B 組大鼠SS、LVEF、LVFS 和CO 較對照組明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1。再灌注A 組和延遲再灌注B組大鼠LVESV 呈增加趨勢，但兩組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。LSD 法分析結(jié)果顯示，延遲再灌注B 組較對照組大鼠LVESD 明顯增加（f=1.0，P=0.038）；延遲再灌注B 組較對照組大鼠 LVESV 明顯增加（f=46.40，P=0.03）；SS、LVEF 和 LVFS 均明顯下降（f=33.70，P=0.02；f=21.53，P=0.003；f=14.67，P=0.002），差異有統(tǒng)計學(xué)意義。再灌注A 組較對照組大鼠SS、LVEF 和LVFS 均明顯下降（f=25.71，P=0.02；f=14.21，P=0.04；f=8.71，P=0.04）；再灌注A 組和延遲再灌注 B 組大鼠 SS、LVEF 和 LVFS 比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（f=7.98，P=0.33）。再灌注A組及延遲再灌注B 組大鼠CO 較對照組均明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（A 組vs.對照組：f=8.93，P=0.01；B 組vs.對照組：f=11.92，P=0.001）。再灌注 A 組和延遲再灌注B 組大鼠心率、體質(zhì)量及LVEDD 及LVEDV比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2 再灌注后發(fā)生CCVVTTAA 亞組和無CCVVTTAA 亞組大鼠左心室超聲指標比較

延遲再灌注B 組大鼠再灌注后心律失常發(fā)生率為67%（8/12），其中 1 例為心房顫動，1 例為偶發(fā)房性期前收縮；50%（6/12）例表現(xiàn)為室性期前收縮二聯(lián)律或短陣室性心動過速。再灌注A 組大鼠中發(fā)現(xiàn)3 例短陣室性心動過速、1 例頻發(fā)室性期前收縮二聯(lián)律及2 例房性期前收縮。再灌注A 組大鼠CVTA 發(fā)生率為 33%（4/12），延遲再灌注B 組大鼠CVTA 發(fā)生率為50%（6/12），兩組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=0.69，P=0.41）。再灌注發(fā)生CVTA亞組和無CVTA 亞組大鼠體質(zhì)量、心率、LVEDD 和LVEDV 比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；再灌注發(fā)生CVTA 亞組大鼠心臟收縮功能明顯下降，包括 LVESD 和 LVESV 增大，SS、LVEF、LVFS 和 CO 下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

2.3 再灌注后及延遲再灌注后發(fā)生CCVVTTAA 亞組和無CCVVTTAA 亞組大鼠左心室超聲指標比較

與再灌注后無CVTA 亞組大鼠比較，再灌注后發(fā)生CVTA 亞組大鼠的LVESD（f=-4.57，P=0.001，圖1A）、LVESV（f=-4.12，P=0.002，圖1C）、LVEDD（f=-2.75，P=0.02，圖1B）和LVEDV（f=-2.76，P=0.02，圖1D）增大；SS（f=2.51，P=0.04，圖1E）、LVEF（f=5.62，P＜0.001，圖1F）、LVFS（f=5.08，P=0.001，圖1G）、CO（f=2.61，P=0.03，圖1H）下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 3 組大鼠左心室超聲指標比較 ［n=12，±s］

表1 3 組大鼠左心室超聲指標比較 ［n=12，±s］

注：與對照組比較，*P＜0.05；與再灌注組A 組比較，1）*P＜0.05

檢測指標體質(zhì)量（g）心率（次/min）LVESD（mm）LVEDD（mm）LVESV（μL）LVEDV（μL）SS（μL）LVEF（%）LVFS（%）CO（mL/min）對照組253.50±21.24 382.60±52.50 3.77±0.90 5.91±0.80 65.36±28.39 171.25±38.93 112.33±27.94 64.98±11.52 36.97±9.48 41.87±6.05再灌注組A 組272.25±40.69 379.40±28.21 4.22±0.90 5.82±0.62 84.63±37.50 177.36±49.25 86.62±17.56*52.77±13.97*28.26±9.40*32.95±7.47*延遲再灌注組B 組258.33±32.60 384.07±27.57 4.88±0.94*5.94±0.69 111.75±48.21*180.20±44.46 78.64±17.39*43.45±12.741）*22.31±7.651）*29.91±5.681）*F 值0.77 0.06 2.59 0.45 2.87 0.55 5.87 5.54 5.68 6.78 P 值0.47 0.94 0.09 0.64 0.07 0.58 0.008 0.01 0.009 0.004

表2 再灌注后發(fā)生CVTA 亞組和無CVTA 亞組大鼠左心室超聲指標比較 ［±s］

表2 再灌注后發(fā)生CVTA 亞組和無CVTA 亞組大鼠左心室超聲指標比較 ［±s］

檢測指標n體質(zhì)量（g）心率（次/min）LVESD（mm）LVEDD（mm）LVESV（μL）LVEDV（μL）SS（μL）LVEF（%）LVFS（%）CO（mL/min）再灌注無CVTA 組14 264.71±40.13 385.62±24.08 4.05±0.93 5.74±0.76 77.63±43.08 166.45±49.26 88.82±20.41 55.65±12.78 30.02±8.51 34.05±7.49再灌注發(fā)生CVTA 亞組10 266.10±33.54 376.29±31.97 5.12±0.53 6.28±0.39 126.97±28.14 200.94±27.20 73.97±6.67 37.55±68.14 18.65±3.84 27.76±2.68 F 值-0.09 0.82-3.27-2.06-3.16-2.0 2.21 4.07 3.93 2.90 P 值0.93 0.42 0.004 0.051 0.005 0.058 0.038＜0.001 0.001 0.01

與延遲再灌注無CVTA 亞組大鼠比較，延遲再灌注發(fā)生 CVTA 亞組大鼠 LVEF（f=2.76，P=0.04，圖1F）、LVFS（f=3.79，P=0.03，圖1G）減少，LVESV（f=-2.22，P=0.02，圖1C）增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；兩亞組大鼠SS（f=1.05，P=0.32，圖1E）、CO（f=1.20，P=0.26，圖1H）、LVESD（f=-1.36，P=0.21，圖1A）、LVEDD（f=-0.87，P=0.41，圖1B）、LVEDV（f=-0.79，P=0.45，圖1D）比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

2.4 形態(tài)學(xué)染色及凋亡染色結(jié)果分析

如圖2A 所示，Masson′s 染色可見再灌注發(fā)生CVTA 亞組大鼠心肌纖維斷裂范圍均較大；同時心肌纖維化程度更加明顯，心肌細胞明顯萎縮，而心室肌層無明顯變薄。圖2B 中TUNEL 染色顯示綠染的心肌凋亡細胞核占比在再灌注發(fā)生CVTA 亞組大鼠中均較再灌注無CVTA 組大鼠增多，提示發(fā)生CVTA 亞組大鼠心肌細胞丟失更多。在延遲再灌注組有更多心肌細胞發(fā)生凋亡，對左心功能影響更明顯。

3 討 論

本實驗結(jié)果顯示，再灌注后室性心律失常在延遲再灌注組大鼠的發(fā)生率約為延遲再灌注組大鼠的1.4 倍。CVTA 在再灌注即刻至再灌注后數(shù)天均可觀察到。無論是在再灌注組或延遲再灌注組，大鼠發(fā)生室性心律失常對其LVESV、LVEF 和LVFS 均有明顯的負性影響。根據(jù)既往對4 400 例MI 行再灌注治療的患者報道，再灌注損傷伴室性心律失?？筛哌_20%～25%，其中室性心動過速最為常見，約占所有心律失常的35%，且無論再灌注時抑或晚期室性心律失常均增加患者院內(nèi)及院外3～5 倍死亡風(fēng)險［5］。同期有研究采用心臟核磁共振（CMR）方法評估損傷心肌，提示延遲再灌注下的心肌受損更嚴重，表現(xiàn)為心肌壞死面積增大和血管微循環(huán)阻力增加［12］。

心肌細胞再灌注后細胞線粒體內(nèi)過氧自由基釋放及細胞內(nèi)抗氧化能力減弱；細胞膜脂質(zhì)的過氧化作用導(dǎo)致其通透性增加并影響細胞功能［13-14］。鈣超載后心肌細胞內(nèi)鈣離子增加會導(dǎo)致心肌細胞早后除極，心肌細胞自律性降低，誘導(dǎo)心律失常發(fā)生［15］。同時過氧自由基產(chǎn)生后可激活線粒體K+（ATP）通道過多開放，影響線粒體膜電位［16-17］，同時也可激發(fā)內(nèi)源性細胞凋亡途徑致心肌細胞凋亡。在本實驗中，心臟Masson′s 染色提示再灌注后發(fā)生室性心律失常亞組大鼠的纖維化程度更加明顯，心肌細胞萎縮也更加明顯。而TUNEL 染色也提示發(fā)生CVTA 亞組大鼠心肌細胞核凋亡比例均較再灌后無CVTA 亞組大鼠增多；結(jié)合超聲結(jié)果可發(fā)現(xiàn)其顯著影響左心室的收縮功能，表現(xiàn)為LVEF、LVFS 下降且 LVESV 變大。

再灌注損傷的干預(yù)可以采用缺血預(yù)處理［18］（ischemic preconditioning，IP）和遠端預(yù)處理［19］（remote post-conditioning）方法進行預(yù)防?；A(chǔ)研究提示遠端肢體IP 通過影響心肌K+（ATP）通道有效保護心臟收縮功能，并可有效減少再灌注后心律失常發(fā)生［20］。同樣在臨床中，首次醫(yī)療接觸后給予急性胸痛患者外周動脈IP，可以有效減少介入治療中心臟靶血管無復(fù)流的發(fā)生率［19］。同樣冠狀動脈缺血后處理（ischemic post-conditioning）可以通過對靶血管多次短暫的開通和阻斷操作實現(xiàn)。既往研究發(fā)現(xiàn)，缺血后處理可明顯降低室性心律失常持續(xù)時間，是減少再灌注后心肌損傷和改善預(yù)后的一種治療策略［21］。同時聯(lián)合新型的抗血小板藥物和抗凝劑，也可以大約降低35%～50%心肌最終受損面積?？寡踝杂苫幬锶巛o酶Q10 可以通過改善心肌細胞能量代謝；鈣通道阻滯劑可以通過降低鈣超載的直接心肌損害和通過降低后負荷，增加CO 改善MI 后心律失常和改善后續(xù)可能的心力衰竭［20］。結(jié)合本實驗觀察結(jié)果，提示再灌注后發(fā)生CVTA 可以顯著影響左心室收縮功能；特別是在延遲缺血再灌注條件下，室性心律失常對左心室功能影響更加明顯。

總之，MI 再灌注后發(fā)生CVTA 可致左心室收縮功能進一步下降；同時伴有更加明顯的心肌細胞萎縮、細胞凋亡和組織纖維化。