油炸提取工藝對(duì)大黃中指標(biāo)性成分的影響*

汲麗麗，呂邵娃，侯立強(qiáng)，楊志欣

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040 2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué) 第二附屬醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150001）

中藥一般采取煎煮法、浸漬法、滲漉法、回流提取法等提取有效成分，對(duì)藥材中水溶性成分的提取率較高[1]。近年來(lái)，油炸為傳統(tǒng)膏劑藥料提取法具獨(dú)特提取優(yōu)勢(shì)，能充分富集藥材中脂溶性、非極性等成分，引起了研究人員的廣泛關(guān)注。傳統(tǒng)膏藥制備時(shí)，常將中藥飲片放入麻油浸泡，在高溫下油炸，提取藥物有效成分[2]?，F(xiàn)代研究證實(shí)，油在高溫下會(huì)發(fā)生氧化、聚合等一系列復(fù)雜生化反應(yīng)，并生成醛、酮、低級(jí)脂肪酸等低分子物質(zhì)，這些分解產(chǎn)物是否會(huì)與藥材中有效成分結(jié)合，提高其溶出度，仍需進(jìn)一步研究?；谟驼ㄌ崛?yōu)勢(shì)，本課題組聚焦大黃，探索油炸提取對(duì)大黃中有效成分的影響。大黃作為大宗藥材，別名將軍[3]，《神農(nóng)本草經(jīng)》載其“下瘀血，血閉，寒熱，破癥瘕積聚，留飲宿食[4]”。在治療燒燙傷等皮膚疾病方面具突出療效，其中大黃素、大黃酚等蒽醌類(lèi)成分是大黃重要的活性成分[5]，2015版《中國(guó)藥典》將其作為質(zhì)量控制的指標(biāo)成分[6]?，F(xiàn)代研究證實(shí)大黃素、大黃酚還具抗炎、抑菌、抗病毒等優(yōu)良藥理作用[7]，通過(guò)油炸提取后，大黃素、大黃酚會(huì)產(chǎn)生何種變化？基于此，本課題組以大黃素、大黃酚為指標(biāo)性成分，建立大黃油提取物的含量測(cè)定方法，對(duì)油炸大黃的溫度、油量、浸泡時(shí)間等進(jìn)行考察，以期豐富大黃中指標(biāo)性成分的提取工藝。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料及儀器

UItiMate3000色譜儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）；N-1100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（埃朗國(guó)際科技有限公司）；SHB-III循環(huán)水式多用真空系（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）；SB-5200D型超聲波清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）；ZDHW型調(diào)溫型電熱套（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）；ME155DU型1/10萬(wàn)電子天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）；DJ1000A電子天平（莆田市亞太計(jì)量?jī)x器有限公司）；HH-S2恒溫水浴鍋（上海精宏儀器設(shè)備有限公司）；DZF-6050型真空干燥箱（上海博遠(yuǎn)實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）。

大黃素對(duì)照品（批號(hào)：18041909 HPLC＞98% 中國(guó)藥品生物制品檢定所）；大黃酚對(duì)照品（批號(hào)：18672210 HPLC＞98%中國(guó)藥品生物制品檢定所）；大黃購(gòu)自哈爾濱普方藥業(yè)飲片有限公司，經(jīng)鑒定為蓼科植物藥用大黃Rheum officinale Baill.干燥根和根莖。甲醇、磷酸為色譜純；其他試劑均為分析純；水為純凈水（娃哈哈集團(tuán)有限公司）；芝麻油為食用級(jí)（批號(hào)SC10223010300303哈爾濱市美獅實(shí)業(yè)有限公司）。

1.2 供試品溶液的制備

取油提取物10mL，加石油醚50mL，稍攪拌，加10%鹽酸溶液50mL，取下層，加三氯甲烷25mL，加熱回流1h，放冷，將混合溶液轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，加三氯甲烷提取3次，每次10mL，合并三氯甲烷，回收至干，加少量甲醇溶解，定容于1mL容量瓶中，0.22μm微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

1.3 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取5mg大黃素對(duì)照品，加甲醇制成每1mL含0.01mg的溶液，搖勻，即得大黃素對(duì)照品溶液。精密稱取5mg大黃酚對(duì)照品，加甲醇制成每1mL含0.014mg的溶液，搖勻，即得大黃酚對(duì)照品溶液。

1.4 色譜條件

Venusil C18Plus（4.6×250mm，5μm）；流動(dòng)相為甲醇：0.1%H3PO4（85∶15），檢測(cè)波長(zhǎng)：254nm，流速：1.0mL·min-1，柱溫：30℃，進(jìn)樣量 20μL，在此色譜條件下測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖1～4，大黃素、大黃酚的峰與相鄰峰基線分離較好，大黃素、大黃酚的理論塔板數(shù)不低于2000，可知該方法專屬性良好。

圖1 空白樣品液相色譜圖Fig.1 Liquid chromatogram of blank sample

圖2 對(duì)照品液相色譜圖Fig.2 Liquid chromatogram of reference material

圖3 樣品液相色譜圖Fig.3 Sample liquid chromatogram

圖4 缺大黃陰性樣品液相色譜圖Fig.4 Liquid chromatogram of rhubarb negative sample

1.5 線性關(guān)系考察

1.5.1 線性及相關(guān)系數(shù) 取對(duì)照品溶液1、3、5、7、10、20、25μL，在 2.1.3 條件下進(jìn)樣分析。以進(jìn)樣濃度（mg·mL-1）為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為；大黃素Y=66.226x+0.0781（R2=0.9999），線性范圍 0.01～6.25μg，大黃酚 Y=74.046x+0.127（R2=0.9999），線性范圍 0.014～8.75μg。

1.5.2 精密度試驗(yàn) 取對(duì)照品溶液，按“1.4”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6次，測(cè)得大黃素、大黃酚峰面積的RSD分別為0.32%和0.44%，表明儀器精密度良好。

1.5.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 按“1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在室溫下分別放置 0，2，4，8，12，24h 后進(jìn)樣，依法測(cè)定，結(jié)果顯示大黃素和大黃酚峰面積RSD為1.60%和1.29%，表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

1.5.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取油提取物6份，按“1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“1.4”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得大黃素的平均含量為 1.457μg·mL-1，RSD 為3.190%（n=6），大黃酚的平均含量為 1.525μg·mL-1，RSD為1.315%（n=6）。表明該方法有良好的重現(xiàn)性。

1.5.5 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的供試品溶液6份，分別精密加入含大黃素（2μg）、大黃酚（2μg）在“1.4”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，依法測(cè)定，計(jì)算回收率。兩種成分平均回收率分別為大黃素97.94%和大黃酚98.59%；RSD分別為1.05%，1.10%。兩種成分的加樣回收率介于97%～98%之間。

2 油炸提取單因素考察

2.1 油量考察

稱取大黃（0.75g）、芝麻油置不銹鋼杯中，選取5個(gè)水平（3～12倍量）香油進(jìn)行考察，具體工藝流程如下：大黃→加油（3～12倍量）浸泡 12h→200℃油炸（4h）冷卻，過(guò)濾→得5份油提取物，據(jù)上述色譜條件測(cè)定大黃素、大黃酚含量。結(jié)果見(jiàn)表1、2、圖5。

表1 芝麻油量對(duì)大黃素影響結(jié)果（n=3）Tab.1 Effect of sesame oil on emodin（n=3）

表2 芝麻油量對(duì)大黃酚影響結(jié)果（n=3）Tab.2 Effect of sesame oil on chrysophanol（n=3）

圖5 芝麻油量對(duì)提取工藝的影響Fig.5 Effect of sesame oil quantity on extraction process

由圖5、表1、2可知，隨油量的增加，大黃素和大黃酚的含量先逐漸增加后降低，當(dāng)油到達(dá)5倍量為大黃油炸的最佳香油用量。

2.2 油炸時(shí)間

稱取大黃（0.75g）、芝麻油置不銹鋼杯中，選取10個(gè)水平（0.5～5h）油炸時(shí)間進(jìn)行考察，具體工藝流程如下：大黃→加油浸泡12h→200℃油炸（0.5～5h）→冷卻，過(guò)濾得10份油提取物，測(cè)據(jù)上述色譜條件定大黃素、大黃酚含量。結(jié)果見(jiàn)表3、4、圖6。

表3 油炸時(shí)間對(duì)大黃素影響結(jié)果（n=3）Tab.3 Effect of frying time on emodin（n=3）

表4 油炸時(shí)間對(duì)大黃酚影響結(jié)果（n=3）Tab.4 Effect of frying time on chrysophanol（n=3）

圖6 油炸時(shí)間對(duì)提取工藝的影響Fig.6 Effect of frying time on extraction process

由圖6、表3、4可知，隨著油炸時(shí)間的增加，大黃素和大黃酚的含量先逐漸增加后降低，當(dāng)油炸時(shí)間到達(dá)3.0～4.0h為大黃最佳油炸時(shí)間。

2.3 浸泡時(shí)間

稱取大黃（0.75g）、芝麻油置不銹鋼杯中，選取5個(gè)水平（2～36h）的浸泡時(shí)間進(jìn)行考察，具體工藝流程如下：大黃→加油浸泡（2～36h）→油炸（220℃炸4h）→冷卻，過(guò)濾→得5份油提取物，結(jié)果見(jiàn)表5、6、圖 7。

表5 浸泡時(shí)間對(duì)大黃素影響結(jié)果（n=3）Tab.5 Effect of soaking time on emodin（n=3）

表6 浸泡時(shí)間對(duì)大黃酚影響結(jié)果（n=3）Tab.6 Effect of soaking time on chrysophanol（n=3）

圖7 浸泡時(shí)間對(duì)于提取工藝的影響Fig.7 Effect of soaking time on extraction process

由圖7和表5、6可知，隨著浸泡時(shí)間的增加，大黃素和大黃酚的含量先逐漸增加后降低，當(dāng)浸泡時(shí)間到達(dá)12h時(shí)達(dá)到最大，因此，浸泡12h為大黃最佳浸泡時(shí)間。

2.4 油炸溫度

稱取大黃（0.75g）、芝麻油置不銹鋼杯中，選取5個(gè)水平（90～240℃）油炸溫度進(jìn)行考察，具體工藝流程如下：大黃→加香油浸泡（12h）→油炸（90～240℃）→冷卻，過(guò)濾得5份油提取物。測(cè)定大黃素、大黃酚含量。結(jié)果見(jiàn)表7、8、圖8。

表7 油炸溫度對(duì)大黃素影響結(jié)果（n=3）Tab.7 Effect of frying temperature on emodin（n=3）

表8 油炸溫度對(duì)大黃酚影響結(jié)果（n=3）Tab.8 Effect of frying temperature on chrysophanol（n=3）

圖8 油炸溫度對(duì)于提取工藝的影響Fig.8 Influence of frying temperature on extraction process

由圖8和表7、8可知，隨著油炸溫度的增加，大黃素和大黃酚的含量先逐漸增加后降低，當(dāng)油炸溫度到達(dá) 120～220℃時(shí)達(dá)到最大，因此，油炸 120～200℃為大黃最佳油炸溫度。

2.5 粉碎度

選取3個(gè)水平（不打粉、20目、40目）的粉碎度進(jìn)行考察，具體工藝流程如下：大黃→加5倍量香油浸泡12h→200℃油炸4h→冷卻，過(guò)濾得5份油提取物，測(cè)定大黃素、大黃酚含量，見(jiàn)表9、10，見(jiàn)圖9。

表9 粉碎度對(duì)大黃素影響結(jié)果（n=3）Tab.9 Effect of grinding degree on emodin（n=3）

表10 粉碎度對(duì)大黃酚影響結(jié)果（n=3）Tab.10 Effect of grinding degree on chrysophanol（n=3）

圖9 粉碎度對(duì)提取工藝的影響Fig.9 Effect of grinding degree on extraction process

由圖9、表9、10可知，隨粉碎度增加，大黃素和大黃酚的含量先逐漸增加后降低，40目時(shí)為當(dāng)大黃最佳粉碎目數(shù)，但考慮到藥材打粉后，在油炸過(guò)程中需時(shí)時(shí)攪拌，以防糊鍋，建議在臨床生產(chǎn)時(shí)，不打粉。

3 討論與結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)大黃油炸提取工藝單因素考察，可確定其最佳前提取工藝為：稱取大黃（0.75g），加入5倍量香油，浸泡12h，在200℃下油炸為3～4h取出、放涼備用。在上述條件下大黃中大黃素、大黃酚等指標(biāo)性成分在其油提取液中富集度最高。綜上所述，本實(shí)驗(yàn)不僅建立了大黃油炸提取工藝，還成功建立在此提取工藝下大黃素、大黃酚含量測(cè)定方法，為大黃指標(biāo)性成分的提取研究提供了重要實(shí)驗(yàn)依據(jù)，但油炸提取法對(duì)大黃中其它成分的影響，仍需進(jìn)行進(jìn)一步的檢測(cè)和研究。