羥基紅花黃色素A對(duì)心肌缺血再灌注損傷大鼠血清炎性因子及心肌組織NF-κB表達(dá)的影響

張 園，張 妍

心肌梗死是常見的嚴(yán)重心血管疾病，主要由冠狀動(dòng)脈急性持續(xù)性缺血缺氧引起心肌壞死，是威脅人類健康和導(dǎo)致死亡的主要原因[1]。臨床治療心肌梗死的手段主要通過藥物溶栓、心臟搭橋或介入方式，恢復(fù)心臟缺血冠狀動(dòng)脈血液供應(yīng)從而實(shí)現(xiàn)再灌注[2]。短時(shí)間內(nèi)快速恢復(fù)缺血心肌血液供應(yīng)造成缺血再灌注損傷，嚴(yán)重影響再灌注治療及心臟功能恢復(fù)，甚至出現(xiàn)心律失常、心肌梗死病情加重、心力衰竭等危重事件[3]。因此，如何減輕再灌注損傷已成為目前心血管疾病治療的研究熱點(diǎn)[4]。

羥基紅花黃色素A是一種重要的黃酮類化合物，屬于查耳酮類化合物，是中藥紅花的主要藥效成分，具有擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈血管、降血壓、抗氧化、抗炎、抗血小板聚集、抗心肌缺血、抗腫瘤等多種藥理作用[5-6]。為明確羥基紅花黃色素A對(duì)心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用機(jī)制，本研究探討羥基紅花黃色素A對(duì)心肌缺血再灌注損傷大鼠血清炎性因子及心肌組織核因子-κB(NF-κB)表達(dá)的影響，為臨床防治心肌缺血再灌注損傷提供基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 取雄性SD大鼠50只，體質(zhì)量(200±20)g由承德醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物及試劑 羥基紅花黃色素A(大連美侖生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)A1228AS，純度≥98%)，大鼠CD4、CD8酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)試劑盒均購自上海將來實(shí)業(yè)股份有限公司；腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor α，TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(interleukin 6，IL-6)、C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein，CRP)試劑盒均購自南京建成生物技術(shù)有限公司；NF-κB、NF-κB抑制蛋白激酶α(IκBα)、NF-κB抑制蛋白激酶β(Iκκβ)和β-actin抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；BCA蛋白測(cè)定試劑盒購自美國Thermo公司；ECL發(fā)光液和硝酸纖維素膜購自美國Millipoer公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 小動(dòng)物呼吸機(jī)(北京新利科技有限公司生產(chǎn)，HL-B6型)；生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司生產(chǎn)，型號(hào)BL-420S)；Spectra Max iD5-多功能酶標(biāo)儀(中國上海美谷分子儀器有限公司)；H1650臺(tái)式高速離心機(jī)(湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 分組 50只雄性SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為假手術(shù)組、缺血再灌注組(模型組)、尼莫地平組(陽性藥對(duì)照組，20 mg/kg)及羥基紅花黃色素A高劑量組(20 mg/kg)、羥基紅花黃色素A低劑量組(10 mg/kg)，每組10只。各組大鼠分別灌胃相應(yīng)藥物，假手術(shù)組和模型組大鼠灌胃等體積生理鹽水。

1.3.2 藥物干預(yù) 各組大鼠于造模前14 d分別灌胃給藥，陽性藥對(duì)照組灌胃尼莫地平(20 mg/kg)，羥基紅花黃色素A高劑量組、低劑量組分別給予羥基紅花黃色素A 20 mg/kg、10 mg/kg，假手術(shù)組和模型組大鼠灌胃等體積(5 mL/kg)生理鹽水，藥物干預(yù)期間各組大鼠常規(guī)飼養(yǎng)，自由飲食。

1.3.3 造模 通過結(jié)扎大鼠冠狀動(dòng)脈左前降支建立心肌缺血再灌注損傷模型[7]。各組大鼠于末次給藥后禁食、不禁水12 h，腹腔注射10%水合氯醛(3 mL/kg)麻醉后仰臥固定，頸部、心前區(qū)備皮，碘伏消毒，切開頸部皮膚，分離氣管，以鹽酸利多卡因浸潤后，行氣管插管，連接動(dòng)物呼吸機(jī)(參數(shù)：潮氣量為15 mL，呼吸頻率為1∶2)。沿胸骨左緣第3肋與第4肋間切開皮膚2.0～2.5 cm，使用小開胸器輕輕撐開切口，剪開心包，輕壓右側(cè)胸廓，擠出心臟，使用止血鉗將左心耳提起，確定冠狀動(dòng)脈左前降支(左心耳下方2 mm)，以0號(hào)縫合線行高位或中位活結(jié)結(jié)扎，快速將心臟送回胸腔，清除胸腔內(nèi)空氣和血液并關(guān)閉胸腔，術(shù)中監(jiān)測(cè)心電圖Ⅱ?qū)?lián)，以ST段、T波抬高作為判斷造模成功與否的標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)扎30 min后開胸，打開結(jié)扎線行再灌注，持續(xù)時(shí)間120 min，逐層縫合關(guān)胸，動(dòng)物恢復(fù)自主呼吸。假手術(shù)組僅開胸、穿線但不結(jié)扎。測(cè)量各組大鼠缺血再灌注后左室舒張末期壓力(left ventricular end diastolic pressure，LVEDP)和左室收縮壓(left ventricular systolic pressure，LVSP)，評(píng)價(jià)心臟功能。

1.3.4 指標(biāo)檢測(cè) 各組大鼠缺血30 min再灌注120 min后，頸總動(dòng)脈取血3 mL，室溫靜置2 h，4 ℃條件下3 000 r/min離心5 min，分離血清，即刻檢測(cè)血清TNF-α、IL-6、CRP等炎性因子水平。取血完畢后，再取各組大鼠左心室缺血區(qū)心肌組織(假手術(shù)組參照模型組相同部位取材)，采用Western Blotting法檢測(cè)心肌組織NF-κB、IκBα和Iκκβ蛋白表達(dá)，具體方法為：液氮中研磨大鼠心肌組織，加入RIPA裂解液(RIPA Lysis Buffer)裂解，BCA法進(jìn)行蛋白定量，加5×上樣緩沖液煮沸10 min，進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳結(jié)束后經(jīng)PVDF膜轉(zhuǎn)膜(電壓100 V，90 min)，5%脫脂奶粉封閉過夜，NF-κB、IκBα、Iκκβ和內(nèi)參β-actin等一抗(1∶1 000)稀釋液室溫孵育2h，再以辣根酶標(biāo)記的二抗(1∶5 000)稀釋液室溫孵育1 h，加顯色液顯色，按照ECL試劑盒說明書進(jìn)行操作，將發(fā)光液均勻地滴在PVDF膜上，反應(yīng)1 min，最后將膜放入暗室顯影。結(jié)果以目的蛋白灰度值/β-actin灰度值表示，采用Image J軟件對(duì)顯影條帶進(jìn)行分析。

1.3.5 心肌組織病理學(xué)檢查 取血完畢后，再取各組大鼠左心室缺血區(qū)心肌組織(假手術(shù)組參照模型組相同部位取材)，以4%的多聚甲醛溶液固定，4 ℃過夜，梯度乙醇脫水、石蠟包埋、制成4 μm切片，使用蘇木精-伊紅(HE)染色，光鏡下觀察左心室組織學(xué)改變。

2 結(jié) 果

2.1 各組心肌缺血再灌注損傷大鼠左心室組織變化 假手術(shù)組大鼠心肌纖維排列整齊有序，組織間隙水腫較輕微，僅有輕度瘀血，周圍組織有微量滲出，血管輕度擴(kuò)張。模型組大鼠心肌嚴(yán)重受損，心肌纖維扭曲斷裂，細(xì)胞腫脹，組織間隙水腫，細(xì)胞核散亂無序，染色疏松。與模型組比較，羥基紅花黃色素A各劑量組及尼莫地平組大鼠心肌纖維斷裂較少，組織間隙腫脹較輕，心肌間隙血管擴(kuò)張不明顯，組織間隙水腫較輕。詳見圖1。

圖1 各組心肌缺血再灌注損傷大鼠左心室組織光鏡圖(HE染色，400×) (A為假手術(shù)組；B為模型組；C為尼莫地平組；D為羥基紅花黃色素A高劑量組；E為羥基紅花黃色素A低劑量組)

2.2 各組心肌缺血再灌注損傷大鼠心臟功能比較 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠LVEDP升高，LVSP降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，羥基紅花黃色素A高劑量組、低劑量組及尼莫地平組大鼠LVEDP降低，LVSP升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；羥基紅花黃色素A高劑量組、低劑量組與尼莫地平組LVEDP、LVSP比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見表1。

表1 各組心肌缺血再灌注損傷大鼠心臟功能比較(±s) 單位：mmHg

2.3 各組心肌缺血再灌注損傷大鼠血清炎性因子水平比較 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清TNF-α、IL-6、CRP炎性因子水平升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，羥基紅花黃色素A高劑量組、低劑量組及尼莫地平組大鼠血清TNF-α、IL-6、CRP炎性因子水平均降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；羥基紅花黃色素A高劑量組、低劑量組與尼莫地平組TNF-α、IL-6、CRP炎性因子水平比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見表2。

表2 各組心肌缺血再灌注損傷大鼠血清炎性因子水平比較(±s)

2.4 各組心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌組織NF-κB、IκBα 和 Iκκβ蛋白表達(dá)比較 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心肌組織NF-κB蛋白表達(dá)升高，IκBα、Iκκβ蛋白表達(dá)降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，羥基紅花黃色素A高劑量組、低劑量組、尼莫地平組大鼠心肌組織NF-κB蛋白表達(dá)降低，IκBα、Iκκβ蛋白表達(dá)均升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；羥基紅花黃色素A高劑量組、低劑量組與尼莫地平組NF-κB、IκBα和Iκκβ蛋白表達(dá)比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見圖2。

與假手術(shù)組比較，*P<0.05； 與模型組比較，#P<0.05。圖2 各組心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌組織 NF-κB、IκBα和Iκκβ蛋白表達(dá)比較

3 討 論

心肌缺血再灌注損傷是指心肌缺血后血液供應(yīng)恢復(fù)，但缺血性損害未恢復(fù)，反而進(jìn)一步加重，其病理機(jī)制復(fù)雜，與心肌細(xì)胞凋亡、炎性因子產(chǎn)生及核轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控等有關(guān)[8]。有研究表明，心肌缺血激活炎癥反應(yīng)，急性炎癥反應(yīng)又引起繼發(fā)性心肌損傷，而再灌注又加重心肌急性炎癥反應(yīng)程度，心肌缺血再灌注引起機(jī)體炎癥反應(yīng)激活炎癥細(xì)胞釋放TNF-α、IL-6、CRP及干擾素等大量炎性因子，加重炎癥反應(yīng)[9]。

NF-κB是一種具有調(diào)控作用的核轉(zhuǎn)錄因子，在維持機(jī)體正常生理功能中發(fā)揮重要作用，介導(dǎo)機(jī)體炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答，并參與調(diào)控細(xì)胞周期、分化和凋亡[10]，靜息狀態(tài)時(shí)，存在于細(xì)胞質(zhì)NF-κBp65、p50與IκBα組成的三聚體復(fù)合物，無活性；當(dāng)NF-κBp65、p50、IκBα三聚體被炎癥介質(zhì)激活后，細(xì)胞中Iκκβ磷酸化為p-Iκκβ，級(jí)聯(lián)NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)；IκBα蛋白激活NF-κB信號(hào)通路，由于NF-κB與IκBα親和力較強(qiáng)，IκBα表達(dá)量高，可抑制NF-κB活化，而IκBα表達(dá)量低，NF-κB活化程度較高[11]。NF-κB活化后轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞核，促進(jìn)白細(xì)胞介素(IL)-1、IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α等多種炎性因子表達(dá)[12]。有研究顯示，NF-κB的異常激活與心肌缺血再灌注引起的心肌細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，心肌缺血再灌注發(fā)生時(shí)，激活心肌組織NF-κB信號(hào)通路，心肌組織NF-κB蛋白表達(dá)升高，IκBα、Iκκβ蛋白表達(dá)量降低[13]。本研究結(jié)果表明，羥基紅花黃色素A高劑量組、低劑量組、尼莫地平組大鼠心肌組織NF-κB蛋白表達(dá)低于模型組，IκBα、Iκκβ蛋白表達(dá)高于模型組。

炎癥反應(yīng)是心肌缺血再灌注引起心肌損傷的重要病理特點(diǎn)之一，主要表現(xiàn)為心肌局部炎癥細(xì)胞大量浸潤并合成，分泌CRP、TNF-α、IL-6等多種炎性因子。其中，TNF-α由活化單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，參與啟動(dòng)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，IL-6由活化的成纖維細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生，與TNF-α協(xié)同發(fā)揮作用，介導(dǎo)并加重炎癥反應(yīng)，調(diào)控細(xì)胞增殖、分化和凋亡[14-15]。本研究結(jié)果表明，模型組大鼠血清TNF-α、IL-6、CRP等炎性因子水平高于假手術(shù)組，表明心肌缺血再灌注大鼠體內(nèi)存在持續(xù)性炎癥反應(yīng)，與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[12]一致，而羥基紅花黃色素A可降低心肌缺血再灌注大鼠體內(nèi)TNF-α、IL-6、CRP等炎性因子水平，減輕炎癥反應(yīng)。

本研究結(jié)果表明，羥基紅花黃色素A對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用，可抑制心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)，減輕心肌細(xì)胞損傷。本研究基于炎癥反應(yīng)，從NF-κB信號(hào)通路探討羥基紅花黃色素A防治心肌缺血再灌注大鼠的作用機(jī)制，有關(guān)羥基紅花黃色素A治療心肌缺血再灌注損傷大鼠的具體機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。