GC-MS法分析檸檬蒸餾酒與發(fā)酵酒揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)

文凌云，徐祥林，趙 冬，孫 卉，陳艷萍，柏羽純，何志貴*

（1.桂林旅游學(xué)院 休閑與健康學(xué)院，廣西 桂林541006；2.廣西桂林銳德檢測認(rèn)證技術(shù)有限公司，廣西 桂林541100）

檸檬（Citrus limon（L.）Burm.f.）為蕓香科柑橘屬植物，又稱檸果、洋檸檬、益母果等，不僅含有豐富的檸檬酸，而且含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，如類黃酮、維生素C、維生素A、維生素E以及Ca、Fe、Zn等多種微量元素，因而具有極高的營養(yǎng)價值和藥用價值[1]。檸檬亦被譽(yù)為保健水果，可降低膽固醇、預(yù)防高血壓、心臟病、心血管硬化、口腔潰瘍、壞血病、防止結(jié)石[2-4]。用檸檬汁釀造的檸檬酒，不僅可保留檸檬原有的特殊香味，且口感良好、營養(yǎng)豐富[3]。檸檬酒的制作與生產(chǎn)已成為檸檬加工產(chǎn)業(yè)的重要途徑[5-6]。

目前，國內(nèi)對檸檬酒的研究主要集中在其發(fā)酵工藝的優(yōu)化[1，4，7-9]、發(fā)酵菌株的篩選[5]、降酸工藝[6]和澄清工藝等方面[3]。國外研究主要集中于檸檬的揮發(fā)性成分及其生物活性[10-12]以及檸檬的功效[13]等方面。針對檸檬酒的揮發(fā)性香味物質(zhì)的研究極少，并且揮發(fā)性物質(zhì)成分及含量是檸檬酒品質(zhì)和安全的重要指標(biāo)之一[14]。

因此，本研究采用定量描述性感官評價法對檸檬發(fā)酵酒與蒸餾酒進(jìn)行感官評定，參照相關(guān)國標(biāo)方法對其主要理化指標(biāo)（總酸、還原糖、可溶性固形物含量）進(jìn)行檢測，并采用氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯(lián)用技術(shù)對其揮發(fā)性風(fēng)味成分進(jìn)行分析，以期為提高檸檬酒的品質(zhì)和安全提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品檸檬蒸餾酒和檸檬發(fā)酵酒：中國科學(xué)院廣西植物研究所植物功能物質(zhì)研究與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 主要試劑二氯甲烷（色譜純）、無水硫酸鈉、鄰苯二甲酸氫鉀、氫氧化鈉、酚酞（指示劑）、鹽酸、五水硫酸銅、酒石酸鉀鈉、亞鐵氰化鉀、乙酸鋅、冰乙酸（均為分析純）：西隴科學(xué)股份有限公司；亞甲藍(lán)（指示劑）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥99%）：成都西亞試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

WYA-2S數(shù)字阿貝折射儀：上海精密科學(xué)儀器有限公司；Agilent7890B-7000C氣相色譜質(zhì)譜儀：美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 檸檬酒感官評價

參考牛云蔚等[15-16]的方法進(jìn)行感官評價，并進(jìn)行一定改良。選取10點(diǎn)制，0～9分（0分=沒味道，9分=味道最強(qiáng)）。評價小組由10人（5男，5女，年齡在23～30歲之間）組成。評價人員根據(jù)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行培訓(xùn)，分別對檸檬蒸餾酒和發(fā)酵酒的4種感官屬性（酸、甜、苦、澀）進(jìn)行評價，每個樣品重復(fù)評價3次。

1.3.2 檸檬酒理化指標(biāo)測定

參照GB/T 12456—2008《食品中總酸的測定》中的滴定法測定總酸含量；參照GB 5009.7—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中還原糖的測定》中的直接滴定法測定還原糖含量；參照GB/T 12143—2008《飲料通用分析方法》中的折光計(jì)法測定可溶性固形物含量。以上理化指標(biāo)均重復(fù)測定3次。

1.3.3 檸檬酒揮發(fā)性成分分析

準(zhǔn)確量取100 mL樣品置于分液漏斗中，加入等量二氯甲烷，搖勻，萃取，靜置分層后，放出下層萃取液，重復(fù)萃取3次，合并3次萃取液，用無水硫酸鈉除去多余水分，采用濃縮儀濃縮至1 mL后，將其定容至5 mL，并用0.22 μm的有機(jī)濾膜過濾，采用GC-MS分析揮發(fā)性成分[17]。

氣相條件：HP-5MS彈性石英毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），進(jìn)樣口溫度250 ℃，分流比20∶1，流速1.2 mL/min，進(jìn)樣量1 μL。程序升溫：初始60 ℃維持5 min，再以5 ℃/min升至240 ℃保持30 min，后運(yùn)行260 ℃維持3 min。

質(zhì)譜條件：電子電離（electron ionization，EI）源，離子源溫度為250 ℃，電子能量為70 eV，溶劑延遲時間3.5 min，全掃描模式。

定性定量分析：使用工作站軟件NIST MS進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，運(yùn)用NIST 14譜庫與樣品色譜峰進(jìn)行比對分析，并結(jié)合保留指數(shù)（retention index，RI）進(jìn)行定性分析。采用面積歸一化法進(jìn)行定量分析，確定各揮發(fā)性物質(zhì)的相對含量。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均重復(fù)測定3次，所得結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”表示。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel和SAS 9.3統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)方差分析和差異顯著性分析，顯著性水平取P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 檸檬酒感官評價結(jié)果

感官屬性（酸、甜、苦、澀）可以較好的解釋酒的口感和味道特征。品評人員主要從酸、甜、苦、澀4個屬性對檸檬發(fā)酵酒和蒸餾酒的感官特征進(jìn)行描述，結(jié)果見表1。由表1可知，檸檬發(fā)酵酒中酸味值（5.167分）最高，甜味值（2.267分）最低，苦味值（3.733分）和澀味值（3.567分）居中。而檸檬蒸餾酒中澀味值（5.267分）最高，甜味值（2.633分）最低，苦味值（4.967分）和酸味值（4.067分）居中。兩種酒樣除澀味存在顯著差異外（P＜0.05），其他3種屬性均無顯著差異（P＞0.05）。這表明這兩種酒的口感差別主要是由澀味屬性引起的。

表1 檸檬酒感官評定結(jié)果Table 1 Results of sensory evaluation of lemon wine

2.2 檸檬酒理化指標(biāo)分析結(jié)果

對檸檬發(fā)酵酒和檸檬蒸餾酒的總酸含量、還原糖含量及可溶性固形物含量進(jìn)行測定，結(jié)果見表2。由表2可知，檸檬發(fā)酵酒中，總酸含量為6.78 mg/mL，可溶性固形物含量為6.07%，還原糖含量0.16 mg/mL，檸檬蒸餾酒中，總酸含量為0.18 mg/mL，可溶性固形物含量為19.3%，還原糖含量0.07 mg/mL。兩種酒樣在總酸含量、還原糖含量以及可溶性固形物含量具有明顯的差異性（P＜0.05）。

表2 檸檬酒的理化指標(biāo)Table 2 Physicochemical indicators of lemon wine

2.3 檸檬酒揮發(fā)性風(fēng)味化合物分析結(jié)果

2.3.1 檸檬發(fā)酵酒與蒸餾酒揮發(fā)性風(fēng)味化合物種類及相對含量的差異

由表3可知，通過GC-MS聯(lián)用技術(shù)從檸檬發(fā)酵酒中共檢測出40種揮發(fā)性化合物，其中酯類物質(zhì)種類最高，為20種；其次是醇類和酸類化合物，均為9種；醛類化合物種類最少，僅為2種。4類揮發(fā)性化合物的相對含量為酯類（53.63%）＞醇類（27.48%）＞酸類（12.93%）＞醛類（5.96%）。由表4可知，檸檬蒸餾酒中共檢出33種揮發(fā)性化合物，其中酯類物質(zhì)種類數(shù)量最多（15種），其次為醇類化合物（5種）、酸類化合物（4種）、雜環(huán)類（3種）和烷烴類（3種），烯類（2種）和醛類（1種）較少。7類揮發(fā)性化合物的相對含量為酯類（48.43%）＞烯類（27.78%）＞醇類（14.74%）＞酸類（4.19%）＞烷烴類（2.71%）＞雜環(huán)類（1.86%）＞醛類（0.29%）。兩種檸檬酒揮發(fā)性化合物中，酯類化合物的種類和相對含量均最高，醛類化合物含量均最低。

表3 檸檬發(fā)酵酒中揮發(fā)性風(fēng)味化合物組成及相對含量Table 3 Components and relative content of volatile flavor compounds in fermented lemon wine

表4 檸檬蒸餾酒中揮發(fā)性風(fēng)味化合物組成及相對含量Table 4 Components and relative content of volatile flavor compounds in distilled lemon spirit

續(xù)表

2.3.2 酯類化合物比較

兩種檸檬酒中酯類化合物的相對含量均最高。檸檬發(fā)酵酒中酯類化合物有20種（相對含量為53.63%），主要包括辛酸乙酯、琥珀酸單乙酯、α-乙酸松油酯、9-十六碳烯酸乙酯等；檸檬蒸餾酒中酯類化合物有15種（相對含量為48.43%），主要包括辛酸乙酯、癸酸乙酯、9-十六碳烯酸乙酯、月桂酸乙酯、十六酸乙酯等。兩種檸檬酒中的酯類化合物均以辛酸乙酯相對含量最高，分別為21.74%和25.14%。辛酸乙酯是具有梨子香味的揮發(fā)性化合物[18]。兩種檸檬酒的其他成分差異較大，可能是構(gòu)成二者香味差異的重要原因。

酯類化合物是酒體中最活躍的成分，是果酒整體香氣形成的重要組成部分。酯類物質(zhì)大多賦予果酒水果香氣，如辛酸乙酯、己酸乙酯、乙酸異戊酯、檸檬酸三乙酯、月桂酸乙酯、癸酸乙酯均具有類似水果香味的香氣，可使酒變得香醇清甜[18]，是檸檬發(fā)酵酒香味的重要來源。

2.3.3 醇類化合物比較

檸檬發(fā)酵酒中的醇類物質(zhì)所占比例僅次于酯類物質(zhì)，相對含量為27.48%，共檢測出9種；而檸檬蒸餾酒中醇類化合物相對含量為14.74%，共檢測出5種。醇類化合物是果酒重要的芳香組分，高級醇類物質(zhì)主要是微生物通過降解代謝途徑（Ehrlich代謝機(jī)制）和合成代謝途徑（Harris代謝機(jī)制），通過相應(yīng)α-酮酸的脫羧作用與加氫還原而實(shí)現(xiàn)的[19]。醇類化合物可使果酒香氣濃厚豐滿，同時也是形成酯類化合物的前體物質(zhì)，主要呈現(xiàn)清香和青鮮香氣[20-21]。兩種檸檬酒的醇類物質(zhì)中的對羥基苯乙醇、苯乙醇相對含量均較高，并均檢測出α-松油醇。苯乙醇是酵母菌發(fā)酵的特有產(chǎn)物，本身也具有玫瑰香氣[21]；α-松油醇有持久的紫丁香香氣，對檸檬酒香氣的形成具有積極作用[23]。其他醇類化合物，除了異蒲勒醇具有樟腦和薄荷香氣外，其余均無明顯的香氣，但它們也是構(gòu)成檸檬酒的重要組成成分。

2.3.4 酸類化合物比較

酸類化合物主要是有機(jī)酸，其含量的高低對果酒的感官品質(zhì)有較大影響[24]。檸檬發(fā)酵酒中共檢測到酸類化合物9種，相對含量為12.93%，主要包括4-酮庚乙酸、肉豆蔻酸、（S）-（+）-檸蘋酸、L-蘋果酸、4-羥基苯基-甘氨酸、油酸、丁酸、7-辛烯酸、對羥基肉桂酸。檸檬蒸餾酒中共檢測到酸類化合物4種，相對含量為4.19%，主要包括正癸酸、肉豆蔻酸、月桂酸、纈草酸。雖然酸類化合物的呈香貢獻(xiàn)較小，但可以協(xié)調(diào)果酒的口感等作用[25]。

2.3.5 其他類化合物比較

檸檬發(fā)酵酒和蒸餾酒中醛類物質(zhì)相對含量分別為5.96%、0.29%，相對含量均最低。檸檬發(fā)酵酒中檢測到的醛類化合物主要是丙醛二乙基乙縮醛和3-乙氧基-4-丙氧基苯甲醛；檸檬蒸餾酒中檢測到的醛類化合物是對甲基苯甲醛。雖然揮發(fā)性醛類化合物在檸檬酒中的含量有限，但是也對其香氣特征做出了重要的貢獻(xiàn)[26]。此外，在檸檬蒸餾酒中檢測到烷烴類、烯類和雜環(huán)類物質(zhì)。其中烷烴類物質(zhì)包括1,1,2,2-四氯乙烷、2,2-二甲基辛烷、2,6,11-三甲基十二烷；烯類物質(zhì)包括D-檸檬烯、β-石竹烯和3-甲基-6-（1-甲基乙亞基）環(huán)己烯；雜環(huán)類物質(zhì)包括1-（7-氧雜雙環(huán)[4.1.0]庚-1-基）乙酮和3,2',4'-三羥基-4-甲氧基查耳酮。烯類物質(zhì)在檸檬蒸餾酒中的相對含量僅次于酯類物質(zhì)，其中D-檸檬烯相對含量為22.15%。D-檸檬烯又稱苧烯，是一種環(huán)狀單萜烯，具有較強(qiáng)的令人愉悅的檸檬樣香氣但留香時間很短。

3 結(jié)論

通過定量描述性感官評價法對檸檬發(fā)酵酒和蒸餾酒進(jìn)行感官評定發(fā)現(xiàn)，2種檸檬酒樣除澀味存在顯著差異外（P＜0.05），其他3種屬性均無顯著差異（P＞0.05），均以苦、澀、酸味為主，甜味評分最低。通過理化指標(biāo)檢測發(fā)現(xiàn)，2種檸檬酒的總酸、還原糖和可溶性固形物含量都具有顯著性差異（P＜0.05）。采用GC-MS技術(shù)對其揮發(fā)性物質(zhì)組分分析發(fā)現(xiàn)，從檸檬發(fā)酵酒與蒸餾酒中分別檢測出40種、33種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，且均以酯類物質(zhì)種類（20種、15種）及相對含量（53.63%、48.43%）最高，與檸檬發(fā)酵酒相比，除檢測到酯類、醇類、酸類、醛類物質(zhì)外，檸檬蒸餾酒中還檢測到烷烴類、雜環(huán)類及烯類物質(zhì)。