麥芽炒制過程中消化酶活力的研究*

賀 倩，劉 翠，李新欣，周 霞

（西南交通大學(xué) 生命科與工程學(xué)院，四川 成都 610031）

消化酶是將食物消化分解為利于人體吸收的小分子物質(zhì)[1]，即存在于人體消化道中，又是許多藥物的重要組成成分，本質(zhì)上是一種蛋白質(zhì)，故具有蛋白質(zhì)的各種性質(zhì)，如其生理活性受溫度、pH值等環(huán)境因素的影響；而存在于藥物中的消化酶活性還與加工過程，如炮制時(shí)間、炮制方法等密切相關(guān)。

麥芽性甘、味平，為禾本科植物大麥HordeumvulgareL.的成熟果實(shí)經(jīng)發(fā)芽干燥的炮制加工品[2]，臨床常用的消食藥之一。酶類、糖類為麥芽主要活性成分，具有活血化瘀、行水消腫等藥理作用[3]，然而目前對于麥芽功效研究絕大部分聚焦于消食方面。因此，本研究選取蛋白酶及淀粉酶為指標(biāo)，旨在通過測定麥芽炒制過程，不同時(shí)間淀粉酶與蛋白酶活力的變化規(guī)律，為麥芽炒制消食的機(jī)理研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與設(shè)備

麥芽飲片（安徽181110北京同仁堂四川有限責(zé)任公司）；麥芽糖對照品（純度≥98%貴州迪大生物科技有限公司）；酪蛋白（AR成都科龍化工試劑有限公司）；福林試液（AR上海荔達(dá)生物科技有限公司）；酪氨酸對照品（純度≥99.0%上海慧興生化試劑有限公司）；其余試劑均為分析純。

PWC-124電子分析天平（艾德姆衡器（武漢）有限公司，max=120g，d=0.0001g）；GM900 非接觸式紅外測溫槍（深圳市聚茂源科技有限公司）；LX-02利祥多功能粉碎機(jī)（上海江信科技有限公司）；TGL-16G高速臺式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；DK-98-II電熱恒溫水浴鍋（天津泰斯特儀器有限公司）；SB-25-12D超聲波清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）；DHG-9030A電熱恒溫恒溫干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；752N紫外可見分光光度計(jì)（上海佑科儀器儀表有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 樣品制備

炒鍋預(yù)熱，依《中國藥典》2015版四部清炒法（通則 0213），于 380～450℃[4]清炒麥芽，從 0 開始，依次間隔2min取樣，共7次，編號M0-M6，冷卻后粉碎，過60目篩，備用。

1.2.2 淀粉酶活力測定[5]

1.2.2.1 淀粉酶提取液的制備 于各研缽中稱取編號M0-M6的麥芽樣品1g，加入10mL蒸餾水，研磨均勻后轉(zhuǎn)移至離心管，于25℃下靜置20min，間隔數(shù)分鐘振搖1次，再以5000r·min-1條件離心30min后，收集上清液，轉(zhuǎn)至編號為MT0-MT6的25mL量瓶，加蒸餾水定容，搖勻，即得。

1.2.2.2 DNS試劑的配制 于盛有25mL蒸餾水的燒杯中溶解酒石酸鉀鈉9.1g，水浴至微熱后逐次加入3,5-二硝基水楊酸0.32g、NaOH 1.0g、苯酚0.25g，攪拌至全，轉(zhuǎn)至50mL棕色容量瓶中，冷卻后定容，于室溫暗處保存。

1.2.2.3 淀粉溶液的配制 稱取可溶性淀粉1.0g，加至盛有50mL蒸餾水的燒杯中加熱至完全溶解，待冷卻后轉(zhuǎn)入容量瓶，用蒸餾水定容至100mL，室溫保存。

1.2.2.4 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線 稱取0.1g麥芽糖對照品溶于100mL蒸餾水中，配制得1mg·mL-1麥芽糖對照液。取20mL具塞刻度試管7支并編號1～7，于試管中加入麥芽糖對照液 0，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4mL，配置成具有濃度梯度的溶液，混勻。將2mL DNS試劑加入各試管中，并以水浴加熱至沸騰5min，冷卻后定容至15mL。空白對照為1號試管，在波長540nm處，以比色管測吸光度，將麥芽糖濃度和吸光度進(jìn)行線性分析，得回歸方程A=10.727C-0.0122，r=0.9996，且麥芽糖濃度在 0.025～0.122 mg·mL-1內(nèi)與吸光度線性相關(guān)。

1.2.2.5 樣品淀粉酶活力的測定 7支20mL具塞玻璃試管中各加入淀粉酶提取液1mL，并編號MC0-MC6。將各試管和“2.2.3”項(xiàng)下配制的淀粉溶液于40℃水浴10min，并加入1mL淀粉溶液于各試管中于40℃水浴5min，取出后，將2mL DNS試劑加入其中，混勻后煮至沸騰5min，冷卻后以蒸餾水定容，即得。另取7支試管作空白對照，編號KF0-KF6，將1mL淀粉溶液換成蒸餾水，其余操作同上,于540nm波長處檢測，共3次。取樣品3次吸光度平均值，計(jì)算出與相應(yīng)空白對照的吸光度之差，麥芽糖含量可在前述的標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得，淀粉酶活性以單位重量麥芽樣品每分鐘在酶催化下產(chǎn)生的麥芽糖的質(zhì)量表示，即 mg·（min·g）-1。

1.2.2.6 精密度試驗(yàn) 取0.054mg·mL-1的麥芽糖溶液為標(biāo)準(zhǔn)液，多次測定并記錄吸光度，計(jì)算其RSD值為0.147%（n=6），說明該儀器精密度較好。

1.2.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取編號M0麥芽樣品1.00g于20mL試管中，按“1.2.2.5”項(xiàng)下依法進(jìn)行顯色處理，在放置 0、1、2、3、4h 后測其吸光度，結(jié)果表明，其在4h內(nèi)穩(wěn)定，RSD值為1.05%（n=5），樣品穩(wěn)定性高。

1.2.2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 以“1.2.2.5”的操作方法，對編號M0的1.00g樣品進(jìn)行顯色處理，測吸光度并計(jì)算。結(jié)果得出RDS=0.75%（n=6），表示此實(shí)驗(yàn)具有高重復(fù)性。

1.2.2.9 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取6份未經(jīng)炮制的麥芽樣品0.5g，將7.50mg麥芽糖對照品加入其中，其余過程同“1.2.2.5”，測吸光度，并將其代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算含量。計(jì)算出平均加樣回收率為98.67%，RSD=0.98%，結(jié)果證明該實(shí)驗(yàn)方案的準(zhǔn)確度良好。

1.2.3 蛋白酶活力測定[6,7]

1.2.3.1 蛋白酶提取液制備 分別稱取編號M0～M6麥芽1g，加20mL蒸餾水，于40℃水浴加熱1h，間斷攪拌，濾過，以PBS緩沖液將濾液稀釋1倍，即得蛋白酶提取液，編號MX0～MX6用于測定蛋白酶活性。

1.2.3.2 磷酸鹽緩沖液（pH值6.8）的配制 將118mL 0.2mol·L-1NaOH，250mL 0.2mol·L-1KH2PO4溶液與燒杯中攪拌均勻，再轉(zhuǎn)移至1000mL容量瓶，以蒸餾水稀釋定容，即得。

1.2.3.3 福林酚試液的配制 將等體積4%Na2CO3溶液與0.2mol·L-1NaOH溶液混勻得福林酚試液 A（即甲液）；乙液是將等體積0.04mol·L-1CuSO4溶液與2%酒石酸鈉溶液混勻，甲液∶乙液為50∶1，用時(shí)混合均勻，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2.3.4 三氯醋酸溶液的配制 取6.5g三氯醋酸于燒杯中用少量蒸餾水溶解，后轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶，定容即得。

1.2.3.5 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線 稱取干燥的酪氨酸0.1g于1000mL容量瓶中，加入少量鹽酸使其完全溶解，以蒸餾水定容，配得0.1g·L-1酪氨酸溶液。于6只10mL容量瓶中各加入 0.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0mL 酪氨酸溶液，加蒸餾水至刻度。另取具塞玻璃試管6支，編 號 T1～T6， 分 別 加 入 濃 度 0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0μg·mL-1酪氨酸溶液 1mL，再將 0.4mol·L-1Na2CO35mL，福林酚試液1mL，蒸餾水2mL加入其中，振搖均勻，于40℃水浴20min。于680nm波長處測定。以酪氨酸濃度和吸光度進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：A=0.0685C+0.0103，r=0.9997, 線性范圍2.156～10.886μg·mL-1。

1.2.3.6 樣品蛋白酶活力的測定 離心管中加“1.2.3.1”項(xiàng)下配制的蛋白酶提取液1mL，將其同酪蛋白一起水浴加熱5min后，于離心管加入1mL酪蛋白，保溫 10min，以加入 2mL 0.4mol·L-1三氯醋酸來終止反應(yīng)。于40℃水浴保溫持續(xù)20min后離心，將剩余蛋白質(zhì)過濾后得濾液，于試管依次添加1mL濾液，2mL 蒸餾水，1mL 福林試液，5mL 0.4mol·L-1Na2CO3，搖勻，40℃水浴加熱20min。另取1只離心管作為空白對照，編號L0，取1mL蒸餾水加至離心管，依次加入三氯醋酸2mL和酪蛋白，其余同前。按“1.2.3.5”項(xiàng)下方法，于680nm波長處測定3次。以樣品吸光度平均值與L0號離心管的吸光度做差，計(jì)算出的結(jié)果代入“1.2.3.5”項(xiàng)下求得的標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而計(jì)算出酪氨酸質(zhì)量。蛋白酶活力為40℃時(shí)，單位質(zhì)量麥芽樣品在酶的作用下于單位時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生的酪氨酸含量，即 μg·（min·g）-1。

1.2.3.7 精密度試驗(yàn) 取6份濃度為5.229μg·mL-1的酪氨酸溶液為對照品，測定其吸光度并記錄，求得RSD值為0.285%，可見實(shí)驗(yàn)儀器精密度符合要求。

1.2.3.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取編號M5的麥芽樣品1.00g，顯色過程同“2.3.6”，于4h內(nèi)每隔1h測定5次吸光度，代入前述求得的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行計(jì)算，得RSD=0.81%，顯示樣品穩(wěn)定性達(dá)標(biāo)。

1.2.3.9 重復(fù)性試驗(yàn) 取6份炮制8min的麥芽樣品（每份1.00g），每份樣品皆由“1.2.3.6”項(xiàng)下的操作方法顯色，在680nm處測吸光度。以標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算并求出RDS為1.08%，表明重復(fù)性良好。

1.2.3.10 加樣回收試驗(yàn) 精密稱取6份編號M5的樣品（每份0.5g），于試管中加入2.00g酪氨酸對照品，按“2.3.7”項(xiàng)的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行顯色操作，在最佳波長處測吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線算含量。求得其平均回收率為98.12%，（RSD=1.02%），表示本實(shí)驗(yàn)方案的準(zhǔn)確度符合要求。

2 結(jié)果與分析

2.1 淀粉酶活力的變化

采用DNS比色法測定淀粉酶活力，并規(guī)定在40℃下每分鐘淀粉酶催化分解淀粉生成1mg麥芽糖的酶量為一個(gè)活力單位（U），即 U=C×20mL×N/5min=C×100（式中N為稀釋倍數(shù)，N=25）。以炒制時(shí)間和淀粉酶活力為坐標(biāo)軸作圖。見表1，圖1。

表1 麥芽淀粉酶活力（n=3）Tab.1 Amylase activity of malt（n=3）

圖1 麥芽淀粉酶活力Fig.1 Amylase activity of malt

結(jié)果顯示，麥芽炒制過程中，淀粉酶活力變化趨勢為，先小幅上升后大幅下降。其中，在炒制2min時(shí)其增加達(dá)到峰值，之后持續(xù)下降，6min時(shí)的活力降到生麥芽以下，并在8～12min趨于平緩。0～2min出現(xiàn)上升可能是因?yàn)榧訜釙r(shí)間短，麥芽內(nèi)部溫度輕微上升，使淀粉酶活力上升；2min之后大幅度下降是因?yàn)殡S著炒制時(shí)間的延長，麥芽內(nèi)部溫度增幅變大，淀粉酶開始失活。

2.2 蛋白酶活力的變化

蛋白酶活力的測定采用福林酚試劑法，根據(jù)規(guī)定，酶活力單位（U）是40℃下，酪蛋白在蛋白酶催化下每分鐘分解為單位酪氨酸的酶量。即U=C×9mL×160/10min=C×144。以炒制時(shí)間和蛋白酶活力為坐標(biāo)軸作圖。見表2，圖2。

表2 麥芽蛋白酶活力Tab.2 Protease activity of malt

圖2 麥芽蛋白酶活力Fig.2 Protease activity of malt

圖2 表明，麥芽炒制過程中，同淀粉酶活力一樣，蛋白酶活力呈現(xiàn)出與其類似趨勢，即先上升后下降，且幅度較之更小。其中，達(dá)峰值時(shí)間為2min，活力降至生麥芽以下為4min時(shí)。0～2min出現(xiàn)上升可能是因?yàn)榧訜釙r(shí)間短，麥芽內(nèi)部溫度輕微上升，使蛋白酶活力上升；2min之后大幅度下降是因?yàn)殡S著炒制時(shí)間的延長，麥芽內(nèi)部溫度增幅變大，蛋白酶開始失活。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨炮制時(shí)間延長，淀粉酶與蛋白酶活力均降至生麥芽之下，而臨床用作消食主要以焦麥芽，炒麥芽為主。表明麥芽中除了淀粉酶與蛋白酶，可能還有其他有助于消食和胃的成分，其炒制后消食作用機(jī)理需待進(jìn)一步研究。

3 討論

3.1 評價(jià)指標(biāo)的選擇

麥芽主治消化不良，脾虛食少等癥[2]，朱建龍[8]研究發(fā)現(xiàn)不同麥芽炮制品對消化酶，消化液的分泌有不同程度的促進(jìn)作用。麥芽中與消食相關(guān)的成分包括淀粉酶、蛋白酶、轉(zhuǎn)化糖酶及乳酸等，而上述成分中，蛋白酶和淀粉酶能分別水解蛋白質(zhì)和淀粉，與人體食物消化吸收最為密切。因此，淀粉酶與蛋白酶活力為本實(shí)驗(yàn)的評價(jià)指標(biāo)，研究麥芽中該兩種消化酶在不同炒制時(shí)間下的影響。

3.2 美拉德反應(yīng)

美拉德反應(yīng)是一種非酶褐變反應(yīng)，5-羥基糠醛為其標(biāo)志中間性產(chǎn)物，在中藥炮制過程中，可通過還原糖與氨基化合物縮聚而成[9]。麥芽糖為含有游離醛基的二糖，是典型的還原糖；而麥芽中存在的消化酶、蛋白質(zhì)、氨基酸等均含有大量游離氨基，可作為氨基供體與麥芽糖反應(yīng)。研究顯示[6,10]，麥芽在炒制過程中5-HMF的含量逐漸增加，表明麥芽炮制過程中確實(shí)存在美拉德反應(yīng)，并能產(chǎn)生焦香，健脾消化。故推測麥芽炮制后消食導(dǎo)滯作用增強(qiáng)可能與美拉德反應(yīng)中產(chǎn)生的一些中間性產(chǎn)物作用有關(guān)。

3.3 腸道菌群

腸道菌群為人體腸道內(nèi)寄居的所有微生物，種類繁多，其能通過分泌腸道酶參與食物中蛋白質(zhì)、纖維素等物質(zhì)的代謝，對于體內(nèi)食物消化吸收發(fā)揮重要作用。腸道菌群失調(diào)則引起體內(nèi)食物分解受阻，導(dǎo)致消化不良。腸道菌群的生長需要益生菌作為底物，鄭紅斌等[11,12]研究發(fā)現(xiàn)麥芽中麥芽纖維是益生菌的一種，可以改善潰瘍性結(jié)腸炎小鼠腸道菌群失調(diào)狀態(tài)。Araki Y[13]等人實(shí)驗(yàn)表明麥芽纖維中物質(zhì)能改善腸道環(huán)境，對于胃腸道疾病有良好的治療作用。因此，推測麥芽纖維可以直接促進(jìn)腸胃蠕動(dòng)或者通過調(diào)控腸道菌群來起到消化積食之功效。