自體腹膜移植回腸漿肌擴(kuò)大原位膀胱的重建

沈 俊，宋志強(qiáng)，沈海山，李春峰，阮英卯，李勝文

1貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院泌尿外科，貴陽(yáng) 550004 2清華大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科，北京 100016 3清華大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科，北京 100016

腸管是用于膀胱重建的主要組織材料，廣泛應(yīng)用于臨床上。由于腸黏膜具有分泌和吸收功能，尿液與腸黏膜慢性相互作用，使得腸代膀胱術(shù)后仍然存在不同程度諸多并發(fā)癥，比如代謝紊亂、腸黏液增多堵塞尿道及惡性腫瘤形成或復(fù)發(fā)等。為探求一種理想的腸代膀胱重建的方法，以減少腸代膀胱術(shù)后的并發(fā)癥，本研究采用腹膜取代腸黏膜建立了自體腹膜移植回腸重建膀胱的小型豬實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，并?duì)其進(jìn)行形態(tài)學(xué)、動(dòng)力學(xué)和病理組織學(xué)等方面的研究。

材料和方法

材料采用封閉飼養(yǎng)的成年(6～8個(gè)月)實(shí)驗(yàn)用小型豬6只，雌性，體重28～33 kg(由貴州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，購(gòu)于北京市琉璃河科興實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖中心。又名：中華小型豬，北科源實(shí)驗(yàn)用小型豬。產(chǎn)地：北京房山。種系來源：貴州小型豬)。CAT307尿流率膀胱測(cè)壓管(Medical Technologies Canada ULC)，AQUARIUSXLT尿動(dòng)力檢查儀(加拿大Laborie公司)，PLX5200可移動(dòng)X光機(jī)(南京普朗醫(yī)療設(shè)備有限公司)，JSM5510掃描電子顯微鏡(日本)，TEM1010/JEM1010透射電子顯微鏡(日本)。一抗鈣網(wǎng)膜蛋白、抗波形絲蛋白、CK7和UPK3鼠抗人單克隆抗體，二抗(抗兔和鼠IgG)及S-P試劑盒均為美國(guó)Jackson公司產(chǎn)品，購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。DAB酶底物顯色試劑盒由清華大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科提供(購(gòu)自中國(guó)五聯(lián)化工廠，上海)。MASSON特染試劑盒：北京阜外醫(yī)院病理科提供。

方法術(shù)前準(zhǔn)備：術(shù)前24 h禁食，10 h禁飲；麻醉后備皮；同時(shí)建立耳背靜脈通道，輸液(生理鹽水100 ml+頭孢呋新0.75 g，術(shù)前/后各用1次，5%葡萄糖注射液500 ml)；手術(shù)方法：長(zhǎng)段回腸漿肌剝離術(shù)(約35 cm)+大面積自體腹膜移植術(shù)[約(15×10)cm2]+膀胱次全切除術(shù)+原位膀胱擴(kuò)大重建術(shù)；術(shù)后12周處死動(dòng)物之前，采集血、尿樣與術(shù)前采樣進(jìn)行對(duì)比分析研究，行尿流動(dòng)力學(xué)及膀胱造影檢查，處死動(dòng)物后取出膀胱標(biāo)本進(jìn)行常規(guī)、分子病理學(xué)檢測(cè)、MASSON三色特染以及電鏡觀察。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理兩組間樣本計(jì)量資料比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Stata- 13.0數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一般情況6只實(shí)驗(yàn)用小型豬手術(shù)順利完成，無一只動(dòng)物死亡。手術(shù)切口未出現(xiàn)明顯感染跡象，觀察飼養(yǎng)期間無需拆線，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物術(shù)后均未見腸梗阻、尿瘺、腹膜炎等并發(fā)癥發(fā)生。術(shù)后第5天拔除雙側(cè)輸尿管導(dǎo)管，第7天拔除氣囊尿管，觀察動(dòng)物排尿情況，發(fā)現(xiàn)祛除尿管后，動(dòng)物均出現(xiàn)尿頻，每0.5～1.0小時(shí)約1次，3 d后逐漸有所緩解，從肉眼觀察尿液黃清。

尿常規(guī)及尿沉渣測(cè)定結(jié)果手術(shù)后12周測(cè)定實(shí)驗(yàn)用小型豬的尿常規(guī)顯示其中的白細(xì)胞、尿比重與手術(shù)前尿常規(guī)結(jié)果比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)(表1)。直視下穿刺膀胱收集尿液，將之混勻后吸取10 ml置入離心管，通過離心機(jī)旋轉(zhuǎn)沉降分層(3000轉(zhuǎn)/min，轉(zhuǎn)子半徑5 cm，離心15 min)，棄掉上清液，電子天平稱重，減去離心管的質(zhì)量得到尿沉渣的質(zhì)量，再與術(shù)前進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果顯示術(shù)前與術(shù)后尿沉渣質(zhì)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，術(shù)后新膀胱無腸黏液分泌，也無結(jié)晶形成。

表1 術(shù)前與術(shù)后12周動(dòng)物尿白細(xì)胞及尿比重比較

電解質(zhì)、血清肌酐和尿素氮水平與手術(shù)前比較，手術(shù)后12周電解質(zhì)、血清肌酐和尿素氨水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)(表2)。

表2 術(shù)前與術(shù)后12周豬電解質(zhì)、血清肌酐和尿素氮水平比較

手術(shù)前后動(dòng)物膀胱造影經(jīng)尿管注入200 ml碘海醇生理鹽水稀釋液(1∶1)，拔除尿管，經(jīng)陰道置入F26金屬尿道探子(對(duì)比尿道長(zhǎng)度)，見正常膀胱充盈形態(tài)圓潤(rùn)光滑，尿道長(zhǎng)約12 cm(距恥骨聯(lián)合下方，尿道開口于陰道內(nèi))；術(shù)后12周新膀胱充盈形態(tài)稍小，略顯僵硬，頂部靠近前腹壁，可能與腸系膜牽拉有關(guān)，未見造影劑滲漏(圖1)。

圖1 手術(shù)前(A)與手術(shù)后12周(B)豬膀胱造影比較

手術(shù)前后動(dòng)物膀胱壓力容積術(shù)前動(dòng)物膀胱容量平均為(587.17±22.31) ml，術(shù)后新膀胱平均容量(369.50±17.56)ml，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.038)，但膀胱順應(yīng)性卻很接近(術(shù)前15.69±2.13比術(shù)后14.31±1.35，P=0.7173)(表3)。

表3 手術(shù)前與手術(shù)后12周豬膀胱壓力容積測(cè)定比較

病理顯微組織觀察結(jié)果術(shù)后12周分別麻醉處死6只動(dòng)物，切除重建的新膀胱標(biāo)本送檢，結(jié)果顯示HE染色后膀胱腔面表層上皮完整、連續(xù)，細(xì)胞層次排列有序，5～7層，與正常膀胱移行上皮類似，未見絨毛柱狀上皮細(xì)胞及杯狀細(xì)胞再生，黏膜下肌層結(jié)構(gòu)清晰，可見新生毛細(xì)血管，未見明顯中性粒細(xì)胞聚集；免疫組織化學(xué)反應(yīng)顯示未見自體移植腹膜；抗波形絲蛋白陰性表達(dá)，鈣網(wǎng)膜蛋白陰性表達(dá)；而存活良好漿肌腸段上覆蓋著5～7層膀胱尿路移行上皮細(xì)胞；上皮類特異抗體CK7染色強(qiáng)陽(yáng)性，尿路移行上皮特異性抗體UPK3染色強(qiáng)陽(yáng)性，上皮與肌層之間未見回腸黏膜上皮細(xì)胞與杯狀細(xì)胞殘留。MASSON染色顯示平滑肌層結(jié)構(gòu)清晰，腔面表層黏膜細(xì)胞呈復(fù)層移行上皮細(xì)胞，排列有序，連續(xù)性好，無斷裂及錯(cuò)位，未見柱狀或杯狀細(xì)胞，肌層間未見明顯膠原纖維增生(藍(lán)綠色淡染)，黏膜下可見毛細(xì)血管增生較明顯(圖2)。

電鏡超微結(jié)構(gòu)掃描電鏡結(jié)果顯示正常膀胱黏膜上皮細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，邊角圓潤(rùn)，細(xì)胞之間縫隙很小，排列致密(圖3A)。術(shù)后12周新膀胱黏膜上皮整體結(jié)構(gòu)完整，橢圓形的黏膜細(xì)胞，邊角較圓鈍，細(xì)胞個(gè)體之間的連接縫隙變小，排列整齊、疏松(圖3B)。透射電鏡觀察顯示，正?；啬c平滑肌細(xì)胞呈梭形，細(xì)胞與細(xì)胞之間連接緊密，排列整齊，界限清楚，位于細(xì)胞中央的細(xì)胞核類似梭形，形態(tài)正常，點(diǎn)狀致密斑清晰可見，基底膜完整，間質(zhì)內(nèi)僅見少許纖維細(xì)絲(圖3C)。術(shù)后12周新膀胱肌纖維細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)顯示，平滑肌細(xì)胞呈梭形，排列整齊，未見明顯肥大，基底膜和致密斑清晰可見，細(xì)胞漿成分無脫落，境界清，線粒體形態(tài)未見異常，無聚集，無腫脹，間質(zhì)纖維絲無明顯增生(圖3D)。

A.新膀胱黏膜上皮覆蓋完整(箭頭)(HE染色，×40)；B.黏膜及黏膜下抗波形絲蛋白陰性表達(dá)(免疫組織化學(xué)，×100)；C.黏膜及黏膜下鈣網(wǎng)膜蛋白陰性表達(dá)(免疫組織化學(xué)，×100)；D.CK7在新膀胱黏膜全層細(xì)胞強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)(免疫組織化學(xué)，×200)；E.UPK3在新膀胱黏膜表層細(xì)胞強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)(免疫組織化學(xué)，×100)；F.MASSON染色，黏膜下有毛細(xì)血管增生(箭頭)(免疫組織化學(xué)，×40)

A.正常膀胱黏膜掃描電鏡表現(xiàn)；B.術(shù)后12周新膀胱黏膜掃描電鏡表現(xiàn)；C.正?；啬c平滑肌細(xì)胞透射電鏡表現(xiàn)；D.術(shù)后12周新膀胱平滑肌細(xì)胞透射電鏡表現(xiàn)

討 論

盡管原位腸代膀胱手術(shù)技巧日臻完善，但用來修復(fù)重建新膀胱的腸管本質(zhì)未變，因而手術(shù)后與其相關(guān)的分泌及吸收所致并發(fā)癥仍然困擾著臨床醫(yī)生與患者，盡管也有許多學(xué)者曾經(jīng)想到破壞腸黏膜的方法，比如：用化學(xué)方法(酶/無水乙醇)破壞黏膜，或用機(jī)械方法刮除黏膜，以期減少腸黏膜的吸收與分泌，但效果均不盡如人意[1- 3]。相對(duì)于傳統(tǒng)方式，本研究采用從腔外完整剝離回腸黏膜及黏膜下層，并用自體腹膜移植覆蓋于回腸漿肌層制作成腹膜-回腸漿肌游離復(fù)合瓣修復(fù)擴(kuò)大膀胱的方法，既可祛除術(shù)后相關(guān)并發(fā)癥，又可保護(hù)剝離創(chuàng)面肌層免受尿液侵蝕與刺激，同時(shí)，重建新膀胱的形態(tài)及功能與變化差異不大。經(jīng)同種動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究顯示，采用異體膀胱黏膜修復(fù)膀胱時(shí)，術(shù)后7周之內(nèi)，移植黏膜存活良好，8周以后，移植物完全被自體膀胱黏膜替代[4]。同樣，有學(xué)者在利用游離腹膜管重建長(zhǎng)段黏膜剝脫輸尿管的犬實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)，術(shù)后10周該腹膜組織被完整成熟的移行上皮替代[5]。因此，為安全起見，本研究選擇術(shù)后12周作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)及標(biāo)本取出時(shí)間，病理及電鏡觀察結(jié)果顯示術(shù)后12周新膀胱內(nèi)移植腹膜消失(腹膜特異性抗體鈣網(wǎng)膜蛋白和抗波形絲蛋白均陰性表達(dá))，被成熟的尿路移行上皮細(xì)胞完全爬行替代(尿路上皮特異性抗體UPK3與上皮類特異性抗體CK7均強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá))，掃描電鏡也清晰看到表面覆蓋的是幾乎完全成熟的尿路移行上皮細(xì)胞。

臨床上，對(duì)于原位可控回腸膀胱術(shù)后功能檢測(cè)方面，不同的手術(shù)方式對(duì)術(shù)后新膀胱儲(chǔ)尿功能的影響也不同。Tanaka等[6]在Studer 原位回腸新膀胱術(shù)后3個(gè)月～2年分別行尿流動(dòng)力學(xué)檢測(cè)顯示，新膀胱容量約為(439±185)ml。Sevin等[7]在W形原位回腸新膀胱術(shù)后行尿流動(dòng)力學(xué)檢測(cè)顯示，新膀胱容量約為(550±200)ml，最大膀胱壓約為(26.4±15.0)cmH2O。Steven和Poulsen[8]在Kock原位回腸新膀胱術(shù)后行尿流動(dòng)力學(xué)檢測(cè)顯示，新膀胱的最大膀胱壓和容積相當(dāng)穩(wěn)定，術(shù)后6個(gè)月，新膀胱容量約為(456±255)ml，最大膀胱壓約為(47±40)cmH2O；術(shù)后5年新膀胱容量約為(411±290)ml，最大膀胱壓約為(50±30)cmH2O。本研究在術(shù)前對(duì)正常實(shí)驗(yàn)用小型豬進(jìn)行膀胱壓力容積測(cè)定，平均容量為587 ml，最大膀胱壓為34～41 cmH2O，平均為37.5 cmH2O，順應(yīng)性平均為15.69，這與正常成人測(cè)定值相差不大。本研究采用的是半U(xiǎn)形與膀胱三角區(qū)和膀胱頸吻合重建原位新膀胱，術(shù)后12周進(jìn)行膀胱壓力容積測(cè)定，平均容量為369.5 ml，最大膀胱壓為21～29 cmH2O，平均為25.5 cmH2O，順應(yīng)性平均為14.31。術(shù)后動(dòng)物膀胱的順應(yīng)性與術(shù)前相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，表明術(shù)后膀胱功能恢復(fù)較好，結(jié)合術(shù)后早期剛拔除尿管時(shí)明顯尿頻(1次/0.5～1 h)到術(shù)后12周排尿狀況逐漸恢復(fù)，表明膀胱術(shù)后功能的恢復(fù)需要一個(gè)過程，其長(zhǎng)短取決于腹膜覆蓋回腸漿肌存活的時(shí)間以及被尿路移行上皮取代的快慢。只要覆蓋腹膜存活，其下方肌層會(huì)自然舒展，恢復(fù)其延展性。本研究顯示MASSON特染無明顯的膠原纖維增生，透射電鏡未觀察到平滑肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)形態(tài)明顯變化，纖維絲無增生，而且術(shù)后12周的膀胱造影顯示新膀胱形態(tài)雖然較正常的膀胱偏小，但是和術(shù)中40 ml氣囊的支撐容量相比明顯恢復(fù)，尿流動(dòng)力學(xué)檢測(cè)結(jié)果更進(jìn)一步證實(shí)移植腹膜對(duì)回腸平滑肌的保護(hù)作用，新膀胱的順應(yīng)性與正常膀胱相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。這和國(guó)外Coleman等[4]與國(guó)內(nèi)鄒建華等[9]的研究結(jié)果一致。另外，術(shù)后的膀胱容量沒有術(shù)前大是否跟術(shù)中取材偏少有關(guān)？膀胱壓也較術(shù)前小，這是否和回腸肌層薄弱有關(guān)？這些還需要術(shù)后更長(zhǎng)時(shí)間的觀察比較才能明確。此時(shí)可以肯定的是新膀胱無纖維化攣縮變形，表明移植腹膜早期對(duì)新膀胱肌層覆蓋保護(hù)有效。病理結(jié)果顯示，術(shù)后12周對(duì)于一個(gè)擴(kuò)大重建新膀胱來說，尿路移行細(xì)胞可以完全覆蓋整個(gè)新膀胱腔面，移植腹膜完全被吸收消失，從而形成了一個(gè)具備完整移行上皮的真正代膀胱。根據(jù)尿流動(dòng)力學(xué)檢測(cè)結(jié)果，本研究動(dòng)物術(shù)后的膀胱壓力容積測(cè)定值都在其術(shù)前測(cè)定正常范圍內(nèi)，不僅可以對(duì)原位新膀胱做個(gè)參考，還可以為以后深入研究及其對(duì)照實(shí)驗(yàn)做好鋪墊。

本研究設(shè)計(jì)擴(kuò)大重建原位新膀胱的功能除了能夠貯尿和排尿之外，還體現(xiàn)在能克服原來腸代膀胱所不能解決的與腸黏膜分泌和吸收相關(guān)的并發(fā)癥。在臨床上，根據(jù)患者滲透壓、腎功能、所截取腸段的部位、腸段長(zhǎng)度等決定了水電解質(zhì)紊亂的嚴(yán)重程度和類型[10]。高血氨癥、低鉀、低鈣等多見于回腸代膀胱，在各腸段中又以高氯性酸中毒最多見，常有超過2/3以上的發(fā)生率[11]。代謝性酸中毒在結(jié)腸代膀胱的發(fā)生率為10%～15%[12]。而上述這些與吸收相關(guān)的電解質(zhì)代謝紊亂并發(fā)癥在本研究設(shè)計(jì)重建的新膀胱里未發(fā)現(xiàn)，根據(jù)術(shù)后12周生化結(jié)果顯示與術(shù)前正常動(dòng)物相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，表明新膀胱在祛除回腸黏膜及黏膜下層之后，在腹膜的覆蓋保護(hù)下沒有吸收功能；有學(xué)者研究顯示腸代膀胱術(shù)后腫瘤發(fā)病率接近2%，結(jié)腸癌在一般人群中的發(fā)病率較低，在腸代膀胱術(shù)后，發(fā)生癌的概率可以提升100～500倍。如果年齡小于25歲經(jīng)歷尿流改道的患者，癌癥發(fā)生率甚至可高達(dá)7000倍[13]。腫瘤具體位置多見于吻合部或鄰近的腸上皮，即移行上皮與腸上皮交界處。對(duì)于這些腫瘤的發(fā)生機(jī)制，在醫(yī)學(xué)界還沒有統(tǒng)一的認(rèn)識(shí)，但多數(shù)人普遍認(rèn)為，腸上皮與尿路移行上皮的吻合是其發(fā)生的前提[14]。因?yàn)椴还苡袩o尿液刺激，只要二者接觸，同樣會(huì)發(fā)生腫瘤；腫瘤的發(fā)病率最高一定是在吻合交界處有糞便和尿液共同接觸時(shí)，如果只有糞便或尿液其中一種接觸，腫瘤的發(fā)病率就會(huì)明顯降低[15]。泌尿系結(jié)石在腸代膀胱術(shù)后患者中的發(fā)病率升高，兒童腸膀胱擴(kuò)大者結(jié)石發(fā)病率為40%左右，Kock膀胱結(jié)石為20%左右，回腸膀胱結(jié)石可高于30%[16]。本研究新膀胱里目前未發(fā)現(xiàn)腫瘤及結(jié)石，但這并不能表明以后就一定也沒有，需要1年、2年或更長(zhǎng)時(shí)間的觀察才能知曉；腸上皮能夠分泌黏液，腸膀胱術(shù)后，由于腸道本質(zhì)未變，大量黏液栓生成，可以引起輸出道梗阻，增加尿路感染的機(jī)會(huì)。腸代膀胱后，常見無癥狀性菌尿，在70%以上的尿常規(guī)中可發(fā)現(xiàn)較多細(xì)菌[17]。腸壁感染、缺血及黏液栓阻塞出口致膀胱過度擴(kuò)張可使重建后新膀胱發(fā)生自發(fā)破裂[18]。本研究通過尿液的常規(guī)檢查與尿沉渣的沉降分析顯示未發(fā)現(xiàn)與腸黏液分泌有關(guān)的異常結(jié)果；尿中白細(xì)胞和比重與術(shù)前相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，尿液高速離心后提取尿沉渣稱重與術(shù)前比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。上述各種并發(fā)癥的出現(xiàn)都是因?yàn)槟c代膀胱中腸黏膜和黏膜下層的存在，幾十年來很多專業(yè)學(xué)者都在思考和嘗試去解決它們，也找到了很多辦法，但效果都不太令人滿意。本研究采用自體移植術(shù)將腹膜直接種植在回腸漿肌上擴(kuò)大重建原位新膀胱的方法，解決了以往腸代膀胱術(shù)后難以克服的與腸黏膜吸收分泌相關(guān)的諸多并發(fā)癥，但要把它真正用于臨床還需要更深入的研究比較與更長(zhǎng)遠(yuǎn)的觀察。