小豆種質(zhì)資源總黃酮含量測(cè)定及其與農(nóng)藝性狀相關(guān)分析

劉靖崧 謝繼芳 楊 凱 趙 波 李奕松 萬(wàn) 平

(農(nóng)業(yè)應(yīng)用新技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；北京農(nóng)學(xué)院植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院1，北京 102206)(農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華北都市農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；北京農(nóng)學(xué)院生物與資源環(huán)境學(xué)院2，北京 102206)

小豆(VignaangularisL.)，起源于中國(guó)，屬豆科(Leguminosae)、 菜豆族(Phaseoleae)、 豇豆屬(Vigna)，在我國(guó)已有12 000年栽培歷史[1]，是重要的食用豆之一，在世界上30多個(gè)國(guó)家種植。Yamaguchi等[2]根據(jù)生態(tài)學(xué)、形態(tài)學(xué)等主要特征，將小豆分為栽培種、野生種和半野生種。中國(guó)具有豐富的小豆種質(zhì)資源并且表現(xiàn)出較高的遺傳多樣性[3]。小豆籽粒含小豆皂苷、三萜、類黃酮和多酚等生物活性物質(zhì)，具有祛濕、消腫、解毒、降血糖血脂、減肥、降低膽固醇等保健功能和藥用價(jià)值[4]。類黃酮對(duì)人體健康有多種益處，有抗氧化[5]、抗菌[6]、抗癌[7]等作用，黃酮類化合物的研究是國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)之一。

迄今，小豆中有關(guān)來(lái)源廣泛的種質(zhì)資源材料類黃酮含量測(cè)定和野生小豆類黃酮含量分析鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究采用紫外分光光度法測(cè)定279份小豆籽粒中黃酮類化合物含量，比較了栽培小豆及其祖先種野生小豆種質(zhì)資源總類黃酮含量的差異，分析了總類黃酮含量與籽粒性狀、Lab值之間的相關(guān)性，旨在建立和完善小豆類黃酮含量測(cè)定體系，篩選優(yōu)異種質(zhì)資源，挖掘優(yōu)異基因，為小豆高類黃酮含量生物強(qiáng)化育種和GWAS分析提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料由北京農(nóng)學(xué)院食用豆研究團(tuán)隊(duì)提供，共279份來(lái)源廣泛的野生、半野生和栽培小豆種質(zhì)資源自然群體，包括中外栽培小豆213份(160份地方品種和53份育成品種)、中外野生小豆35份、中外半野生小豆31份(表1)。材料種植于北京農(nóng)學(xué)院實(shí)驗(yàn)基地，成熟后收獲種子。

表1 供試材料列表

1.2 方法

1.2.1 總黃酮的提取及測(cè)定

將小豆種子放入FW100高速萬(wàn)能粉碎機(jī)中粉碎磨細(xì)，過(guò)100目篩，后在42 ℃干燥箱中干燥過(guò)夜，取粉末約0.2 g，3次重復(fù)，精密稱定于2 mL離心管中，加入1 mL 80%甲醇(分析純)，渦旋處理10 min讓樣品與溶劑充分混合，40 Hz條件下超聲提取90 min，后12 000 r/min離心20 min，倒出上清待用。

取提取液上清100 μL，加入ddH2O 800 μL，5% NaNO260 μL，混合均勻，5 min后，加入10%AlCl360 μL混勻，靜置，10 min后，加入400 μL 1 mol/L NaOH，再加入ddH2O補(bǔ)至2 mL，分光法測(cè)定510 nm處吸光值。空白對(duì)照為水，其他操作相同。使用蘆丁作為總黃酮的標(biāo)準(zhǔn)品配制成不同濃度，按操作步驟制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)讀數(shù)在標(biāo)準(zhǔn)曲線中測(cè)定總黃酮濃度，總黃酮含量用mg蘆丁當(dāng)量RE/g表示。測(cè)定儀器為UV-2100型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)。

設(shè)置14個(gè)梯度10～75 μg/mL，精密量取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品配成溶液用于標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定。以吸光度A為縱坐標(biāo)，濃度C(μg/mL)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程為y=0.011 2x-0.002 2，R2=0.997 5，蘆丁在10～75 μg /mL濃度范圍內(nèi)，吸光度與濃度呈良好線性關(guān)系。

1.2.2 農(nóng)藝性狀調(diào)查及測(cè)定

田間性狀調(diào)查和室內(nèi)性狀考種按照《小豆種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)》[23]和《The AsianVigna: genusVignasubgenusceratotropisgenetic resources.》[24]標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。田間調(diào)查包括：現(xiàn)花期、盛花期、第一莢成熟和100%成熟。掛牌單株進(jìn)行室內(nèi)考種，收獲的種子用SC-G型自動(dòng)考種分析及千粒重儀，正片掃描自動(dòng)導(dǎo)出種子性狀相關(guān)參數(shù)，包括百粒重、面積和單株產(chǎn)量。具體調(diào)查性狀及調(diào)查標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表2。

表2 農(nóng)藝性狀調(diào)查標(biāo)準(zhǔn)

使用cR400b色彩色差計(jì)進(jìn)行測(cè)定[25]。用1976年cIE制定的Lab表色系的方法測(cè)定小豆粒色的Lab值，Lab分別代表著亮度值、紅度值和黃度值。測(cè)定過(guò)程中，在每個(gè)單株中隨機(jī)抽取25粒左右較好的籽粒，擦凈并且使所有籽粒的種臍背對(duì)測(cè)量?jī)x器進(jìn)行測(cè)定。每份材料取3株進(jìn)行測(cè)定，每株測(cè)定3次。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析

使用IBM SPSS Statistics17分析數(shù)據(jù)，基于Pearson相關(guān)性(雙尾)的雙變量相關(guān)性確定不同性狀之間相關(guān)性的顯著性。

2 結(jié)果與討論

2.1 小豆總黃酮含量分析

不同小豆種質(zhì)資源間總黃酮含量差異明顯，栽培小豆中育成和地方品種的總黃酮含量均值分別為2.95 mg RE/g和3.31 mg RE/g，半野生和野生小豆分別為3.55 mg RE/g和4.06 mg RE/g(表3)。野生小豆總黃酮含量顯著高于半野生小豆、地方品種和育成品種，半野生小豆和地方品種總黃酮含量顯著高于育成品種，半野生小豆和地方品種間總黃酮含量差異未達(dá)顯著水平。不同小豆變異系數(shù)存在差異，且與材料份數(shù)有關(guān)，依次是地方品種、育成品種、野生小豆和半野生小豆，地方品種多樣性高。野生小豆總黃酮含量普遍偏高，含量高于3.56 mg RE/g的材料約占75%；半野生小豆高于3.52 mg RE/g的材料約占55%；地方小豆高于3.56 mg RE/g的材料約占37%；育成小豆總黃酮含量偏低，含量高于3.57 mg RE/g的材料僅占19%，約60%材料的總黃酮含量集中分布在2.30～3.50 mg RE/g之間。在小豆馴化選擇進(jìn)程中，總黃酮含量降低。

表3 不同類型小豆總黃酮含量

大豆類黃酮主要是異黃酮，來(lái)永才等[26]分析黑龍江省247份野生和栽培大豆異黃酮含量，明確了野生大豆異黃酮平均含量高于栽培大豆。林紅等[27]測(cè)定60份野生和栽培大豆的含量異黃酮含量，野生大豆平均含量3.020 mg/g，育成品種平均2.686 mg/g。周三等[28]研究表明，野生大豆的異黃酮的總含量大于普通栽培大豆，與本研究結(jié)果相同。王春娥等[22]測(cè)定野生大豆、地方品種與育成品種大豆異黃酮總含量分別為2.995、3.241、2.705 mg/g，地方品種平均值與變幅均大于野生大豆，育成品種平均值與變幅則低于野生大豆，顯然小豆的總黃酮含量較高。栽培小豆總黃酮含量普遍低于野生小豆，可能是由于黃酮類物質(zhì)引起豆制品苦澀味和影響品質(zhì)29]，而由人工選擇降低。

不同研究中用兒茶素為標(biāo)樣測(cè)定小豆總黃酮平均含量分別為2.75 mg CE/g[30]、5.81 mg CE/g[31]；Woo等[32]測(cè)定7個(gè)韓國(guó)小豆品種的總黃酮為2.61～28.95 mg CE/g，變異幅度大；Lee等[22]用槲皮素作標(biāo)樣測(cè)定小豆的總黃酮含量0.17～0.91 mg QE/g。本研究以蘆丁為標(biāo)樣測(cè)定279份野生和栽培小豆種質(zhì)的總黃酮含量平均值為3.47 mg RE/g(1.12～5.97 mg RE/g)，可見(jiàn)小豆中蘆丁、兒茶素含量高于槲皮素。Liu等[21]研究表明小豆主要有兒茶素、牡荊素-4”-O-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-葡萄糖苷和槲皮素-3-O-蕓香苷。Wang等[14]研究顯示大豆、豇豆、綠豆和小扁豆中兒茶素含量分別為0.892、0.441、0.111、0.08 mg/g。Gan等[15]測(cè)定大豆、豇豆和綠豆中兒茶素含量分別是0.785、3.34、0.971 mg CE/g，比較而言小豆的兒茶素含量較高。

初步分析不同中國(guó)地理來(lái)源栽培小豆種質(zhì)資源總黃酮平均含量，甘肅、貴州和寧夏資源總黃酮含量最高，超過(guò)4.00 mg CE/g；云南、湖北、陜西、湖南資源其次。北方地區(qū)來(lái)源材料普遍低于南方地區(qū)，但吉林省來(lái)源材料除外，推測(cè)有些來(lái)自吉林可能有的系由南方引進(jìn)或有南方地區(qū)及日本的血統(tǒng)。北京市、天津市、山東省較低，河北省和黑龍江省最低；廣東省和浙江省來(lái)源的材料總黃酮含量最低，可能是由于海拔低。黃酮含量總體趨勢(shì)是由西南地區(qū)向東北地區(qū)降低，隨著經(jīng)緯度升高而降低的趨勢(shì)(表4)。除此之外，結(jié)合中國(guó)地形圖分析發(fā)現(xiàn)，中國(guó)栽培小豆總黃酮含量分布圖與其重合度較高，即中國(guó)栽培小豆總黃酮含量隨著海拔降低而降低，進(jìn)一步分析需要測(cè)定多年多點(diǎn)種質(zhì)資源的黃酮含量。有研究表明海拔升高可以增加類黃酮含量和抗氧化能力，因?yàn)樵谳^高海拔處的太陽(yáng)輻射的增加導(dǎo)致正二羥基化類黃酮的生物合成增加，本結(jié)果與Yao等[33]研究一致。

表4 不同地域栽培小豆總黃酮含量情況

2.2 總黃酮含量與農(nóng)藝性狀的相關(guān)性分析

小豆總黃酮平均含量與農(nóng)藝性狀相關(guān)性分析顯示總黃酮含量與現(xiàn)花期、盛花期、第一莢成熟、100%成熟呈極顯著正相關(guān)，與籽粒亮度值L呈顯著正相關(guān)，與百粒重、種子面積、紅度值a、經(jīng)度呈極顯著負(fù)相關(guān)，與緯度呈顯著負(fù)相關(guān)，與單株產(chǎn)量和黃度值b未達(dá)顯著水平，與面積相關(guān)性最大(R=-0.404，P<0.01)(表5)。種子小的小豆種皮與籽粒的比表面積相對(duì)較大，而黃酮類物質(zhì)主要存在于豆類物質(zhì)的種皮中[36]，故種子小的小豆種質(zhì)資源總黃酮含量較高，相對(duì)營(yíng)養(yǎng)好于大粒。野生小豆生長(zhǎng)在自然環(huán)境條件下，多在生態(tài)條件破壞少的山區(qū)存留，繁殖系數(shù)高，百粒重小于3 g；種子小合成相對(duì)較多的黃酮類次生代謝物利于克服逆境[37]。Lab色彩模式是一種顏色標(biāo)定模式，L代表亮度值，范圍在0～100，最暗為0，最亮為100，a是由綠到紅的色彩變化值，范圍在-128～+128，純綠為-128，純紅為+128，b是由藍(lán)到黃的色彩變化值，范圍在-128～+128，純藍(lán)為-128，純黃為+128 ；L、a、b值分別代表了小豆的粒色情況，小豆種子總黃酮的含量與種皮的顏色相關(guān)，暗色籽粒小豆總黃酮含量低于亮色，紅色種皮小豆總黃酮含量低于綠色。

表5 小豆總黃酮含量與農(nóng)藝性狀的相關(guān)系數(shù)

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)279份來(lái)源廣泛的中外野生、半野生和栽培小豆種質(zhì)資源自然群體的總黃酮含量的測(cè)定，野生小豆和栽培小豆間差異明顯。小豆種質(zhì)資源總黃酮含量變異廣泛，變幅為1.12～5.97 mg RE/g，變異系數(shù)為21.66%；總黃酮含量為野生小豆>半野生小豆>地方品種>育成品種。小豆總黃酮含量與現(xiàn)花期、盛花期、第一莢成熟、100%成熟呈極顯著正相關(guān)，與籽粒亮度值L呈顯著正相關(guān)，與百粒重、面積、紅度值a、地理經(jīng)度呈極顯著負(fù)相關(guān)，與地理緯度呈顯著負(fù)相關(guān)。與面積相關(guān)性最大(R=-0.404，P<0.01)。小豆籽?？傸S酮的含量和種皮的顏色相關(guān)，亮度值低的籽?？傸S酮含量低于亮度值高的，紅色種皮小豆總黃酮含量低于綠色。不同地理來(lái)源的小豆，總黃酮含量隨著經(jīng)緯度升高而降低，隨著海拔降低而降低。