洛河污泥菌群分析及去除玉米赤霉烯酮的菌種篩選鑒定

李 旺 于思穎 程 鵬 張靜博

(河南科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，洛陽(yáng) 471023)

玉米赤霉烯酮(Zearalenone, ZEN)是一種特殊的生物毒素，屬于二羥基苯甲酸內(nèi)酯類植物雌激素，最早從發(fā)霉的玉米中分離獲得的，它主要是由鐮刀菌屬真菌產(chǎn)生[1]。高低溫度的交替變化和較高的濕度是感染此類真菌并產(chǎn)生ZEN的主要原因，玉米、小麥及大豆等糧食和飼料作物一旦感染此類真菌便會(huì)含有大量玉米赤霉烯酮而具有毒性[2]。季海霞等[3]2015對(duì)收獲并入庫(kù)的飼用玉米進(jìn)行取樣調(diào)查，結(jié)果顯示全國(guó)大部分玉米中玉米赤霉烯酮檢出率100%。Li等[4]連續(xù)3年調(diào)查顯示中國(guó)玉米、玉米副產(chǎn)物及飼料產(chǎn)品均受到不同程度的玉米赤霉烯酮污染。玉米赤霉烯酮對(duì)動(dòng)物和人類的毒性主要有生殖發(fā)育毒性、致畸致癌毒性、免疫毒性、肝腎毒性以及內(nèi)分泌系統(tǒng)毒性等[5,6]。如果不能有效控制和去除飼料和糧食中的ZEN，再好的動(dòng)物品種和飼養(yǎng)方案也不能發(fā)揮最大的養(yǎng)殖潛力，人類健康計(jì)劃也會(huì)因糧食被ZEN污染而受到影響[7]。

自20世紀(jì)60年代初的首例霉菌中毒報(bào)告以來(lái)，全世界的研究人員都在研究如何有效地減少霉菌毒素帶來(lái)的不良反應(yīng)。然而，現(xiàn)有的技術(shù)手段，仍然很難對(duì)ZEN進(jìn)行有效的預(yù)測(cè)和防止[8]。目前，去除ZEN的方法有物理方法，如熱處理法、輻照法、吸附法；化學(xué)法，如臭氧、雙氧水、碳酸鈉等與玉米赤霉烯酮產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)；物理法和化學(xué)法存在不易操作或破壞原料營(yíng)養(yǎng)價(jià)值引起二次污染等弊端[9,10]。生物去除法是利用微生物產(chǎn)生的特異性的酶對(duì)玉米赤霉烯酮分解或者通過微生物及代謝物對(duì)毒素進(jìn)行吸附。酶具有很強(qiáng)的專一性，不會(huì)對(duì)糧食和飼料等造成新的污染，也不會(huì)影響受污染飼料等的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[11]。因此生物去除法成為脫毒、解毒研究的熱門話題[12,13]。已有報(bào)道顯示，去除玉米赤霉烯酮的微生物廣泛存在于自然界中，但關(guān)于去除玉米赤霉烯酮的相關(guān)研究多是對(duì)單菌的篩選，對(duì)去除菌中的種群研究較少[14,15]。因此，本實(shí)驗(yàn)對(duì)洛河污泥樣品進(jìn)行去除菌種群的分析，弄清同一個(gè)區(qū)域內(nèi)存在哪些毒素去除菌種及其去除能力，改良篩選策略，為后續(xù)篩選出高效玉米赤霉烯酮去除菌種和組合應(yīng)用這些菌種準(zhǔn)備材料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品及來(lái)源

污泥樣品：采自洛河河道枯草密集區(qū)域的河道表層至深10 cm處，隨機(jī)從10個(gè)樣點(diǎn)采集污泥樣品，密封冷藏于實(shí)驗(yàn)室備用。

1.1.2 培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基：葡萄糖4 g，胰蛋白胨2 g，酵母提取物1 g，牛肉膏2 g，MnSO4·4H2O 0.076 g，MgSO4·7H2O 0.04 g，Tween-80 0.2 mL，K2HPO40.4 g，檸檬酸胺0.4 g(固體培養(yǎng)基加瓊脂粉3.2 g)，無(wú)菌水200 mL，pH 6.2～6.4。

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨2 g，酵母提取物1 g，氯化鈉2 g(固體培養(yǎng)基加瓊脂粉3.2 g)，無(wú)菌水200 mL，pH 7.0～7.2。

NA培養(yǎng)基：牛肉膏0.6 g，蛋白胨2 g，氯化鈉1 g，無(wú)菌水200 mL(固體培養(yǎng)基加瓊脂粉3.2 g)，pH 7.2。

在各培養(yǎng)基中，添加5 μg/mL的玉米赤霉烯酮純品，用以做底物篩選去除菌種。

1.1.3 主要試劑

細(xì)菌基因組提取試劑盒、玉米赤霉烯酮ELISA檢測(cè)試劑盒、ZEN標(biāo)準(zhǔn)品(濃度>95%)，其他生化試劑和化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 污泥樣品宏基因組測(cè)序分析

細(xì)菌基因組DNA的提取與質(zhì)量檢測(cè)：將10個(gè)污泥樣品各取1 g樣品混合均勻，按照細(xì)菌基因組提取試劑盒說明抽提總DNA，并對(duì)其進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)；DNA樣本檢測(cè)合格后，將其隨機(jī)片段化并篩選合適大小的插入片段進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建；構(gòu)建好的文庫(kù)經(jīng)過質(zhì)檢合格后，使用Qubit3.0、QPCR和Qseq100精確定量，最后上機(jī)測(cè)序。

測(cè)序獲得的基因進(jìn)行分類，在NR數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST比對(duì)，比對(duì)到的物種，采用LCA(lowest common ancestor)算法，由種級(jí)別的分類向上追溯至第一個(gè)出現(xiàn)的公共分類級(jí)別，以此作為其注釋信息。統(tǒng)計(jì)樣本中注釋到各物種分類層級(jí)上的數(shù)量，并分析。

1.2.2 ZEN去除菌種的篩選與鑒定

在超凈臺(tái)中將10 g污泥樣品放入90 mL無(wú)菌水混合于150 mL三角瓶中，封口膜封口，置于搖床上震蕩30 min，配置10-1、10-2兩種稀釋梯度，取50 μL稀釋液滴在MRS、NA、LB等培養(yǎng)基上，用涂布棒將菌液在培養(yǎng)基上涂抹均勻，將各種培養(yǎng)基在37 ℃，厭氧和好氧條件下培養(yǎng)24～48 h，初篩微生物。篩選到微生物后，觀察菌落特征，革蘭氏染色，觀察菌體特征后，編號(hào)保存。

參照細(xì)菌基因組提取試劑盒說明書，提取所篩選菌種基因組DNA，擴(kuò)增菌種的16SrDNA保守序列。對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，并通過NCBI Blast N進(jìn)行保守序列的分析比對(duì)。PCR擴(kuò)增體系為25 μL體系，包括2.5 μL 10×Ex Taq Buffer，2 μL dNTP，上、下游引物各1 μL，0.5 μL Ex Taq酶，1 μL模板(基因組DNA)，17 μL ddH2O。PCR反應(yīng)條件及程序?yàn)椋侯A(yù)變性94 ℃ 2 min→35個(gè)循環(huán)(變性94 ℃ 30 s→復(fù)性 57 ℃ 30 s→延伸 72 ℃ 1 min 30 s)→終延伸72 ℃ 10 min→ 4 ℃保存。

1.2.3 ZEN含量測(cè)定和去除率計(jì)算

挑取固體培養(yǎng)基上初篩的菌落于相應(yīng)的液體培養(yǎng)基中，好氧培養(yǎng)于37 ℃搖床210 r/min搖動(dòng)培養(yǎng)18 h，厭氧方式于37 ℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)18 h，取出各菌種的培養(yǎng)液，冰箱冷藏保存。所篩菌種的培養(yǎng)液直接做待測(cè)樣品，用50%甲醇溶液1∶1混合提取后，濾紙過濾。然后按照玉米赤霉烯酮ELISA檢測(cè)試劑盒說明書的操作流程，測(cè)定培養(yǎng)液中玉米赤霉烯酮的含量，計(jì)算ZEN的去除率。

去除率=(添加ZEN—?dú)埩鬦EN)/添加ZEN×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 宏基因組文庫(kù)的物種分析結(jié)果

利用宏基因組測(cè)序技術(shù)擴(kuò)增污泥中微生物保守序列，并對(duì)基因序列進(jìn)行相似性分析和比對(duì)，在“門”水平上與已有基因庫(kù)物種中相似性大于95%水平的微生物物種共有53 890個(gè)。分屬23個(gè)門，其中厚壁菌門物種基因豐度達(dá)99.4%，為主要優(yōu)勢(shì)微生物群落?；凇澳俊彼降姆治?，相似性大于95%水平的微生物物種基因信息共有51 911個(gè)，分屬72個(gè)目，主要以芽孢桿菌目(Bacillales)和乳酸菌目(Lactobacillales)為主，分別占微生物菌株總數(shù)的64.5%和18.9%?；凇皩佟彼娇煞治?，鑒定的47 683個(gè)菌株分屬374個(gè)屬，主要菌屬為芽孢桿菌屬(Bacillus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、海洋芽孢桿菌屬(Oceanobacillus、Amphibacillus)和雙枝芽孢桿菌屬(Virgibacillus)，所占比例分別達(dá)為26.5%、14.9%、14.0%、11.0%，其中芽孢桿菌屬包含了11 026個(gè)菌株基因信息，是最主要的屬(圖1黑點(diǎn))。鑒定到“種”水平的微生物菌株共32 199株，屬于1 568種微生物，其中枯草芽孢桿菌族(Bacillussubtilisgroup)、巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)、 達(dá)蒙海洋桿菌(Oceanobacillusdamuensis)、 植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)、大型海洋桿菌(Oceanobacillusmassiliensis)、蠟樣芽孢桿菌族(Bacilluscereusgroup)、兼性芽孢桿菌(Amphibacillusxylanus)、枝芽孢桿菌(Virgibacilluspantothenticus)、解淀粉慢桿菌(Lentibacillusamyloliquefaciens)、短小乳桿菌(Lactobacillusbrevis)、糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)為主要物種。其中枯草芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、達(dá)蒙海洋桿菌、植物乳桿菌分別包含2 188、1 794、1 568、1 487個(gè)菌株基因信息，是河道污泥中的主要菌種(圖1白點(diǎn))。

圖1 基于屬、種水平的主要菌群分析

2.2 ZEN去除菌種的篩選和鑒定分析

根據(jù)2.1的分析結(jié)果，設(shè)計(jì)和配制樣品中主要微生物菌種的篩選培養(yǎng)基(MRS、NA、 LB)，取10個(gè)樣點(diǎn)的樣品分別在固體培養(yǎng)基上用不同的培養(yǎng)方式初篩，篩選到47個(gè)菌落形態(tài)不同的優(yōu)勢(shì)菌株。所篩菌株在不同初篩培養(yǎng)基上均能較好生長(zhǎng)，大部分菌落符合細(xì)菌的菌落特征。但在不同培養(yǎng)基和培養(yǎng)方式中，菌落形態(tài)差異較大。在MRS培養(yǎng)基上篩選到具有典型乳酸菌菌落特征的多個(gè)菌種，在NA培養(yǎng)基上篩選到具有桿菌屬細(xì)菌特性的多個(gè)菌種，在LB培養(yǎng)基上篩選到具有芽孢桿菌菌落特征的多個(gè)菌種。挑取培養(yǎng)基上典型菌落進(jìn)行革蘭氏染色結(jié)果如圖2所示。革蘭氏染色結(jié)果顯示，所篩菌種絕大部分為革蘭氏陽(yáng)性菌，桿狀、球狀和梭狀形態(tài)為主，由于培養(yǎng)時(shí)間較短，菌體未見明顯芽孢。

注：a為MRS培養(yǎng)基所篩典型菌種，b為NA培養(yǎng)基所篩典型菌種，c為L(zhǎng)B培養(yǎng)基所篩典型菌種。

對(duì)在不同培養(yǎng)基和培養(yǎng)方式下所篩47株菌種中選代表性菌株25株，采用細(xì)菌16SrDNA通用引物擴(kuò)增菌種的保守序列，結(jié)果如圖3所示。所選菌種均能擴(kuò)增出約1 500 bp的保守序列。對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序并在NCBI Blast N中進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn)，MRS培養(yǎng)基厭氧條件所篩菌種與植物乳桿菌菌株(MG551233.1)的相似度達(dá)99%以上，MRS培養(yǎng)基好氧條件所篩菌種與乳酸片球菌菌株(KY550661.1)的相似度達(dá)98%以上；NA培養(yǎng)基厭氧條件所篩菌種與糞腸球菌菌株(CP028727.1)的相似度達(dá)98%以上，NA培養(yǎng)基好氧條件所篩菌種與海洋芽孢桿菌(KV392046.1)的相似度達(dá)98%以上；LB培養(yǎng)基好氧條件所篩菌種與枯草芽孢桿菌菌株(KC422328.1)相似度達(dá)到99%以上，LB培養(yǎng)基厭氧條件所篩菌種與巨大芽孢桿菌菌株(CM003163.1)相似度達(dá)到97%以上?？沙醪脚袛嗖煌Y選方式所篩菌株分屬不同的微生物品種。所篩菌種的菌體形態(tài)及分子鑒定分析與基因組測(cè)序分析結(jié)果相符。

注：M為DNA marker，大小依次2 000, 1 000, 750, 500, 250, 100 bp，1～9為MRS培養(yǎng)基所篩微生物菌種，10～17為NA培養(yǎng)基所篩微生物菌種，18～25為L(zhǎng)B培養(yǎng)基所篩菌種。

2.3 不同樣點(diǎn)菌種對(duì)ZEN的去除率

對(duì)初篩的47種菌株挑取菌落于相應(yīng)的液體發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，觀察不同編號(hào)菌種的菌液變化情況，并在培養(yǎng)18 h后測(cè)定發(fā)酵液中ZEN的含量，計(jì)算培養(yǎng)液中ZEN去除率，結(jié)果如表1所示。在10個(gè)河道污泥樣品中用3種培養(yǎng)基均篩選到了能夠去除ZEN的微生物菌種。通過對(duì)培養(yǎng)基中ZEN含量的測(cè)定和統(tǒng)計(jì)計(jì)算，所篩微生物菌種對(duì)ZEN的去除率大部分都在60%以上。說明可去除ZEN的菌種廣泛存在于洛河污泥中。

表1 不同來(lái)源樣品菌種對(duì)ZEN的去除統(tǒng)計(jì)

2.4 不同培養(yǎng)方式所篩菌株對(duì)ZEN去除率

按照培養(yǎng)基和培養(yǎng)方式對(duì)47株微生物ZEN的去除率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)計(jì)算，結(jié)果如表2所示。LB培養(yǎng)基共篩選到8株去除ZEN的微生物，其中，好氧方式篩選到5株，平均去除率為79.25%，厭氧方式篩選到3株，平均去除率接近70%；NA培養(yǎng)基共篩選到20株去除ZEN的微生物其中好氧方式篩選到9株，平均去除率為80.65%，厭氧方式篩選到11株，平均去除率為55.82%；MRS培養(yǎng)基共篩選到19株去除ZEN的微生物，其中好氧方式篩選到9株，平均去除率為73.43%，厭氧方式篩選到10株，平均去除率為56.49%；3種培養(yǎng)基在好氧培養(yǎng)方式下所篩菌種的去除率顯著高于厭氧培養(yǎng)方式所篩菌種的去除率(P<0.05)。在好氧培養(yǎng)方式下LB、NA培養(yǎng)基所篩菌種的平均去除率差異不顯著(P<0.05)，但顯著高于MRS培養(yǎng)基所篩菌種的平均去除率；在厭氧培養(yǎng)方式下NA、MRS培養(yǎng)基所篩菌種的平均去除率差異不顯著(P<0.05)，但顯著低于LB培養(yǎng)基所篩菌種的平均去除率(P<0.05)。說明好氧篩選和培養(yǎng)方式更適合ZEN去除菌種；LB、NA培養(yǎng)基更有機(jī)會(huì)篩選到ZEN去除率高的去除菌種。

表2 不同培養(yǎng)方式菌種對(duì)ZEN的去除統(tǒng)計(jì)

3 討論

ZEN為鐮刀菌屬霉菌產(chǎn)生的一種真菌毒素，廣泛存在于霉變的玉米、小麥等谷物中。而能夠降解ZEN的微生物也廣泛存在于自然環(huán)境中。已有的報(bào)道成功的從玉米田、沼氣污泥、河道污泥等多種自然環(huán)境中篩選到降解ZEN的細(xì)菌[16,17]。本實(shí)驗(yàn)從洛河污泥中篩選到了大量能夠降解ZEN的微生物菌種，也驗(yàn)證了這一點(diǎn)。在篩選策略方面，大部分的成功經(jīng)驗(yàn)是以ZEN為唯一碳源，篩選能夠利用ZEN作為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的微生物菌種[16,17]。本實(shí)驗(yàn)首先對(duì)污泥樣品中的微生物種群結(jié)構(gòu)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，初步查明了污泥樣品中的微生物種群信息后，利用改良篩選培養(yǎng)基有針對(duì)性的從污泥樣品的優(yōu)勢(shì)菌群中篩選能夠去除ZEN的微生物菌種。

對(duì)已知具有降解ZEN能力的微生物菌種進(jìn)行鑒定，這些微生物的種類非常豐富，大部分為細(xì)菌的芽孢桿菌屬[15,18,19]，主要與芽孢桿菌具有豐富的酶系和很強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)性有關(guān)。也有篩選到降解ZEN的假單胞菌的報(bào)道[17]。而在霉菌菌種的報(bào)道方面，杜穩(wěn)等[20]在酸性環(huán)境下篩選到了降解ZEN的黑曲霉，Liu等[12]研究了益生菌和米曲霉細(xì)胞抽提物對(duì)ZEN具有降解作用，并且對(duì)豬的生產(chǎn)具有明顯緩解中毒癥狀的作用。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)樣品中微生物種群分析，其中大部分為芽孢桿菌屬，實(shí)驗(yàn)所篩選到47株去除ZEN的微生物，經(jīng)形態(tài)學(xué)和分子鑒定大部分為枯草芽孢桿菌、植物乳桿菌、巨大芽孢桿菌、海洋芽孢桿菌、乳酸片球菌和糞腸球菌等細(xì)菌菌種；但本實(shí)驗(yàn)沒有篩選到與霉菌形態(tài)相符的菌種，可能與篩選樣品有關(guān)，本實(shí)驗(yàn)所用樣品為河道污泥，有機(jī)質(zhì)含量低，不易發(fā)霉，不利于霉菌滋生。

所篩菌種對(duì)ZEN的去除能力由于菌種的不同導(dǎo)致去除率變動(dòng)范圍很大，同時(shí)，降解率也與降解底物ZEN的濃度和存在狀態(tài)有關(guān)，降解菌的降解率從20%多到90%以上的均有報(bào)道[17-20]，降解率較高的菌株大多為芽孢桿菌類。本實(shí)驗(yàn)所篩菌種對(duì)培養(yǎng)基中5 μg/mL濃度的ZEN去除能力最高的平均去除率達(dá)到80%多，個(gè)別菌株的去除率達(dá)到95%左右，對(duì)ZEN去除率較高的菌株大部分屬于芽孢桿菌。而本實(shí)驗(yàn)樣品中的另一個(gè)主要菌群乳酸菌類，包括植物乳桿菌、乳酸片球菌和糞腸球菌，在被報(bào)道的降解菌中很少見，本實(shí)驗(yàn)中MRS厭氧篩選的菌種平均去除率也最低，可能是因?yàn)槿樗峋嗤ㄟ^對(duì)霉菌生長(zhǎng)的抑制來(lái)抑制真菌毒素的形成，或借助乳酸菌細(xì)胞壁與真菌毒素的物理結(jié)合來(lái)清除毒素[21]。

4 結(jié)論

洛河河道污泥中微生物菌群豐富，宏基因組物種分析結(jié)果顯示在屬的水平主要是芽孢桿菌屬和乳桿菌屬，在種的水平主要是枯草芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、達(dá)蒙海洋桿菌和植物乳桿菌。

能夠降解ZEN的微生物菌種廣泛存在，通過改良MRS、NA和LB培養(yǎng)基一次篩選出47株菌種，均能夠去除培養(yǎng)基中的ZEN。經(jīng)鑒定所篩菌種大部分為植物乳桿菌、乳酸片球菌、糞腸球菌、海洋芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌等微生物菌種。

所篩選的ZEN去除菌種中，以LB、NA培養(yǎng)基好氧培養(yǎng)方式篩選的對(duì)ZEN去除率較高，說明此種方式更可能從河道污泥中篩選到對(duì)ZEN去除率高的微生物菌種。