松露多糖的提取、分離純化和結(jié)構(gòu)鑒定

李美鳳，袁明昊，鄒仕赟，郭力*

1(成都中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，四川 成都, 611137)2(成都中醫(yī)藥大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院，四川 成都, 611137)

松露(Truffle)屬子囊菌門西洋塊菌科西洋塊菌屬，是非常珍貴和稀有的食用菌[1-2]。松露營養(yǎng)豐富，富含蛋白質(zhì)、多種氨基酸、維生素和礦物質(zhì)等[3-4]。多糖是松露中最重要的成分之一，松露多糖有較高的抗氧化活性，可作為天然的抗氧化劑用于功能食品，松露多糖還有免疫調(diào)節(jié)活性、抗腫瘤活性和抗癌作用[5-6]。目前，國內(nèi)關(guān)于松露的研究大都集中在對真松露和假松露從外形、氣味、孢子形態(tài)進(jìn)行鑒別以及對松露的揮發(fā)性物質(zhì)的探索方面，對松露多糖的研究不多。本實(shí)驗(yàn)以四川會東松露為原料，優(yōu)化松露多糖的提取工藝，過DEAE-52纖維素柱對多糖進(jìn)行分級分離，利用1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)法對其抗氧化性進(jìn)行測定，并通過紅外光譜對松露多糖的結(jié)構(gòu)進(jìn)行初步鑒定，旨在為松露多糖資源的綜合利用提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

松露：四川會東縣嘎吉鄉(xiāng)，收集時間為2019年12月10日，經(jīng)鑒定為中華塊菌；各種單糖標(biāo)準(zhǔn)品，DEAE-Sepharose 52，Solarbio；NaCl、H2SO4、DPPH、苯酚,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

101-2AB恒溫干燥箱,北京中興偉業(yè)儀器有限公司；多模式微孔板檢測儀(酶標(biāo)儀),美國Bio-Tek；GC-MS-QP2010 SE,日本島津。

1.3 方法

1.3.1 松露多糖的提取及測定

1.3.1.1 多糖含量的測定

采用苯酚-硫酸法測定粗多糖含量，參考文獻(xiàn)[7]，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=6.828 6x-0.009，R2=0.999。

1.3.1.2 松露提取工藝優(yōu)化

新鮮松露洗凈，切片后，放置于60 ℃烘箱中烘干，打粉過40目篩，備用。稱取松露干粉，按比例加入蒸餾水，在加熱過程中不斷攪拌，收集上清液；醇沉(乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%)，4 ℃過夜沉淀；離心收集沉淀，冷凍干燥后得松露粗多糖。

單因素試驗(yàn)：選取提取時間(0.5、1.0、1.5、2.0和2.5 h)、提取溫度(60、70、80、90、100 ℃)和料液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50， g∶mL)，探究松露多糖在不同條件下的提取率。

正交優(yōu)化試驗(yàn)：以多糖提取量為參考，綜合上述單因素試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)3因素3水平正交試驗(yàn)，見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平

1.3.2 脫蛋白方法和蛋白質(zhì)含量得測定

蛋白質(zhì)含量采取考馬斯亮藍(lán)的方法，具體操作步驟見參考文獻(xiàn)[8]，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.166 8x+0.676 8，R2=0.998，x代表蛋白質(zhì)量濃度(μg/mL)；Sevag法脫除蛋白，其中正丁醇-氯仿混合液體積比1∶4，重復(fù)5次，測蛋白質(zhì)含量[9]。

1.3.3 松露多糖的分級分離

準(zhǔn)確稱取400 mg 松露多糖溶于6 mL去離子水中，過膜后加入纖維素層析柱(2.6 cm×50 cm)，用去離子水、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mol/L NaCl溶液進(jìn)行梯度洗脫。流速為 1 mL/min，5 min/管，各個濃度收集20管。在490 nm下測吸光度值，繪制曲線。由圖2可以看出，松露多糖的洗脫峰有2個，出現(xiàn)在0.2 mol/L 和0.3 mol/L NaCl溶液洗脫液中，分別命名為TPS-A和 TPS-B，適當(dāng)濃縮后裝入3 000 kDa透析袋中透析，封好口后，置于4 ℃超純水中透析48 h，除去氯化鈉，6～8 h更換1次超純水，凍干[12]。

1.3.4 松露粗多糖抗氧化性的測定

DPPH自由基(DPPH·)清除能力：對純化后得到的TPS-A松露多糖參照參考文獻(xiàn)[11]的方法進(jìn)行測定，DPPH·清除率按公式(1)計(jì)算：

(1)

式中:A0為無TPS-A多糖的混合液的吸光度；A為有TPS-A多糖混合液的吸光度；Ab為無DPPH樣品的吸光度。

1.3.5 單糖組成的測定

取2 mg多糖，1 mL的2 mol/L三氟乙酸在120 ℃條件下水解90 min，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干。殘基加入2 mL雙蒸水，100 mg硼氫化鈉還原，加入冰醋酸中和，旋蒸，110 ℃烘箱烘干，然后加入1 mL乙酸酐乙?；?00 ℃反應(yīng)1 h，冷卻，然后加入3 mL甲苯，減壓濃縮蒸干，重復(fù)4～5次，以除去多余的醋酐。將乙酰化后的產(chǎn)物用3 mL氯仿溶解后轉(zhuǎn)移至分液漏斗，加入少量蒸餾水充分震蕩后，除去上層水溶液，如此重復(fù)5次。氯仿層以適量的無水硫酸鈉干燥，定容10 mL，分析采用Shimadzu GCMS-QP 2010氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀測定乙酰化產(chǎn)物樣品[13]。

GC-MS條件：RXI-5 SIL MS色譜柱30 mm×0.25 mm×0.25 mm；程序升溫條件為：起始溫度120 ℃，以3 ℃/min升溫至250 ℃/min；保持5 min；進(jìn)樣口溫度為250 ℃，檢測器溫度為250 ℃/min，載氣為氦氣，流速為1 mL/min。其中標(biāo)準(zhǔn)品順序?yàn)椋菏罄钐?、巖藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖。

1.3.6 傅里葉紅外光譜分析(Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR)

將多糖與KBr研磨均勻后，壓片，在4 000～400 cm-1范圍內(nèi)進(jìn)行掃描[14]。

1.3.7 TPS-A的掃描電鏡(scanning electron microscope, SEM)分析

將TPS-A與樣品載物臺緊密貼合，使其均勻分布于表面，隨后噴金，用掃描電鏡進(jìn)行觀察，具體操作步驟參考文獻(xiàn)[15]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用Origin 2018和Excel 2010進(jìn)行圖形繪制和數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 松露多糖提取工藝優(yōu)化結(jié)果

2.1.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由圖1-a可知，多糖提取率隨提取時間的延長而逐漸增加，至2 h時達(dá)到最大，超過2 h，多糖提取率降低，原因是隨著加熱時間的增加，不溶物及黏性物質(zhì)等溶出，雜質(zhì)和黏度增加，且有助于其他水溶性物質(zhì)如色素、蛋白等溶出，從而影響了松露多糖的提取率[16]；由圖1-b可知，在90 ℃時多糖提取率最大，多糖提取率為9.28%，超過90 ℃后，提取率降低，可能是溫度高，水分蒸發(fā)，溶液變黏稠，多糖溶解難度增加；溫度低，小分子之間的活動不劇烈，多糖得率下降[17]；由圖1-c可以看出，多糖提取率在料液比為130(g∶mL)時達(dá)到最大，超過1∶30(g∶mL)后，多糖提取率下降。所以，選擇料液比1∶30～1∶50(g∶mL)、加熱時間1.0～2.0 h、提取溫度80～100 ℃進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。

a-提取時間;b-提取溫度;c-料液比圖1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表2可知，3個因素對松露粗多糖得率的影響大小排序?yàn)锽>A>C，即提取溫度對粗多糖得率的影響>提取時間>料液比。由k值得到最優(yōu)水平為A3B1C2，最佳提取工藝組合為提取時間為2 h，提取溫度為80℃，料液比為1∶40(g∶mL)。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

最優(yōu)提取條件A3B1C2并未在正交試驗(yàn)中出現(xiàn)，需要補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)對比L9(33)中A3B1C3和A3B1C2的多糖提取率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果為：A3B1C3為(9.83±0.04)%,A3B1C2為(9.74±0.06)%。根據(jù)提取率的高低，確定最優(yōu)提取條件為A3B1C2，即提取時間為2 h，提取溫度為80 ℃，料液比為1∶40(g∶mL)，松露粗多糖的提取率為9.83%，高于李明華等[18]對江蘇等地金針菇中多糖的提取率(6.85%)和張麗娟等[19]對武夷山產(chǎn)長根菇多糖的提取率(5.85%)，低于叢媛媛等[20]對新疆阿魏菇中的多糖提取率(14.69%)；從提取方法來看，與孔慶龍[21]的松露多糖的得率接近(10.75%)，但孔慶龍[21]的提取時間長(3.7 h)，料液比大(1∶59，g∶mL)，延長了后續(xù)的濃縮、乙醇沉淀和冷凍干燥的實(shí)驗(yàn)周期，且增加了溶劑(乙醇、正丁醇和氯仿)的使用量；賴婷[10]研究發(fā)現(xiàn)提取次數(shù)的增加能提高松露多糖的得率，但同時延長了實(shí)驗(yàn)周期，賴婷將提取次數(shù)調(diào)整為3次，多糖提取率從5%增加到10%左右，但提取時間增加到6 h，是本文提取時間的3倍。綜上所述，適當(dāng)縮短提取時間將有助于縮短實(shí)驗(yàn)周期，減少能耗，降低生產(chǎn)成本，符合工業(yè)生產(chǎn)要求，同時料液比1∶40(g∶mL)，減少后續(xù)脫蛋白的正丁醇和氯仿的使用量，既能減少溶劑的浪費(fèi)也能使工藝更簡單易操作，故此工藝可行且環(huán)保。

2.3 多糖的分級結(jié)果

前期實(shí)驗(yàn)對NaCl濃度梯度的分離效果進(jìn)行了預(yù)實(shí)驗(yàn)，適當(dāng)?shù)恼{(diào)整了濃度梯度，由圖2可以看出，0、0.1～0.5 mol/L的NaCl對多糖的分離效果明顯，松露多糖經(jīng)DEAE-52纖維素柱層析分離后出現(xiàn)2個峰，分別為TPS-A、TPS-B，收集第41～53管為TPS-A，第75～83管為TPS-B，過柱后TPS-B含量較少，故后續(xù)僅對TPS-A進(jìn)行研究，經(jīng)檢測TPS-A的總糖含量為75.26%，蛋白質(zhì)含量占總質(zhì)量的1.32%。

圖2 多糖DEAE-52纖維素柱洗脫曲線

2.4 松露多糖的抗氧化結(jié)果

由圖3可知，TPS-A和VC對DPPH·清除率效果較好。低濃度(0.125 mg/mL)VC的DPPH·清除率也能保持在80%；松露多糖的DPPH·清除率隨著多糖濃度的增加緩慢升高。TPS-A對DPPH·的IC50為0.98 mg/mL；和劉宇琪等[22]實(shí)驗(yàn)中靈芝多糖的清除率接近(IC50為1 mg/mL)，鄧加聰?shù)萚23]通過超聲水溶液提取牛肝菌多糖的DPPH·的IC50為1.03 mg/mL；DPPH·的IC50的多糖濃度越低，清除效率越好，因此，松露多糖TPS-A具有較高的抗氧化活性。

圖3 松露多糖對DPPH·的清除作用

2.5 單糖的組成

由圖4可知，TPS-A的組成主要為鼠李糖、甘露糖和葡萄糖，按照出峰時間的先后順序分別對應(yīng)圖4-b中的1、5和6，所占比例分別為2%、3%和95%。松露多糖 TPS-A 的單糖組成與王小花[26]研究的松露多糖的單糖組成結(jié)果類似，葡萄糖含量占90%以上，另有少量甘露糖和半乳糖；孔慶龍[21]發(fā)現(xiàn)純化后的松露多糖主要是由葡萄糖組成的多糖，這也證實(shí)松露多糖 TPS-A 中葡萄糖的含量較高檢測準(zhǔn)確。

圖4 標(biāo)準(zhǔn)單糖、TPS-A水解衍生化產(chǎn)物的GC圖

2.6 松露多糖TPS-A 的FTIR掃描結(jié)果

圖5 TPS-A的傅里葉紅外光譜圖

2.7 TPS-A掃描電鏡結(jié)果

圖6-a、圖6-b、圖6-c分別為TPS-A在100、30、5 μm放大倍數(shù)下的電鏡掃描圖像，可知冷凍干燥和提取工藝并未對多糖的結(jié)構(gòu)造成破壞。由圖6-a可知，TPS-A主要由長桿狀、圓形顆粒和大塊的片狀組成，其中長桿狀的數(shù)量多且呈網(wǎng)狀排列，在長桿狀的周圍零星分布著圓形顆粒，顆粒大小接近于長桿的橫截面，片狀結(jié)構(gòu)體積大，但數(shù)量少，表面光滑；由圖6-b可更清晰的觀察到長桿狀相互纏繞，并和圓形顆粒相互重疊，內(nèi)部空間結(jié)構(gòu)疏松，故多糖的吸水效果好；由圖6-c中可以看出，圓形顆粒表面光滑，顆粒外形完整，數(shù)量多。

圖6 TPS-A不同放大倍數(shù)掃描電鏡圖

3 結(jié)論

本文對松露粗多糖的水提醇沉工藝進(jìn)行了優(yōu)化，通過正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化松露多糖提取工藝為：提取時間2 h、料液比1∶40(g∶mL)和提取溫度80 ℃，此條件下的多糖提取量為9.83%；后采用DEAE-52纖維素柱層析分離得到2個不同的組分，分別為TPS-A和TPS-B，其中TPS-B量少，后續(xù)僅對TPS-A進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定和抗氧化實(shí)驗(yàn)。TPS-A對DPPH·的IC50值為0.98 mg/mL，同時測得松露多糖TPS-A是由甘露糖、葡萄糖和鼠李糖組成，且葡萄糖含量高達(dá)95%，經(jīng)紅外檢測分析發(fā)現(xiàn)TPS-A是一種含有β糖苷鍵的吡喃型多糖。松露多糖在抗氧化活性方面表現(xiàn)優(yōu)異，作為一種天然的食品成分，可用于醫(yī)學(xué)美容、保健品和食品添加劑方面，這為四川會東松露多糖的綜合開發(fā)提供思路。