• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    木糖和葡萄糖共發(fā)酵生產(chǎn)L-組氨酸

    2020-09-03 02:03:54吳鶴云張悅蔣帥田道光謝希賢陳寧
    食品與發(fā)酵工業(yè) 2020年16期
    關(guān)鍵詞:組氨酸誘導(dǎo)劑木糖

    吳鶴云,張悅,蔣帥,田道光,謝希賢,2,陳寧,2*

    1(天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院,天津,300457)2(代謝控制發(fā)酵技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實驗室,天津,300457)

    L-組氨酸是一種重要的功能性氨基酸,具有抗炎[1]、抗氧化[2]和免疫調(diào)節(jié)[3]等多種生理功能,在醫(yī)藥[4]、保健食品[5]和飼料行業(yè)[6]有著廣闊的應(yīng)用前景。血粉等蛋白原料的水解提取是目前L-組氨酸的主要生產(chǎn)方法[7],但是原料不易得,設(shè)備損失率高等因素制約了此法的生產(chǎn)規(guī)模,很難滿足日益增長的L-組氨酸市場需求。而發(fā)酵法生產(chǎn)氨基酸具有原料來源廣泛、反應(yīng)所需能耗低、環(huán)境友好等優(yōu)點[8],適合工業(yè)化生產(chǎn),成為L-組氨酸生產(chǎn)研究的主流方向。

    高效生產(chǎn)L-組氨酸菌種的缺失是限制發(fā)酵法規(guī)模化生產(chǎn)L-組氨酸的主要因素,所以菌種改良仍舊是目前L-組氨酸發(fā)酵生產(chǎn)研究的重點,研究者也在通過誘變篩選或者代謝工程改造的方法持續(xù)改良L-組氨酸菌種的發(fā)酵性能[9-13]。這些研究通過解除L-組氨酸生物合成的調(diào)控作用,強化合成途徑,增強前體物供應(yīng)等策略的應(yīng)用,顯著提高了菌種L-組氨酸的生產(chǎn)能力。本實驗室前期通過CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因組編輯方法[14]直接改造大腸桿菌W3110的染色體,通過對組氨酸操縱子前導(dǎo)序列的替換,增加操縱子基因的拷貝數(shù)和引入外源解調(diào)控的HisG突變體[15](HisG*),構(gòu)建了菌株EscherichiacoliHIS1,該菌L-組氨酸生物合成途徑所受調(diào)控作用已解除,L-組氨酸合成途徑被強化,具備了過量積累L-組氨酸的能力。

    L-組氨酸生物合成最主要的限制因素是關(guān)鍵酶HisG所受的反饋抑制作用。許多研究者[16-17]致力于篩選解調(diào)控的HisG突變體,以促進L-組氨酸的過量合成。然而L-組氨酸的合成是一個十分耗能的過程,會占用細胞大量的資源[18],所以HisG的活性過強則容易導(dǎo)致菌體的生長受限,反而會影響L-組氨酸的最終產(chǎn)量,于是如何在不妨礙菌體生長的前提下盡可能提高HisG的活性便成為菌株高效生產(chǎn)L-組氨酸的關(guān)鍵。使用誘導(dǎo)型啟動子啟動關(guān)鍵酶的表達,通過調(diào)整誘導(dǎo)劑濃度或誘導(dǎo)時間可調(diào)控菌體的生長和產(chǎn)物生成。NAKASHIMA等[19]通過在大腸桿菌基因組上引入T7RNA聚合酶,并用木糖誘導(dǎo)的啟動子PxylF啟動表達,同時對糖代謝轉(zhuǎn)錄抑制因子的編碼基因mlc進行點突變解除葡萄糖對木糖啟動子轉(zhuǎn)錄的阻遏作用,建立了一套木糖誘導(dǎo)的T7表達系統(tǒng)。該系統(tǒng)結(jié)合T7啟動子不僅可實現(xiàn)目的基因可控的強表達,還避免了質(zhì)粒的使用,且木糖作為誘導(dǎo)劑相比異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,TPTG)等常用誘導(dǎo)劑價格低廉。E.coliHIS1的構(gòu)建過程中便借鑒了NAKASHIMA等的研究成果,采用木糖誘導(dǎo)的T7表達系統(tǒng)控制L-組氨酸合成關(guān)鍵酶HisG*的表達。

    發(fā)酵條件優(yōu)化是提高目標(biāo)產(chǎn)物發(fā)酵生產(chǎn)效率的重要方法[20-23]。本研究通過搖瓶和發(fā)酵罐培養(yǎng)的方式優(yōu)化了E.coliHIS1的發(fā)酵條件,主要對木糖的添加量,添加時間和添加方式進行了優(yōu)化。

    1 材料與方法

    1.1 菌株和質(zhì)粒

    本研究涉及的菌株和質(zhì)粒如表1所示。

    表1 本研究涉及的菌株和質(zhì)粒

    1.2 培養(yǎng)基

    斜面培養(yǎng)基:葡萄糖 1 g,蛋白胨 10 g,牛肉膏 10 g,酵母粉 5 g,NaCl 2.5 g,溶于1 000 mL水中。

    種子培養(yǎng)基:葡萄糖 20 g,酵母粉 4 g,蛋白胨 3 g,K2HPO4·3H2O 1.2 g,MgSO4·7H2O 0.5 g,F(xiàn)eSO4·7H2O 20 mg,MnSO4·H2O 20 mg,VB1、VB3、VB5、VB12、VH各1 mg,溶于1 000 mL水中。

    發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖 20 g,酵母粉 5 g,蛋白胨 4 g, K2HPO4·3H2O 6 g,MgSO4·7H2O 1.5 g,F(xiàn)eSO4·7H2O 20 mg,MnSO4·H2O 20 mg,VB1、VB3、VB5、VB12、VH各2 mg溶于1 000 mL水中。木糖根據(jù)實驗需要酌情添加,詳見結(jié)果與分析部分。

    1.3 xylA基因敲除

    采用CRISPR/Cas9介導(dǎo)基因編輯方法敲除xylA基因,所涉及的引物如表2所示,操作過程參考文獻[14, 24]:以E.coliW3110基因組為模板,根據(jù)其xylA基因的上下游序列設(shè)計上游同源臂引物(UP-xylA-S、UP-xylA-A)和下游同源臂引物(DN-xylA-S、DN-xylA-A),并用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)擴增其上下游同源臂片段;上述片段通過重疊PCR的方法融合,獲得用于xylA基因敲除的重組片段,構(gòu)建pGRB-xylA質(zhì)粒使用的含靶序列的DNA片段通過引物gRNA-xylA-S和gRNA-xylA-A的退火制得。制備E.coliHIS1的感受態(tài)細胞,先將pREDCas9質(zhì)?;D(zhuǎn)至E.coliHIS1中后,再制備感受態(tài)同時將重組片段和pGRB-xylA質(zhì)粒同時電轉(zhuǎn)至感受態(tài)細胞中,于32 ℃培養(yǎng),待長出單菌落,經(jīng)菌落PCR鑒定篩選出陽性轉(zhuǎn)化子,再消除pGRB-xylA和pREDCas9質(zhì)粒,獲得菌株E.coliHIS1-1。

    表2 用于xylA基因敲除的引物

    1.4 培養(yǎng)方法

    搖瓶培養(yǎng):用接種環(huán)刮取1環(huán)斜面種子接種于裝有30 mL種子培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中,9層紗布封口,37 ℃,200 r/min振蕩培養(yǎng)8 h;按10%接種量接種到裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中(終體積為30 mL),9層紗布封口,37 ℃,200 r/min振蕩培養(yǎng),發(fā)酵過程中通過補加氨水維持pH在7.0~7.2;初始葡萄糖耗盡后,補加質(zhì)量濃度600 g/L葡萄糖溶液維持發(fā)酵進行。

    發(fā)酵罐培養(yǎng):取適量無菌水于茄形瓶中,將茄形瓶上的菌體刮下,然后將菌懸液接入種子培養(yǎng)基中,培養(yǎng)過程中通過自動流加質(zhì)量濃度為250 g/L的氨水,將pH穩(wěn)定在7.0左右,溫度恒定在35 ℃,溶氧在25%~35%,培養(yǎng)至發(fā)酵液OD600值達10~15。按照15%~20%接種量接入新鮮的發(fā)酵培養(yǎng)基,初始裝液量為3 L。發(fā)酵過程中通過自動流加250 g/L氨水控制pH穩(wěn)定在7.0左右,溫度維持在35 ℃,溶氧在25%~35%;當(dāng)溶氧值急速上升時,表明培養(yǎng)基中的葡萄糖耗盡,之后則根據(jù)溶氧的變化通過調(diào)整補糖速率自動流加質(zhì)量濃度為800 g/L的糖溶液,維持發(fā)酵培養(yǎng)基中的葡萄糖質(zhì)量濃度不超過3 g/L。

    1.5 檢測方法

    利用紫外分光光度計測量發(fā)酵液在600 nm 處的吸光度(OD600)表征生物量;采用SBA-40E系列生物傳感分析儀測定發(fā)酵液中葡萄糖濃度;采用高效液相色譜法(high performance liquid chromatography,HPLC)對發(fā)酵液中木糖濃度進行定量分析:所用儀器為島津液相色譜儀(SHIMADZU LC-20AT),色譜柱為Aminex?HPX-87H色譜柱(7.8 mm×30 0mm),檢測器為RID-20A檢測器,流動相為5 mmol/L H2SO4溶液,流速為1 mL/min;采用Sykam S-433D氨基酸分析儀檢測發(fā)酵液中L-組氨酸濃度,具體檢測按照廠商提供的標(biāo)準(zhǔn)操作流程進行。

    1.6 數(shù)據(jù)分析方法

    發(fā)酵數(shù)據(jù)代表3組平行發(fā)酵數(shù)據(jù)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。利用T檢驗雙尾分布對2組發(fā)酵參數(shù)進行單向方差分析。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 木糖添加量對L-組氨酸發(fā)酵的影響

    誘導(dǎo)劑濃度是影響誘導(dǎo)效果的一個重要因素,誘導(dǎo)劑濃度太低起不到誘導(dǎo)作用,而濃度太高可能導(dǎo)致目標(biāo)基因表達強度過大,蛋白合成耗費的資源以及局部反應(yīng)過強造成的代謝失衡,會限制菌體生長,影響產(chǎn)物的最終產(chǎn)量,對細胞有毒性的誘導(dǎo)劑如IPTG更需關(guān)注其使用量。本研究為了驗證木糖添加量對E.coliHIS1L-組氨酸發(fā)酵的影響,在搖瓶培養(yǎng)初始時向發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加質(zhì)量濃度為0、 5、10、15和20 g/L的木糖,其中不添加木糖組為對照組。發(fā)酵28 h后,檢測發(fā)酵液的OD600值和L-組氨酸的濃度,結(jié)果如圖1所示。

    圖1 不同木糖添加量對L-組氨酸發(fā)酵的影響

    由圖1可知,隨著木糖添加量的增加菌體生長呈現(xiàn)出逐漸降低的趨勢;L-組氨酸的產(chǎn)量則是先升高,至木糖添加量為10 g/L時,L-組氨酸的產(chǎn)量最高,木糖添加量進一步提高時,L-組氨酸的產(chǎn)量有降低的趨勢。結(jié)果表明,在一定范圍內(nèi),隨著木糖添加量的增加,菌體L-組氨酸的生產(chǎn)能力逐步提升,另外,不添加木糖時,菌體也可積累組氨酸,說明木糖誘導(dǎo)系統(tǒng)并不嚴(yán)謹(jǐn),存在滲漏表達。但是隨著木糖添加量的增大,菌體生長所受的抑制作用也越來越明顯,影響最終L-組氨酸的產(chǎn)量,原因在于增大木糖濃度后,誘導(dǎo)作用加強,關(guān)鍵酶過量表達,占用了細胞大量資源,L-組氨酸的合成也是一個十分耗能的過程,造成菌體生長受限??傮w來講,較佳的木糖添加量為10 g/L,此時L-組氨酸的產(chǎn)量為7.2 g/L,相較不添加木糖時,L-組氨酸的產(chǎn)量提高了24%,OD600值降低了16.8%。

    2.2 誘導(dǎo)時間對L-組氨酸發(fā)酵的影響

    鑒于誘導(dǎo)劑木糖的添加會同時影響L-組氨酸的積累和菌體生長,因此選擇一個較佳的誘導(dǎo)時間,更好地協(xié)調(diào)L-組氨酸的生成和菌體生長,將有利于最終L-組氨酸的產(chǎn)量提升。于是通過發(fā)酵罐發(fā)酵方法對木糖的添加時間進行了優(yōu)化。在發(fā)酵初始、8、16、24 h分別添加10 g/L的木糖,不添加木糖作為對照實驗,發(fā)酵60 h后,5種發(fā)酵條件下菌體生長曲線和L-組氨酸的產(chǎn)量對比情況如圖2所示。

    由圖2-B可知,在實驗條件下,不管何時添加木糖誘導(dǎo),L-組氨酸最終的產(chǎn)量普遍高于對照組,說明木糖誘導(dǎo)后,進一步促進了關(guān)鍵酶HisG*的表達,有利于L-組氨酸的生產(chǎn),其中8 h添加木糖效果最好,L-組氨酸的最高產(chǎn)量可達38.1 g/L,較對照組(28.2 g/L)提高了35.1%。但是由圖2-A可知,過早添加木糖會降低菌體生長速率,使最終生物量降低,特別是在0 h添加木糖后,發(fā)酵過程中的最高OD600值只有43,相比對照組的58,降低了25.9%,這也體現(xiàn)出L-組氨酸的合成與細胞生長的競爭關(guān)系。而過晚添加木糖(24 h),雖然避免了對菌體生長的影響作用,但是誘導(dǎo)效果受到影響,最終L-組氨酸的產(chǎn)量雖比不添加木糖時提高了17.8%,但是比8 h添加木糖時要低13.1%。值得注意的是,糖代謝轉(zhuǎn)錄抑制因子的編碼基因mlc突變,使得葡萄糖效應(yīng)解除[19],加之發(fā)酵過程中的葡萄糖質(zhì)量濃度較低,基本上處于“零殘?zhí)恰睜顟B(tài),因此所添加的木糖會被逐漸消耗。對發(fā)酵過程中木糖質(zhì)量濃度的檢測結(jié)果也顯示(如圖2-C所示,將添加木糖的時刻記為0),早期添加木糖時因為生物量低,菌活力不足,消耗的較慢,后期添加木糖時,木糖消耗速率較快,總體看來所添加的10 g/L木糖會在6~10 h耗盡。

    A-生長曲線;B-L-組氨酸生產(chǎn)曲線;C-木糖質(zhì)量濃度曲線圖2 不同發(fā)酵時期添加木糖對L-組氨酸發(fā)酵的影響

    2.3 木糖間隔補加或阻斷木糖代謝對L-組氨酸發(fā)酵的影響

    發(fā)酵過程中隨著木糖的消耗,會導(dǎo)致HisG*的表達強度逐漸減弱。本研究通過2種方法維持發(fā)酵液中的木糖質(zhì)量濃度,以保持誘導(dǎo)條件的相對穩(wěn)定:一種是增加木糖的添加次數(shù),另外一種方法便是敲除木糖異構(gòu)酶的編碼基因xylA阻斷木糖代謝途徑,構(gòu)建了菌株HIS1-1,用于L-組氨酸的發(fā)酵。xylA基因敲除時重組片段的構(gòu)建和陽性菌鑒定的電泳圖如圖3所示,其中上游同源臂長400 bp,下游同源臂長500 bp,重組片段長900 bp, 菌落PCR鑒定時,原菌片段長1 600 bp,陽性菌片段長900 bp。電泳圖顯示xylA基因敲除成功。

    HIS1和HIS1-1發(fā)酵罐發(fā)酵結(jié)果如圖4所示,其中HIS1發(fā)酵過程中,除了8 h添加10 g/L木糖外,每當(dāng)發(fā)酵液中木糖質(zhì)量濃度低于2 g/L時,便補加10 g/L,在實際的操作過程中基本上保持在每8 h添加1次木糖;HIS1-1的發(fā)酵過程中只在8 h添加10 g/L木糖;對照組所用菌株為HIS1,發(fā)酵時同樣只在8 h添加10 g/L木糖。結(jié)果顯示,3組實驗中葡萄糖的消耗速率大致相同(圖4-A)。從菌體生長趨勢上看,3組實驗中,對照組的菌體生長速率相對更快(圖4-B)。另外,敲除xlyA基因或多次添加木糖后,L-組氨酸的產(chǎn)量分別提高至43.3 g/L和48.2 g/L,相較于對照組的38.1 g/L,分別提高了13.6%和26.5%(圖4-C)。而多次添加木糖對L-組氨酸發(fā)酵的促進作用明顯優(yōu)于xlyA基因的敲除,說明木糖不僅通過誘導(dǎo)關(guān)鍵酶表達促進L-組氨酸的合成,木糖代謝也是有利于L-組氨酸的合成。這是因為在大腸桿菌中,木糖可通過木糖異構(gòu)酶作用形成木酮糖并隨后在木酮糖激酶的催化下形成木酮糖-5-磷酸進入戊糖磷酸途徑(pentose phosphate pathway,HMP)[25],也就是說HMP是木糖代謝的必經(jīng)途徑,L-組氨酸合成的重要前體物5-磷酸核糖-1-焦磷酸(5-phosphoribosyl-1-pyrophosphate,PRPP)則是HMP的衍生物。而大腸桿菌細胞中葡萄糖經(jīng)HMP代謝占比較小,因此相對于葡萄糖,通過木糖代謝更有利于提高L-組氨酸合成前體物PRPP的供應(yīng)。

    A-葡萄糖消耗曲線;B-生長曲線;C-L-組氨酸生產(chǎn)曲線圖4 木糖多次添加或xylA基因的敲除對L-組氨酸發(fā)酵的影響

    2.4 木糖連續(xù)補料對L-組氨酸發(fā)酵的影響

    在前述L-組氨酸的發(fā)酵過程中,木糖多次添加雖然可保證發(fā)酵液中始終存在木糖,以誘導(dǎo)HisG*的表達,但是木糖質(zhì)量濃度變化較大(0~12 g/L),誘導(dǎo)條件仍不穩(wěn)定。然而結(jié)果已經(jīng)表明木糖同時作為誘導(dǎo)劑和碳源可顯著促進L-組氨酸的生產(chǎn)。整個發(fā)酵過程中木糖消耗速率在1~2 g/(L·h),同葡萄糖消耗速率的比值約在1∶4~1∶7。為維持木糖質(zhì)量濃度,采取同時連續(xù)流加木糖和葡萄糖的方式進行L-組氨酸的發(fā)酵,其中流加所用的糖液參考葡萄糖和木糖的消耗速率進行配比,共分為4組進行比較:流加糖溶液的質(zhì)量濃度仍為800 g/L,而糖溶液中木糖(xylose)和葡萄糖(glucose)的質(zhì)量比(X∶G)分別為1∶4、1∶5、1∶6、1∶7,發(fā)酵結(jié)果如圖5所示。

    由圖5可知,在實驗條件范圍內(nèi),隨著流加糖中木糖比例的升高,菌體的生長呈現(xiàn)逐漸減慢的趨勢,但是區(qū)別并不明顯(圖5-B);而L-組氨酸的產(chǎn)量則隨著流加糖中木糖比例的升高逐漸提升(圖5-C)。當(dāng)流加木糖和葡萄糖的質(zhì)量比為1∶5的混合糖液時可以維持發(fā)酵液中木糖質(zhì)量濃度在8.5~12.5 g/L,流加糖中木糖的比例太高,木糖來不及消耗,所以發(fā)酵液中木糖質(zhì)量濃度會逐漸增大;流加糖中木糖比例太低則又會造成木糖的質(zhì)量濃度逐漸降低,影響誘導(dǎo)效果(圖5-A)。

    A-木糖質(zhì)量濃度曲線;B-生長曲線;C-L-組氨酸生產(chǎn)曲線圖5 流加糖溶液中木糖和葡萄糖的質(zhì)量比對L-組氨酸發(fā)酵的影響

    另外,本研究還對HIS1純葡萄糖發(fā)酵,HIS1-1發(fā)酵(發(fā)酵8 h時添加10 g/L木糖,木糖只作為誘導(dǎo)劑)和HIS1木糖葡萄糖共發(fā)酵(X∶G=1∶5)3種發(fā)酵方式總體的耗糖和L-組氨酸產(chǎn)量進行了比較,結(jié)果如表3所示。HIS1-1發(fā)酵和HIS1純葡萄糖發(fā)酵結(jié)果的不同主要是由于木糖的誘導(dǎo)作用帶來的;HIS1木糖葡萄糖共發(fā)酵與HIS1純葡萄糖發(fā)酵結(jié)果的不同是木糖同時作為誘導(dǎo)劑和碳源綜合作用的結(jié)果;而HIS1-1發(fā)酵(阻斷了木糖代謝途徑)和HIS1木糖葡萄糖共發(fā)酵結(jié)果的差異,則主要是由木糖作為碳源,參與L-組氨酸的合成造成的。如果將木糖和葡萄糖共發(fā)酵時葡萄糖至L-組氨酸的轉(zhuǎn)化率按照HIS1-1發(fā)酵時的轉(zhuǎn)化率來算(11.7%),消耗320 g/L的葡萄糖可生產(chǎn)37.4 g/L的L-組氨酸,余下的19.1 g/L的L-組氨酸則來源于73 g/L的木糖代謝,經(jīng)核算,木糖到L-組氨酸的轉(zhuǎn)化率竟高達26.2%,是葡萄糖的2.2倍,切實說明木糖代謝更利于L-組氨酸的合成。總體看來,木糖和葡萄糖共發(fā)酵(X∶G=1∶5)可以使HIS1的L-組氨酸產(chǎn)量由純葡萄糖發(fā)酵的28.2 g/L提高至56.5 g/L,產(chǎn)量提高了1倍,總的糖酸轉(zhuǎn)化率提高了77.8%。

    表3 不同發(fā)酵工藝L-組氨酸產(chǎn)量和耗糖情況

    3 結(jié)論

    為促進E.coliHIS1中組氨酸合成關(guān)鍵酶HisG*的表達,對誘導(dǎo)劑木糖的添加量,添加時間和添加方式進行了優(yōu)化。過程中發(fā)現(xiàn)木糖不僅可以作為誘導(dǎo)劑增強HisG*的轉(zhuǎn)錄表達以促進組氨酸的合成,木糖代謝本身也有利于L-組氨酸的合成,于是便提出了一種木糖和葡萄糖共發(fā)酵生產(chǎn)L-組氨酸的工藝方案:5 L發(fā)酵罐上培養(yǎng)E.coliHIS1,發(fā)酵8 h之后添加10 g/L的木糖,發(fā)酵過程中流加木糖和葡萄糖質(zhì)量比為1∶5的糖溶液,最終可發(fā)酵生產(chǎn)56.5 g/L的L-組氨酸,是現(xiàn)有報道的最高水平。木糖和葡萄糖共發(fā)酵相較于純葡萄糖發(fā)酵L-組氨酸產(chǎn)量提高了1倍,糖酸轉(zhuǎn)化率提高了77.8%,說明木糖同時作為誘導(dǎo)劑和碳源可顯著促進L-組氨酸的生產(chǎn)。木糖在細胞中的代謝速率較低,后期可通過強化菌種的木糖代謝途徑,以提高細胞的木糖代謝能力,有望進一步提高L-組氨酸的發(fā)酵效率。

    猜你喜歡
    組氨酸誘導(dǎo)劑木糖
    一個空瓶
    有心的小蘑菇
    間歇浸沒植物生物反應(yīng)器培養(yǎng)梔子愈傷組織及產(chǎn)藏紅花素條件研究
    布谷鳥讀信
    代謝工程改造大腸桿菌合成L-組氨酸
    組氨酸對番茄生長及微量元素濃度的影響
    中國蔬菜(2019年4期)2019-06-06 08:08:56
    誘導(dǎo)劑對乳白耙齒菌產(chǎn)MnP活性影響研究
    組氨酸的生理功能及在動物生產(chǎn)中的應(yīng)用
    中國飼料(2018年7期)2018-01-24 03:38:16
    英國警示含左炔諾孕酮的緊急避孕藥與肝酶誘導(dǎo)劑聯(lián)合使用可能降低緊急避孕效果
    過瘤胃蛋氨酸、賴氨酸和組氨酸對泌乳奶牛生產(chǎn)性能的影響
    飼料博覽(2016年7期)2016-04-05 14:20:34
    色吧在线观看| 最新中文字幕久久久久| 男人舔奶头视频| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 亚洲成人久久性| 身体一侧抽搐| 欧美三级亚洲精品| 国产爱豆传媒在线观看| 日韩精品青青久久久久久| 亚洲精品成人久久久久久| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 2021天堂中文幕一二区在线观| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 亚洲五月婷婷丁香| 日韩欧美在线二视频| 国产成+人综合+亚洲专区| 大型黄色视频在线免费观看| 午夜福利在线在线| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 免费大片18禁| 色精品久久人妻99蜜桃| 毛片女人毛片| 国产中年淑女户外野战色| 成年免费大片在线观看| 亚洲avbb在线观看| 欧美大码av| 国产探花在线观看一区二区| 欧美乱码精品一区二区三区| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 亚洲精品在线美女| 99国产极品粉嫩在线观看| 日本与韩国留学比较| 婷婷精品国产亚洲av在线| 亚洲乱码一区二区免费版| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 十八禁网站免费在线| 深爱激情五月婷婷| 亚洲五月天丁香| 成人性生交大片免费视频hd| www国产在线视频色| 亚洲天堂国产精品一区在线| 免费人成在线观看视频色| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 久久久久亚洲av毛片大全| 久久久成人免费电影| 成人无遮挡网站| 一进一出好大好爽视频| 午夜福利欧美成人| 热99在线观看视频| 亚洲内射少妇av| 一夜夜www| 中亚洲国语对白在线视频| 好男人在线观看高清免费视频| 久久久久性生活片| 亚洲国产精品久久男人天堂| 国产av麻豆久久久久久久| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 精品人妻偷拍中文字幕| 国产精品久久久人人做人人爽| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 国产亚洲欧美在线一区二区| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 日韩大尺度精品在线看网址| 此物有八面人人有两片| 听说在线观看完整版免费高清| 毛片女人毛片| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 看片在线看免费视频| 午夜福利高清视频| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 最新在线观看一区二区三区| 欧美日韩国产亚洲二区| 村上凉子中文字幕在线| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 色尼玛亚洲综合影院| 黄色成人免费大全| 国产91精品成人一区二区三区| 国产黄a三级三级三级人| svipshipincom国产片| 亚洲精品乱码久久久v下载方式 | 精品99又大又爽又粗少妇毛片 | 偷拍熟女少妇极品色| 日韩高清综合在线| 青草久久国产| 午夜福利视频1000在线观看| 日本一二三区视频观看| 午夜精品在线福利| 亚洲精品456在线播放app | 91久久精品国产一区二区成人 | 白带黄色成豆腐渣| 男女床上黄色一级片免费看| 99在线视频只有这里精品首页| 美女被艹到高潮喷水动态| 成人国产一区最新在线观看| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 欧美中文日本在线观看视频| 伊人久久精品亚洲午夜| 18禁国产床啪视频网站| 亚洲欧美日韩高清专用| 国产午夜精品论理片| 国产成人系列免费观看| 青草久久国产| 欧美乱码精品一区二区三区| 国产一区在线观看成人免费| 一个人观看的视频www高清免费观看| 亚洲国产精品久久男人天堂| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 老汉色av国产亚洲站长工具| 最近在线观看免费完整版| 一级毛片高清免费大全| 少妇丰满av| a在线观看视频网站| 欧美一级a爱片免费观看看| 久久精品人妻少妇| av视频在线观看入口| 亚洲国产精品久久男人天堂| 久久精品91蜜桃| 久久香蕉国产精品| 校园春色视频在线观看| 精品国产亚洲在线| 成人特级av手机在线观看| 99久久精品国产亚洲精品| 特级一级黄色大片| 岛国视频午夜一区免费看| 亚洲人与动物交配视频| 免费无遮挡裸体视频| 免费电影在线观看免费观看| 欧美色视频一区免费| 美女被艹到高潮喷水动态| 久久久久精品国产欧美久久久| 亚洲av第一区精品v没综合| 日本a在线网址| 熟女人妻精品中文字幕| 久久国产精品人妻蜜桃| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 欧美乱码精品一区二区三区| 亚洲一区二区三区色噜噜| 婷婷六月久久综合丁香| 香蕉丝袜av| 亚洲人与动物交配视频| 精品久久久久久久久久免费视频| 免费av不卡在线播放| 色噜噜av男人的天堂激情| 亚洲av一区综合| 国产淫片久久久久久久久 | 一边摸一边抽搐一进一小说| 免费在线观看亚洲国产| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 欧美最新免费一区二区三区 | 精品国产超薄肉色丝袜足j| 一区福利在线观看| 国产精品女同一区二区软件 | 免费高清视频大片| 男人的好看免费观看在线视频| 日韩欧美在线二视频| 国产伦在线观看视频一区| 午夜免费成人在线视频| 午夜免费激情av| a级一级毛片免费在线观看| av天堂在线播放| a级毛片a级免费在线| 亚洲国产精品成人综合色| 日韩有码中文字幕| www.熟女人妻精品国产| 欧美+日韩+精品| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 变态另类丝袜制服| a在线观看视频网站| 99热这里只有精品一区| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 男女午夜视频在线观看| 久久久国产精品麻豆| 黄色片一级片一级黄色片| 国产成人a区在线观看| 麻豆成人av在线观看| 精品国产三级普通话版| 成人午夜高清在线视频| 在线看三级毛片| 久久久久久久久中文| 我的老师免费观看完整版| 高清日韩中文字幕在线| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 99热这里只有精品一区| 757午夜福利合集在线观看| 亚洲国产精品sss在线观看| 国产一区二区三区在线臀色熟女| bbb黄色大片| 精品国内亚洲2022精品成人| 国内精品美女久久久久久| 五月玫瑰六月丁香| 午夜精品在线福利| 久久久久久久亚洲中文字幕 | 九九热线精品视视频播放| 久久久国产精品麻豆| 亚洲国产色片| 亚洲人成网站高清观看| 国产老妇女一区| 99久久精品热视频| 欧美在线一区亚洲| 免费看日本二区| 国产午夜精品论理片| 久久人人精品亚洲av| 精品久久久久久久毛片微露脸| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 看黄色毛片网站| 国产av在哪里看| 偷拍熟女少妇极品色| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 亚洲成人精品中文字幕电影| 午夜免费激情av| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 欧美黄色片欧美黄色片| 婷婷丁香在线五月| 午夜福利在线在线| 国产精品嫩草影院av在线观看 | 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 波野结衣二区三区在线 | 国产成人a区在线观看| 亚洲成人精品中文字幕电影| 青草久久国产| 少妇熟女aⅴ在线视频| 天堂动漫精品| 99久久综合精品五月天人人| 国内精品美女久久久久久| 在线观看美女被高潮喷水网站 | 99久久99久久久精品蜜桃| 色综合亚洲欧美另类图片| 操出白浆在线播放| 身体一侧抽搐| 日韩av在线大香蕉| netflix在线观看网站| 亚洲激情在线av| 99久久精品国产亚洲精品| 久久精品91蜜桃| 观看美女的网站| 成人一区二区视频在线观看| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 亚洲人与动物交配视频| 小说图片视频综合网站| 99久久无色码亚洲精品果冻| 窝窝影院91人妻| 国产免费av片在线观看野外av| 国产成人aa在线观看| 亚洲av五月六月丁香网| a级毛片a级免费在线| 亚洲天堂国产精品一区在线| 最好的美女福利视频网| 午夜激情欧美在线| 两个人的视频大全免费| 亚洲五月天丁香| 欧美日本视频| 国产成年人精品一区二区| 中出人妻视频一区二区| 嫩草影视91久久| 99riav亚洲国产免费| 国产伦一二天堂av在线观看| 国产精品,欧美在线| 亚洲一区高清亚洲精品| 亚洲专区中文字幕在线| www.www免费av| 搞女人的毛片| 欧美性猛交黑人性爽| 亚洲天堂国产精品一区在线| 亚洲国产精品sss在线观看| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 99视频精品全部免费 在线| 性色av乱码一区二区三区2| 日韩大尺度精品在线看网址| 亚洲片人在线观看| 午夜福利成人在线免费观看| 精品电影一区二区在线| 亚洲最大成人手机在线| 女同久久另类99精品国产91| 精品免费久久久久久久清纯| 日日夜夜操网爽| 精品国产三级普通话版| 欧美另类亚洲清纯唯美| 丁香欧美五月| 欧美中文日本在线观看视频| 亚洲 国产 在线| av在线天堂中文字幕| 国产69精品久久久久777片| 国产精品综合久久久久久久免费| 国产成人福利小说| 中出人妻视频一区二区| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 日韩有码中文字幕| 精品一区二区三区人妻视频| 成人无遮挡网站| 一个人看视频在线观看www免费 | 白带黄色成豆腐渣| 日日干狠狠操夜夜爽| 久久久久久久久中文| АⅤ资源中文在线天堂| 国产色爽女视频免费观看| 国产高清激情床上av| 亚洲欧美激情综合另类| 久久久久亚洲av毛片大全| tocl精华| 国内精品美女久久久久久| 日本 欧美在线| 国产在线精品亚洲第一网站| 亚洲国产精品sss在线观看| 午夜激情福利司机影院| 波多野结衣高清无吗| 日本一二三区视频观看| 精品国产亚洲在线| 日本一二三区视频观看| 国产午夜福利久久久久久| 老鸭窝网址在线观看| 99国产精品一区二区三区| 麻豆国产97在线/欧美| 最新美女视频免费是黄的| 美女免费视频网站| 又爽又黄无遮挡网站| 婷婷精品国产亚洲av在线| 一级作爱视频免费观看| 精品一区二区三区人妻视频| 最后的刺客免费高清国语| 岛国在线观看网站| 搡老妇女老女人老熟妇| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 叶爱在线成人免费视频播放| 久久久久久久久中文| 天堂√8在线中文| 久久人妻av系列| 国内揄拍国产精品人妻在线| 亚洲av不卡在线观看| 午夜影院日韩av| 国产成人av教育| 两个人的视频大全免费| 麻豆成人午夜福利视频| 成人特级黄色片久久久久久久| 亚洲黑人精品在线| av天堂中文字幕网| 老鸭窝网址在线观看| 婷婷亚洲欧美| 啪啪无遮挡十八禁网站| 精品福利观看| 亚洲精华国产精华精| 老司机在亚洲福利影院| 日日干狠狠操夜夜爽| 老司机深夜福利视频在线观看| 嫩草影院精品99| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 变态另类丝袜制服| 少妇的逼水好多| 免费高清视频大片| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 男女床上黄色一级片免费看| 最近最新中文字幕大全电影3| 午夜免费观看网址| 欧美大码av| 色吧在线观看| 亚洲av成人精品一区久久| 久久精品国产清高在天天线| 很黄的视频免费| 免费无遮挡裸体视频| 五月玫瑰六月丁香| 一进一出抽搐动态| 国产亚洲精品一区二区www| 一a级毛片在线观看| 久久午夜亚洲精品久久| 国产亚洲精品av在线| www.色视频.com| 亚洲成a人片在线一区二区| 国产精品98久久久久久宅男小说| 有码 亚洲区| 亚洲avbb在线观看| 12—13女人毛片做爰片一| or卡值多少钱| 无人区码免费观看不卡| 久久精品国产亚洲av涩爱 | 国产激情欧美一区二区| 国产主播在线观看一区二区| 国内精品久久久久久久电影| 亚洲精品亚洲一区二区| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 亚洲国产色片| 亚洲精品亚洲一区二区| 亚洲成a人片在线一区二区| 亚洲乱码一区二区免费版| 首页视频小说图片口味搜索| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 国产69精品久久久久777片| 免费看a级黄色片| 欧美3d第一页| 亚洲成人中文字幕在线播放| 亚洲人成网站在线播| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 久久精品国产自在天天线| 成人亚洲精品av一区二区| 在线观看一区二区三区| 国产久久久一区二区三区| 欧美午夜高清在线| 国产精品 欧美亚洲| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 日本三级黄在线观看| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 制服人妻中文乱码| 深夜精品福利| 国产激情偷乱视频一区二区| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 在线播放无遮挡| 最近视频中文字幕2019在线8| 国产熟女xx| а√天堂www在线а√下载| 欧美不卡视频在线免费观看| 嫩草影院入口| 成人特级黄色片久久久久久久| 亚洲最大成人手机在线| 老汉色∧v一级毛片| 免费观看的影片在线观看| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 午夜精品久久久久久毛片777| 久久久久久人人人人人| 欧美色欧美亚洲另类二区| 国产成人系列免费观看| 国产精品 欧美亚洲| 亚洲,欧美精品.| 欧美最黄视频在线播放免费| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 人人妻人人看人人澡| 亚洲性夜色夜夜综合| 欧美乱色亚洲激情| 久久亚洲真实| 人妻夜夜爽99麻豆av| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 人人妻人人澡欧美一区二区| 首页视频小说图片口味搜索| 久久亚洲精品不卡| 国内精品久久久久精免费| 哪里可以看免费的av片| 久久精品国产综合久久久| 一个人免费在线观看电影| 欧美不卡视频在线免费观看| 一区二区三区免费毛片| 日韩欧美 国产精品| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 欧美日本亚洲视频在线播放| 欧美中文日本在线观看视频| 久久99热这里只有精品18| 九色国产91popny在线| 国产国拍精品亚洲av在线观看 | 免费电影在线观看免费观看| 国内精品久久久久精免费| 国产色爽女视频免费观看| 精品久久久久久,| 午夜精品久久久久久毛片777| 一个人看的www免费观看视频| 久久久久久国产a免费观看| 国产精品一区二区免费欧美| 免费av毛片视频| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 久久人人精品亚洲av| 一进一出抽搐动态| 悠悠久久av| 日本一二三区视频观看| 又紧又爽又黄一区二区| 最近最新中文字幕大全免费视频| 少妇的逼水好多| 色综合站精品国产| 国内精品久久久久精免费| 黄片小视频在线播放| 欧美大码av| 国产精品av视频在线免费观看| 欧美另类亚洲清纯唯美| 88av欧美| 在线播放无遮挡| 一个人观看的视频www高清免费观看| 九九在线视频观看精品| 热99re8久久精品国产| 日本与韩国留学比较| 国产久久久一区二区三区| 国产成年人精品一区二区| 在线播放无遮挡| 久久久久久久精品吃奶| 麻豆久久精品国产亚洲av| 两个人视频免费观看高清| 国产老妇女一区| 在线观看日韩欧美| 3wmmmm亚洲av在线观看| 日韩大尺度精品在线看网址| 深爱激情五月婷婷| 中文亚洲av片在线观看爽| 精品一区二区三区视频在线 | 一进一出抽搐动态| 五月伊人婷婷丁香| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 嫩草影院精品99| 婷婷亚洲欧美| 成人av在线播放网站| 无遮挡黄片免费观看| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 久久精品影院6| 一个人看视频在线观看www免费 | 久久久久亚洲av毛片大全| 国产精品久久电影中文字幕| 免费高清视频大片| 国产精品乱码一区二三区的特点| 99riav亚洲国产免费| 男人舔奶头视频| 国产久久久一区二区三区| 长腿黑丝高跟| 欧美激情久久久久久爽电影| 亚洲成av人片免费观看| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 亚洲熟妇熟女久久| 亚洲欧美日韩东京热| 亚洲成av人片免费观看| 亚洲美女黄片视频| 日本一本二区三区精品| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 欧美日韩综合久久久久久 | 天天添夜夜摸| 一级黄色大片毛片| 可以在线观看的亚洲视频| 最新中文字幕久久久久| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 一夜夜www| 成年女人看的毛片在线观看| 欧美丝袜亚洲另类 | 久久人人精品亚洲av| av黄色大香蕉| 舔av片在线| 又紧又爽又黄一区二区| 99热6这里只有精品| 免费av毛片视频| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看 | 99久久久亚洲精品蜜臀av| 少妇的丰满在线观看| 日本精品一区二区三区蜜桃| 国产成+人综合+亚洲专区| 禁无遮挡网站| 国产野战对白在线观看| 精品久久久久久久久久免费视频| 51午夜福利影视在线观看| 全区人妻精品视频| 久久午夜亚洲精品久久| 日韩免费av在线播放| 午夜激情福利司机影院| 成熟少妇高潮喷水视频| 日本五十路高清| 欧美色欧美亚洲另类二区| 波多野结衣高清无吗| 国内精品久久久久久久电影| 99国产极品粉嫩在线观看| 国产视频内射| 亚洲精品日韩av片在线观看 | 亚洲av成人精品一区久久| 久久精品影院6| 国产精品野战在线观看| 精品久久久久久久毛片微露脸| 国产熟女xx| 日韩av在线大香蕉| 又紧又爽又黄一区二区| 亚洲av免费高清在线观看| av在线蜜桃| 一级黄片播放器| av天堂在线播放| 人妻久久中文字幕网| 国产伦精品一区二区三区视频9 | 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 亚洲第一电影网av| 国产精品精品国产色婷婷| 欧美日韩黄片免| 亚洲人成网站在线播| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 国产精品1区2区在线观看.| 女警被强在线播放| www.色视频.com| 欧美乱码精品一区二区三区| 日韩亚洲欧美综合| 搡女人真爽免费视频火全软件 | 国产亚洲欧美在线一区二区| 国产精品99久久99久久久不卡| 欧美色欧美亚洲另类二区| 国产精品一区二区三区四区久久| 岛国在线观看网站| 99热6这里只有精品| 宅男免费午夜| 岛国在线观看网站| 免费在线观看亚洲国产| 亚洲,欧美精品.| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 三级毛片av免费| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 无限看片的www在线观看| 成人性生交大片免费视频hd| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 久久久久免费精品人妻一区二区| 亚洲av免费高清在线观看| 日本 av在线| netflix在线观看网站| 禁无遮挡网站| 亚洲片人在线观看| 在线播放无遮挡| 欧美色视频一区免费| 国产精品久久久人人做人人爽| 久久久久免费精品人妻一区二区| 99在线视频只有这里精品首页| 久久亚洲精品不卡| 国产精品亚洲美女久久久| 熟女人妻精品中文字幕| 免费av毛片视频| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 欧美色欧美亚洲另类二区|