木糖和葡萄糖共發(fā)酵生產(chǎn)L-組氨酸

吳鶴云，張悅，蔣帥，田道光，謝希賢,2，陳寧,2*

1(天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院，天津，300457)2(代謝控制發(fā)酵技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實驗室，天津，300457)

L-組氨酸是一種重要的功能性氨基酸，具有抗炎[1]、抗氧化[2]和免疫調(diào)節(jié)[3]等多種生理功能，在醫(yī)藥[4]、保健食品[5]和飼料行業(yè)[6]有著廣闊的應(yīng)用前景。血粉等蛋白原料的水解提取是目前L-組氨酸的主要生產(chǎn)方法[7]，但是原料不易得，設(shè)備損失率高等因素制約了此法的生產(chǎn)規(guī)模，很難滿足日益增長的L-組氨酸市場需求。而發(fā)酵法生產(chǎn)氨基酸具有原料來源廣泛、反應(yīng)所需能耗低、環(huán)境友好等優(yōu)點[8]，適合工業(yè)化生產(chǎn)，成為L-組氨酸生產(chǎn)研究的主流方向。

高效生產(chǎn)L-組氨酸菌種的缺失是限制發(fā)酵法規(guī)模化生產(chǎn)L-組氨酸的主要因素，所以菌種改良仍舊是目前L-組氨酸發(fā)酵生產(chǎn)研究的重點，研究者也在通過誘變篩選或者代謝工程改造的方法持續(xù)改良L-組氨酸菌種的發(fā)酵性能[9-13]。這些研究通過解除L-組氨酸生物合成的調(diào)控作用，強化合成途徑，增強前體物供應(yīng)等策略的應(yīng)用，顯著提高了菌種L-組氨酸的生產(chǎn)能力。本實驗室前期通過CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因組編輯方法[14]直接改造大腸桿菌W3110的染色體，通過對組氨酸操縱子前導(dǎo)序列的替換，增加操縱子基因的拷貝數(shù)和引入外源解調(diào)控的HisG突變體[15](HisG*)，構(gòu)建了菌株EscherichiacoliHIS1，該菌L-組氨酸生物合成途徑所受調(diào)控作用已解除，L-組氨酸合成途徑被強化，具備了過量積累L-組氨酸的能力。

L-組氨酸生物合成最主要的限制因素是關(guān)鍵酶HisG所受的反饋抑制作用。許多研究者[16-17]致力于篩選解調(diào)控的HisG突變體，以促進L-組氨酸的過量合成。然而L-組氨酸的合成是一個十分耗能的過程，會占用細胞大量的資源[18]，所以HisG的活性過強則容易導(dǎo)致菌體的生長受限，反而會影響L-組氨酸的最終產(chǎn)量，于是如何在不妨礙菌體生長的前提下盡可能提高HisG的活性便成為菌株高效生產(chǎn)L-組氨酸的關(guān)鍵。使用誘導(dǎo)型啟動子啟動關(guān)鍵酶的表達，通過調(diào)整誘導(dǎo)劑濃度或誘導(dǎo)時間可調(diào)控菌體的生長和產(chǎn)物生成。NAKASHIMA等[19]通過在大腸桿菌基因組上引入T7RNA聚合酶，并用木糖誘導(dǎo)的啟動子PxylF啟動表達，同時對糖代謝轉(zhuǎn)錄抑制因子的編碼基因mlc進行點突變解除葡萄糖對木糖啟動子轉(zhuǎn)錄的阻遏作用，建立了一套木糖誘導(dǎo)的T7表達系統(tǒng)。該系統(tǒng)結(jié)合T7啟動子不僅可實現(xiàn)目的基因可控的強表達，還避免了質(zhì)粒的使用，且木糖作為誘導(dǎo)劑相比異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，TPTG)等常用誘導(dǎo)劑價格低廉。E.coliHIS1的構(gòu)建過程中便借鑒了NAKASHIMA等的研究成果，采用木糖誘導(dǎo)的T7表達系統(tǒng)控制L-組氨酸合成關(guān)鍵酶HisG*的表達。

發(fā)酵條件優(yōu)化是提高目標(biāo)產(chǎn)物發(fā)酵生產(chǎn)效率的重要方法[20-23]。本研究通過搖瓶和發(fā)酵罐培養(yǎng)的方式優(yōu)化了E.coliHIS1的發(fā)酵條件，主要對木糖的添加量，添加時間和添加方式進行了優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 菌株和質(zhì)粒

本研究涉及的菌株和質(zhì)粒如表1所示。

表1 本研究涉及的菌株和質(zhì)粒

1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：葡萄糖 1 g，蛋白胨 10 g，牛肉膏 10 g，酵母粉 5 g，NaCl 2.5 g,溶于1 000 mL水中。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖 20 g，酵母粉 4 g，蛋白胨 3 g，K2HPO4·3H2O 1.2 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 20 mg，MnSO4·H2O 20 mg，VB1、VB3、VB5、VB12、VH各1 mg，溶于1 000 mL水中。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖 20 g，酵母粉 5 g，蛋白胨 4 g， K2HPO4·3H2O 6 g，MgSO4·7H2O 1.5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 20 mg，MnSO4·H2O 20 mg，VB1、VB3、VB5、VB12、VH各2 mg溶于1 000 mL水中。木糖根據(jù)實驗需要酌情添加，詳見結(jié)果與分析部分。

1.3 xylA基因敲除

采用CRISPR/Cas9介導(dǎo)基因編輯方法敲除xylA基因，所涉及的引物如表2所示，操作過程參考文獻[14, 24]：以E.coliW3110基因組為模板，根據(jù)其xylA基因的上下游序列設(shè)計上游同源臂引物(UP-xylA-S、UP-xylA-A)和下游同源臂引物(DN-xylA-S、DN-xylA-A)，并用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)擴增其上下游同源臂片段；上述片段通過重疊PCR的方法融合，獲得用于xylA基因敲除的重組片段，構(gòu)建pGRB-xylA質(zhì)粒使用的含靶序列的DNA片段通過引物gRNA-xylA-S和gRNA-xylA-A的退火制得。制備E.coliHIS1的感受態(tài)細胞，先將pREDCas9質(zhì)?；D(zhuǎn)至E.coliHIS1中后，再制備感受態(tài)同時將重組片段和pGRB-xylA質(zhì)粒同時電轉(zhuǎn)至感受態(tài)細胞中，于32 ℃培養(yǎng)，待長出單菌落，經(jīng)菌落PCR鑒定篩選出陽性轉(zhuǎn)化子，再消除pGRB-xylA和pREDCas9質(zhì)粒，獲得菌株E.coliHIS1-1。

表2 用于xylA基因敲除的引物

1.4 培養(yǎng)方法

搖瓶培養(yǎng)：用接種環(huán)刮取1環(huán)斜面種子接種于裝有30 mL種子培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，9層紗布封口，37 ℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)8 h；按10%接種量接種到裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中(終體積為30 mL)，9層紗布封口，37 ℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)，發(fā)酵過程中通過補加氨水維持pH在7.0～7.2；初始葡萄糖耗盡后，補加質(zhì)量濃度600 g/L葡萄糖溶液維持發(fā)酵進行。

發(fā)酵罐培養(yǎng)：取適量無菌水于茄形瓶中，將茄形瓶上的菌體刮下，然后將菌懸液接入種子培養(yǎng)基中，培養(yǎng)過程中通過自動流加質(zhì)量濃度為250 g/L的氨水，將pH穩(wěn)定在7.0左右，溫度恒定在35 ℃，溶氧在25%～35%，培養(yǎng)至發(fā)酵液OD600值達10～15。按照15%～20%接種量接入新鮮的發(fā)酵培養(yǎng)基，初始裝液量為3 L。發(fā)酵過程中通過自動流加250 g/L氨水控制pH穩(wěn)定在7.0左右，溫度維持在35 ℃，溶氧在25%～35%；當(dāng)溶氧值急速上升時，表明培養(yǎng)基中的葡萄糖耗盡，之后則根據(jù)溶氧的變化通過調(diào)整補糖速率自動流加質(zhì)量濃度為800 g/L的糖溶液，維持發(fā)酵培養(yǎng)基中的葡萄糖質(zhì)量濃度不超過3 g/L。

1.5 檢測方法

利用紫外分光光度計測量發(fā)酵液在600 nm 處的吸光度(OD600)表征生物量；采用SBA-40E系列生物傳感分析儀測定發(fā)酵液中葡萄糖濃度；采用高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)對發(fā)酵液中木糖濃度進行定量分析：所用儀器為島津液相色譜儀(SHIMADZU LC-20AT)，色譜柱為Aminex?HPX-87H色譜柱(7.8 mm×30 0mm)，檢測器為RID-20A檢測器，流動相為5 mmol/L H2SO4溶液，流速為1 mL/min；采用Sykam S-433D氨基酸分析儀檢測發(fā)酵液中L-組氨酸濃度，具體檢測按照廠商提供的標(biāo)準(zhǔn)操作流程進行。

1.6 數(shù)據(jù)分析方法

發(fā)酵數(shù)據(jù)代表3組平行發(fā)酵數(shù)據(jù)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。利用T檢驗雙尾分布對2組發(fā)酵參數(shù)進行單向方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 木糖添加量對L-組氨酸發(fā)酵的影響

誘導(dǎo)劑濃度是影響誘導(dǎo)效果的一個重要因素，誘導(dǎo)劑濃度太低起不到誘導(dǎo)作用，而濃度太高可能導(dǎo)致目標(biāo)基因表達強度過大，蛋白合成耗費的資源以及局部反應(yīng)過強造成的代謝失衡，會限制菌體生長，影響產(chǎn)物的最終產(chǎn)量，對細胞有毒性的誘導(dǎo)劑如IPTG更需關(guān)注其使用量。本研究為了驗證木糖添加量對E.coliHIS1L-組氨酸發(fā)酵的影響，在搖瓶培養(yǎng)初始時向發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加質(zhì)量濃度為0、 5、10、15和20 g/L的木糖，其中不添加木糖組為對照組。發(fā)酵28 h后，檢測發(fā)酵液的OD600值和L-組氨酸的濃度，結(jié)果如圖1所示。

圖1 不同木糖添加量對L-組氨酸發(fā)酵的影響

由圖1可知，隨著木糖添加量的增加菌體生長呈現(xiàn)出逐漸降低的趨勢；L-組氨酸的產(chǎn)量則是先升高，至木糖添加量為10 g/L時，L-組氨酸的產(chǎn)量最高，木糖添加量進一步提高時，L-組氨酸的產(chǎn)量有降低的趨勢。結(jié)果表明，在一定范圍內(nèi)，隨著木糖添加量的增加，菌體L-組氨酸的生產(chǎn)能力逐步提升，另外，不添加木糖時，菌體也可積累組氨酸，說明木糖誘導(dǎo)系統(tǒng)并不嚴(yán)謹(jǐn)，存在滲漏表達。但是隨著木糖添加量的增大，菌體生長所受的抑制作用也越來越明顯，影響最終L-組氨酸的產(chǎn)量，原因在于增大木糖濃度后，誘導(dǎo)作用加強，關(guān)鍵酶過量表達，占用了細胞大量資源，L-組氨酸的合成也是一個十分耗能的過程，造成菌體生長受限?？傮w來講，較佳的木糖添加量為10 g/L，此時L-組氨酸的產(chǎn)量為7.2 g/L，相較不添加木糖時，L-組氨酸的產(chǎn)量提高了24%，OD600值降低了16.8%。

2.2 誘導(dǎo)時間對L-組氨酸發(fā)酵的影響

鑒于誘導(dǎo)劑木糖的添加會同時影響L-組氨酸的積累和菌體生長，因此選擇一個較佳的誘導(dǎo)時間，更好地協(xié)調(diào)L-組氨酸的生成和菌體生長，將有利于最終L-組氨酸的產(chǎn)量提升。于是通過發(fā)酵罐發(fā)酵方法對木糖的添加時間進行了優(yōu)化。在發(fā)酵初始、8、16、24 h分別添加10 g/L的木糖，不添加木糖作為對照實驗，發(fā)酵60 h后，5種發(fā)酵條件下菌體生長曲線和L-組氨酸的產(chǎn)量對比情況如圖2所示。

由圖2-B可知，在實驗條件下，不管何時添加木糖誘導(dǎo)，L-組氨酸最終的產(chǎn)量普遍高于對照組，說明木糖誘導(dǎo)后，進一步促進了關(guān)鍵酶HisG*的表達，有利于L-組氨酸的生產(chǎn)，其中8 h添加木糖效果最好，L-組氨酸的最高產(chǎn)量可達38.1 g/L，較對照組(28.2 g/L)提高了35.1%。但是由圖2-A可知，過早添加木糖會降低菌體生長速率，使最終生物量降低，特別是在0 h添加木糖后，發(fā)酵過程中的最高OD600值只有43，相比對照組的58，降低了25.9%，這也體現(xiàn)出L-組氨酸的合成與細胞生長的競爭關(guān)系。而過晚添加木糖(24 h)，雖然避免了對菌體生長的影響作用，但是誘導(dǎo)效果受到影響，最終L-組氨酸的產(chǎn)量雖比不添加木糖時提高了17.8%，但是比8 h添加木糖時要低13.1%。值得注意的是，糖代謝轉(zhuǎn)錄抑制因子的編碼基因mlc突變，使得葡萄糖效應(yīng)解除[19]，加之發(fā)酵過程中的葡萄糖質(zhì)量濃度較低，基本上處于“零殘?zhí)恰睜顟B(tài)，因此所添加的木糖會被逐漸消耗。對發(fā)酵過程中木糖質(zhì)量濃度的檢測結(jié)果也顯示(如圖2-C所示，將添加木糖的時刻記為0)，早期添加木糖時因為生物量低，菌活力不足，消耗的較慢，后期添加木糖時，木糖消耗速率較快，總體看來所添加的10 g/L木糖會在6～10 h耗盡。

A-生長曲線；B-L-組氨酸生產(chǎn)曲線；C-木糖質(zhì)量濃度曲線圖2 不同發(fā)酵時期添加木糖對L-組氨酸發(fā)酵的影響

2.3 木糖間隔補加或阻斷木糖代謝對L-組氨酸發(fā)酵的影響

發(fā)酵過程中隨著木糖的消耗，會導(dǎo)致HisG*的表達強度逐漸減弱。本研究通過2種方法維持發(fā)酵液中的木糖質(zhì)量濃度，以保持誘導(dǎo)條件的相對穩(wěn)定：一種是增加木糖的添加次數(shù)，另外一種方法便是敲除木糖異構(gòu)酶的編碼基因xylA阻斷木糖代謝途徑，構(gòu)建了菌株HIS1-1，用于L-組氨酸的發(fā)酵。xylA基因敲除時重組片段的構(gòu)建和陽性菌鑒定的電泳圖如圖3所示，其中上游同源臂長400 bp，下游同源臂長500 bp，重組片段長900 bp, 菌落PCR鑒定時，原菌片段長1 600 bp，陽性菌片段長900 bp。電泳圖顯示xylA基因敲除成功。

HIS1和HIS1-1發(fā)酵罐發(fā)酵結(jié)果如圖4所示，其中HIS1發(fā)酵過程中，除了8 h添加10 g/L木糖外，每當(dāng)發(fā)酵液中木糖質(zhì)量濃度低于2 g/L時，便補加10 g/L，在實際的操作過程中基本上保持在每8 h添加1次木糖；HIS1-1的發(fā)酵過程中只在8 h添加10 g/L木糖；對照組所用菌株為HIS1，發(fā)酵時同樣只在8 h添加10 g/L木糖。結(jié)果顯示，3組實驗中葡萄糖的消耗速率大致相同(圖4-A)。從菌體生長趨勢上看，3組實驗中，對照組的菌體生長速率相對更快(圖4-B)。另外，敲除xlyA基因或多次添加木糖后，L-組氨酸的產(chǎn)量分別提高至43.3 g/L和48.2 g/L，相較于對照組的38.1 g/L，分別提高了13.6%和26.5%(圖4-C)。而多次添加木糖對L-組氨酸發(fā)酵的促進作用明顯優(yōu)于xlyA基因的敲除，說明木糖不僅通過誘導(dǎo)關(guān)鍵酶表達促進L-組氨酸的合成，木糖代謝也是有利于L-組氨酸的合成。這是因為在大腸桿菌中，木糖可通過木糖異構(gòu)酶作用形成木酮糖并隨后在木酮糖激酶的催化下形成木酮糖-5-磷酸進入戊糖磷酸途徑(pentose phosphate pathway，HMP)[25]，也就是說HMP是木糖代謝的必經(jīng)途徑，L-組氨酸合成的重要前體物5-磷酸核糖-1-焦磷酸(5-phosphoribosyl-1-pyrophosphate,PRPP)則是HMP的衍生物。而大腸桿菌細胞中葡萄糖經(jīng)HMP代謝占比較小，因此相對于葡萄糖，通過木糖代謝更有利于提高L-組氨酸合成前體物PRPP的供應(yīng)。

A-葡萄糖消耗曲線；B-生長曲線；C-L-組氨酸生產(chǎn)曲線圖4 木糖多次添加或xylA基因的敲除對L-組氨酸發(fā)酵的影響

2.4 木糖連續(xù)補料對L-組氨酸發(fā)酵的影響

在前述L-組氨酸的發(fā)酵過程中，木糖多次添加雖然可保證發(fā)酵液中始終存在木糖，以誘導(dǎo)HisG*的表達，但是木糖質(zhì)量濃度變化較大(0～12 g/L)，誘導(dǎo)條件仍不穩(wěn)定。然而結(jié)果已經(jīng)表明木糖同時作為誘導(dǎo)劑和碳源可顯著促進L-組氨酸的生產(chǎn)。整個發(fā)酵過程中木糖消耗速率在1～2 g/(L·h)，同葡萄糖消耗速率的比值約在1∶4～1∶7。為維持木糖質(zhì)量濃度，采取同時連續(xù)流加木糖和葡萄糖的方式進行L-組氨酸的發(fā)酵，其中流加所用的糖液參考葡萄糖和木糖的消耗速率進行配比，共分為4組進行比較：流加糖溶液的質(zhì)量濃度仍為800 g/L，而糖溶液中木糖(xylose)和葡萄糖(glucose)的質(zhì)量比(X∶G)分別為1∶4、1∶5、1∶6、1∶7，發(fā)酵結(jié)果如圖5所示。

由圖5可知，在實驗條件范圍內(nèi)，隨著流加糖中木糖比例的升高，菌體的生長呈現(xiàn)逐漸減慢的趨勢，但是區(qū)別并不明顯(圖5-B)；而L-組氨酸的產(chǎn)量則隨著流加糖中木糖比例的升高逐漸提升(圖5-C)。當(dāng)流加木糖和葡萄糖的質(zhì)量比為1∶5的混合糖液時可以維持發(fā)酵液中木糖質(zhì)量濃度在8.5～12.5 g/L，流加糖中木糖的比例太高，木糖來不及消耗，所以發(fā)酵液中木糖質(zhì)量濃度會逐漸增大；流加糖中木糖比例太低則又會造成木糖的質(zhì)量濃度逐漸降低，影響誘導(dǎo)效果(圖5-A)。

A-木糖質(zhì)量濃度曲線；B-生長曲線；C-L-組氨酸生產(chǎn)曲線圖5 流加糖溶液中木糖和葡萄糖的質(zhì)量比對L-組氨酸發(fā)酵的影響

另外，本研究還對HIS1純葡萄糖發(fā)酵，HIS1-1發(fā)酵(發(fā)酵8 h時添加10 g/L木糖，木糖只作為誘導(dǎo)劑)和HIS1木糖葡萄糖共發(fā)酵(X∶G=1∶5)3種發(fā)酵方式總體的耗糖和L-組氨酸產(chǎn)量進行了比較，結(jié)果如表3所示。HIS1-1發(fā)酵和HIS1純葡萄糖發(fā)酵結(jié)果的不同主要是由于木糖的誘導(dǎo)作用帶來的；HIS1木糖葡萄糖共發(fā)酵與HIS1純葡萄糖發(fā)酵結(jié)果的不同是木糖同時作為誘導(dǎo)劑和碳源綜合作用的結(jié)果；而HIS1-1發(fā)酵(阻斷了木糖代謝途徑)和HIS1木糖葡萄糖共發(fā)酵結(jié)果的差異，則主要是由木糖作為碳源，參與L-組氨酸的合成造成的。如果將木糖和葡萄糖共發(fā)酵時葡萄糖至L-組氨酸的轉(zhuǎn)化率按照HIS1-1發(fā)酵時的轉(zhuǎn)化率來算(11.7%)，消耗320 g/L的葡萄糖可生產(chǎn)37.4 g/L的L-組氨酸，余下的19.1 g/L的L-組氨酸則來源于73 g/L的木糖代謝，經(jīng)核算，木糖到L-組氨酸的轉(zhuǎn)化率竟高達26.2%，是葡萄糖的2.2倍，切實說明木糖代謝更利于L-組氨酸的合成。總體看來，木糖和葡萄糖共發(fā)酵(X∶G=1∶5)可以使HIS1的L-組氨酸產(chǎn)量由純葡萄糖發(fā)酵的28.2 g/L提高至56.5 g/L，產(chǎn)量提高了1倍，總的糖酸轉(zhuǎn)化率提高了77.8%。

表3 不同發(fā)酵工藝L-組氨酸產(chǎn)量和耗糖情況

3 結(jié)論

為促進E.coliHIS1中組氨酸合成關(guān)鍵酶HisG*的表達，對誘導(dǎo)劑木糖的添加量，添加時間和添加方式進行了優(yōu)化。過程中發(fā)現(xiàn)木糖不僅可以作為誘導(dǎo)劑增強HisG*的轉(zhuǎn)錄表達以促進組氨酸的合成，木糖代謝本身也有利于L-組氨酸的合成，于是便提出了一種木糖和葡萄糖共發(fā)酵生產(chǎn)L-組氨酸的工藝方案：5 L發(fā)酵罐上培養(yǎng)E.coliHIS1，發(fā)酵8 h之后添加10 g/L的木糖，發(fā)酵過程中流加木糖和葡萄糖質(zhì)量比為1∶5的糖溶液，最終可發(fā)酵生產(chǎn)56.5 g/L的L-組氨酸，是現(xiàn)有報道的最高水平。木糖和葡萄糖共發(fā)酵相較于純葡萄糖發(fā)酵L-組氨酸產(chǎn)量提高了1倍，糖酸轉(zhuǎn)化率提高了77.8%，說明木糖同時作為誘導(dǎo)劑和碳源可顯著促進L-組氨酸的生產(chǎn)。木糖在細胞中的代謝速率較低，后期可通過強化菌種的木糖代謝途徑，以提高細胞的木糖代謝能力，有望進一步提高L-組氨酸的發(fā)酵效率。