乳酸菌緩解全氟辛烷磺酸暴露導(dǎo)致的肝臟和腸道損傷

孫姍姍，烏翛冰，楊樹(shù)榮，焦婷，司倩，王剛，趙建新，張灝，陳衛(wèi)

(江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫，214122)

全氟辛烷磺酸(perfluorooctane sulfonate, PFOS)作為典型全氟化合物(per-and polyfluoroalkyl substances，PFASs)，因?qū)岱€(wěn)定和化學(xué)穩(wěn)定性等被用于民用和工業(yè)方面[1]。PFOS難被降解，故可隨食物鏈在體內(nèi)積累[2]，造成肝臟損傷[3-4]，神經(jīng)毒性[5]，生殖、生長(zhǎng)發(fā)育毒性[6-7]，還與血脂、血壓及血糖[8-9]，高尿酸血癥等疾病相關(guān)[10]，已成為新型的環(huán)境污染物和內(nèi)分泌干擾物。

研究表明膽汁酸螯合劑消膽胺、槲皮素和葡萄籽提取物可緩解PFASs造成的肝臟損傷。PFASs可通過(guò)糞便、尿液排出，但也會(huì)在肝腸循環(huán)之后被重吸收，膽汁酸螯合劑消膽胺可阻礙膽汁酸的重吸收，緩解其毒害[11]，但此藥有副作用。抗氧化物質(zhì)槲皮素和葡萄籽提取物均可緩解機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)，減弱PFASs暴露引起的毒性損傷[12-13]。但這類物質(zhì)發(fā)揮作用的有效含量太高，且過(guò)量攝入微量元素及植物化合物對(duì)機(jī)體不利。而以乳酸菌為代表的益生菌在人體中具重要生理功能，研究表明乳酸菌具有優(yōu)良的抗氧化能力，可緩解鎘、銅等暴露導(dǎo)致的肝功能和腸道損傷[14-15]。但目前對(duì)PFOS造成的腸道損傷及乳酸菌緩解PFOS毒性的研究很少。因此，本研究探究了乳酸菌緩解PFOS暴露導(dǎo)致的腸道及肝臟損傷的能力。

分離自發(fā)酵食品的LactobacillusbulgaricusD2A49和LactobacillusbulgaricusDQHXNS3L9及分離自健康人腸道的PediococcuspentosaceusFSCDJY63L2和PediococcuspentosaceusJSNJPK1-1是4株不同來(lái)源的乳酸菌。本研究通過(guò)分析這4株乳酸菌緩解PFOS造成的腸道及肝臟損傷的能力，為乳酸菌防治PFOS毒性研究提供依據(jù)，同時(shí)為尋找安全有效緩解PFOS毒性的膳食方案奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)菌株

L.bulgaricusD2A49和L.bulgaricusDQHXNS3L9，P.pentosaceusFSCDJY63L2和P.pentosaceusJSNJPK1-1，均來(lái)源于江南大學(xué)生物技術(shù)中心菌種保藏庫(kù)，具體信息如表1所示。

表1 實(shí)驗(yàn)菌株的具體信息

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

PFOS(98%)，百靈威科技有限公司；總蛋白試劑盒，碧云天生物技術(shù)有限公司；緊密連接蛋白ZO-1、Occludin和Claudin-1 ELISA試劑盒，上海酶聯(lián)生物科技有限公司；腫瘤壞死因子α (TNF-α)、白介素1β(IL-1β)和白介素10(IL-10)檢測(cè)試劑盒,R&D公司。

1.3 儀器與設(shè)備

PB300-N電子天平，梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易(上海)有限公司;Free Zone真空冷凍干燥機(jī)，美國(guó)LABCONCO公司；Milli-Q水凈化系統(tǒng)，密理博(中國(guó))有限公司；Trace 1300氣質(zhì)聯(lián)用儀、Multiskan GO全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀，美國(guó)賽默飛世爾科技公司； BS-480全自動(dòng)生化分析儀，深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司。

1.4 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

實(shí)驗(yàn)選用36 只 6 周齡體重 20 g 左右的SPF級(jí)健康 C57BL/6J 雄鼠(上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，飼養(yǎng)于江南大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)江南大學(xué)實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(倫理審核編號(hào)：JN.No2019 0415c1200608[67])，根據(jù)江南大學(xué)動(dòng)物管理與使用委員會(huì)的規(guī)定(SYXK 2012-0002)和歐盟指導(dǎo)手冊(cè)(編號(hào)：2010/63/EU)開(kāi)展實(shí)驗(yàn)，為減少小鼠的痛苦，用戊巴比妥鈉將小鼠麻醉后進(jìn)行所有手術(shù)。小鼠隨機(jī)分成6組(4個(gè)菌株干預(yù)組、1個(gè)空白對(duì)照組和1個(gè)PFOS模型組)，溫度(22±2) ℃，濕度40%～60%，光照12 h晝夜循環(huán)，自由采食飼料和水。小鼠適應(yīng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將活化、擴(kuò)培的乳酸菌重懸于質(zhì)量濃度30 g/L的蔗糖溶液中使菌的終濃度為109CFU/mL，每只小鼠每天灌胃0.2 mL，PFOS模型組和空白對(duì)照組灌胃等量的30 g/L蔗糖溶液；PFOS溶解在超純水中，根據(jù)小鼠體重調(diào)整PFOS的每日灌胃量使小鼠每日PFOS暴露劑量達(dá)到3 μg/(g BW·d)，灌胃體積為0.2 mL，用等量的超純水灌胃空白對(duì)照組。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)流程如圖1所示。

圖1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)流程圖

1.5 檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.5.1 血清及組織收集

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，取新鮮糞便于-80 ℃冰箱保存。眼眶取血，室溫靜置2 h后以3 000 r/min離心15 min收集血清并保存于-80 ℃冰箱。取肝臟稱重，肝臟和結(jié)腸均分為兩部分，一部分于質(zhì)量濃度為40 g/L的多聚甲醛溶液中固定，另一部分于液氮中迅速冷凍后轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱。肝臟指數(shù)為小鼠肝臟質(zhì)量(g)占小鼠體重(100 g)的比例，計(jì)算如公式(1)所示：

(1)

式中：R，肝臟指數(shù)；m1，肝臟質(zhì)量，g；m2，小鼠體重，100 g。

1.5.2 肝臟、結(jié)腸病理學(xué)檢測(cè)

將固定在多聚甲醛中的肝臟和結(jié)腸，用75%、85%、 95%和100%(體積分?jǐn)?shù))的酒精依次脫水后，用二甲苯透明，用石蠟包埋，切成5 μm切片，并用蘇木精-伊紅(H&E)染色后鏡檢。

1.5.3 血清肝酶與肝臟炎癥水平測(cè)定

血清肝酶包括谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase，ALT), 谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase,AST), 堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)和γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(γ-glutamyl transferase,γ-GT)用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定。肝臟稱重后加入9倍質(zhì)量的生理鹽水，用組織破碎儀充分破碎后以5 000 r/min 的轉(zhuǎn)速離心10 min，得到質(zhì)量濃度為100 g/L的肝臟上清液按照試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定TNF-α和IL-1β含量。

1.5.4 結(jié)腸炎癥因子及緊密連接蛋白含量測(cè)定

將結(jié)腸稱重剪碎后，加入9倍質(zhì)量的生理鹽水，用組織破碎儀充分破碎，以5 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min，得到質(zhì)量濃度為100 g/L的結(jié)腸上清液。取結(jié)腸上清液按試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定TNF-α、IL-10、緊密連接蛋白ZO-1、Occludin和Claudin-1的含量。

1.5.5 小鼠糞便中短鏈脂肪酸含量測(cè)定

取50 mg冷凍干燥的小鼠糞便加入500 μL飽和 NaCl 溶液破碎，加入40 μL 10%(體積分?jǐn)?shù))的H2SO4振蕩酸化，加入1 mL乙醚，振蕩均勻后以12 000 r/min，4 ℃的條件離心 15 min萃取短鏈脂肪酸。取上層液體加入0.25 g無(wú)水硫酸鈉靜置后以12 000 r/min、4 ℃的條件離心15 min，取上清液于進(jìn)樣瓶中，采用外標(biāo)法全掃描模式于氣質(zhì)聯(lián)用儀測(cè)定短鏈脂肪酸(乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸和異戊酸)的含量(μmol/g)。

1.5.6 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，用GraphPad Prism 5 (GraphPad Software Inc.，San Diego, CA, USA)進(jìn)行處理，采用單因素方差分析(one-way ANOVA)和Dunnett’s post hoc事后檢驗(yàn)分析各組與PFOS模型組之間的差異，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 四株乳酸菌對(duì)小鼠肝臟指數(shù)和血清中肝酶含量的影響

如圖2所示，PFOS模型組肝臟指數(shù)與空白對(duì)照組相比顯著增加(P<0.05)。而4株乳酸菌均可顯著緩解由PFOS造成的肝臟腫大，其中P.pentosaceusJSNJPK1-1的效果最好，L.bulgaricusD2A49和P.pentosaceusFSCDJY63L2次之，L.bulgaricusDQHXNS3L9效果略差。

圖2 乳酸菌對(duì)PFOS暴露小鼠肝臟指數(shù)的影響

如表2所示，PFOS暴露后小鼠血清中ALT、AST、ALP、γ-GT的含量顯著增加(P<0.05)，L.bulgaricusD2A49干預(yù)使血清中ALT、AST、ALP的含量顯著降低(P<0.05)，L.bulgaricusDQHXNS3L9對(duì)AST、ALP的升高表現(xiàn)出緩解作用(P<0.05)，而P.pentosaceusFSCDJY63L2只顯著降低了血清ALP水平(P<0.05)，P.pentosaceusJSNJPK1-1對(duì)血清中AST和γ-GT水平表現(xiàn)出顯著降低作用(P<0.05)。因此，4株乳酸菌對(duì)血清肝酶含量的影響具有差異性，其中L.bulgaricusD2A49可恢復(fù)由PFOS暴露導(dǎo)致的血清ALT、AST和ALP升高，在緩解PFOS損傷方面效果較佳。

表2 乳酸菌對(duì)PFOS暴露小鼠血清肝酶的影響 單位：U/L

2.2 四株乳酸菌對(duì)小鼠肝臟病理及炎癥水平的影響

如圖3所示，PFOS模型組小鼠出現(xiàn)輕微地肝細(xì)胞水腫變性，細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞核逐漸溶解消失，而菌株干預(yù)組肝細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞水腫現(xiàn)象減輕，與血清中肝酶水平結(jié)果一致的是，L.bulgaricusD2A49干預(yù)后小鼠肝臟細(xì)胞排列最整齊，最接近空白對(duì)照組。

a-L. bulgaricus D2A49組；b-L. bulgaricus DQHXNS3L9組；c-PFOS模型組；d-P.pentosaceus FSCDJY63L2組；e-P. pentosaceus JSNSPK1-1組；f-空白對(duì)照組

TNF-α和IL-1β在調(diào)節(jié)免疫方面發(fā)揮重要作用[16-17]。如圖4所示， PFOS暴露后肝臟IL-1β水平降低，但與空白對(duì)照組無(wú)顯著差異，而4株乳酸菌干預(yù)組小鼠肝臟中IL-1β含量顯著升高(P<0.05)，這可能與小鼠機(jī)體免疫的反饋調(diào)節(jié)有關(guān)。PFOS暴露后肝臟TNF-α的水平與空白對(duì)照組沒(méi)有顯著變化，但出現(xiàn)降低趨勢(shì)，此結(jié)果與邢家潥[18]的研究一致，且MOLLENHAUER等[19]的研究發(fā)現(xiàn)在PFOS含量較低時(shí)[0.1 mg/(kg·d)]小鼠血清中TNF-α含量降低，這表明PFOS暴露導(dǎo)致了免疫系統(tǒng)的紊亂。L.bulgaricusD2A49和L.bulgaricusDQHXNS3L9干預(yù)后，小鼠肝臟的TNF-α含量顯著降低(P<0.05)，而P.pentosaceusFSCDJY63L2和P.pentosaceusJSNJPK1-1干預(yù)組TNF-α水平無(wú)顯著變化。2株保加利亞乳桿菌干預(yù)后小鼠的TNF-α降低，可能在一定程度上緩解了肝臟炎癥(圖5)。

圖4 乳酸菌對(duì)PFOS暴露小鼠肝臟IL-1β含量的影響

圖5 乳酸菌對(duì)PFOS暴露小鼠肝臟TNF-α含量的影響

2.3 四株乳酸菌對(duì)小鼠腸道病理及炎癥水平的影響

結(jié)腸病理結(jié)果如圖6所示，PFOS暴露后小鼠結(jié)腸中炎癥細(xì)胞增多，出現(xiàn)大塊炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，且杯狀細(xì)胞變大，排列不整齊，表現(xiàn)出病理性損傷。而4株乳酸菌干預(yù)后結(jié)腸炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少，且杯狀細(xì)胞的排列相對(duì)整齊。翟齊嘯[14]的研究表明，鎘暴露導(dǎo)致腸道中TNF-α的含量增多，造成腸道炎癥和腸道通透性增大。本研究中，PFOS暴露腸道TNF-α表現(xiàn)出與鎘暴露相似的結(jié)果，PFOS暴露后腸道中TNF-α的含量顯著升高(P<0.05)，如圖7所示，L.bulgaricusD2A49和L.bulgaricusDQHXNS3L9干預(yù)后小鼠腸道中TNF-α水平顯著降低(P<0.05)，而P.pentosaceusFSCDJY63L2、P.pentosaceusJSNJPK1-1干預(yù)后TNF-α的含量未有顯著變化。IL-10為抑炎因子，與多種疾病相關(guān)。有研究表明PFOS暴露后小鼠脾臟中IL-10含量有下降趨勢(shì)[20]，而在本研究中PFOS暴露后小鼠結(jié)腸中IL-10含量顯著下降(P<0.05)，表明結(jié)腸存在炎癥反應(yīng)。4株乳酸菌均可上調(diào)腸道中IL-10的含量，結(jié)合小鼠肝臟TNF-α和腸道中TNF-α、IL-10的變化來(lái)看，L.bulgaricusD2A49和L.bulgaricusDQHXNS3L9干預(yù)后小鼠的炎癥減弱，可緩解PFOS暴露引起的損傷(圖8)。

a-L. bulgaricus D2A49組；b-L. bulgaricus DQHXNS3L9組；c-PFOS模型組；d-P. pentosaceus FSCDJY63L2組；e-P. pentosaceus JSNSPK1-1組；f-空白對(duì)照組

圖7 乳酸菌對(duì)PFOS暴露小鼠結(jié)腸TNF-α含量的影響

圖8 乳酸菌對(duì)PFOS暴露小鼠結(jié)腸IL-10含量的影響

2.4 四株乳酸菌對(duì)小鼠結(jié)腸緊密連接蛋白水平的影響

MIR等[21]和 馬姝麗等[22]研究發(fā)現(xiàn)，腸道中 Occludin和 ZO-1含量下降后腸黏膜通透性發(fā)生改變，肝損傷加重。因此，PFOS導(dǎo)致的肝損傷，除PFOS直接作用肝臟導(dǎo)致肝毒害外，可能還存在PFOS暴露后腸道屏障破壞所導(dǎo)致的間接肝損傷。如圖9所示，PFOS暴露后腸道中緊密連接蛋白ZO-1、Occludin和Claudin-1的含量出現(xiàn)降低趨勢(shì)。4株乳酸菌均能顯著提高ZO-1的含量(P<0.05)；而4株菌對(duì)Occludin含量雖有提高趨勢(shì)但無(wú)顯著差異；只有L.bulgaricusD2A49和P.pentosaceusFSCDJY63L2能顯著提高Claudin-1的含量(P<0.05)。由此可知，L.bulgaricusD2A49和P.pentosaceusFSCDJY63L2可通過(guò)提高ZO-1和Claudin-1的水平保護(hù)腸道緊密連接，維持腸道屏障完整性，緩解PFOS毒性損傷。

a-ZO-1含量；b-Occludin含量；c-Claudin-1含量

2.5 四株乳酸菌對(duì)小鼠糞便短鏈脂肪酸的影響

短鏈脂肪酸具有重要的生理功能[23-26]。如表3所示，PFOS模型組和空白對(duì)照組相比，糞便中乙酸、丙酸和丁酸含量存在顯著差異(P<0.05)，4組菌株干預(yù)組均顯著提高了糞便中乙酸、丙酸和丁酸的含量(P<0.05)。其中，L.bulgaricusD2A49組丙酸和丁酸含量極顯著提高(P<0.01)，L.bulgaricusDQHXNS3L9組乙酸含量極顯著升高(P<0.001)，P.pentosaceusFSCDJY63L2組乙酸含量極顯著升高(P<0.01)，P.pentosaceusJSNJPK1-1組中乙酸和丙酸含量均極顯著升高(P<0.01)；只有L.bulgaricusD2A49組異丁酸含量顯著提高(P<0.05)；L.bulgaricusD2A49組和L.bulgaricusDQHXNS3L9組異戊酸含量顯著升高(P<0.05)，P.pentosaceusFSCDJY63L2組和P.pentosaceusJSNJPK1-1組異丁酸和異戊酸含量有上升趨勢(shì)但與PFOS模型組無(wú)顯著差異。綜上，PFOS暴露可降低糞便中短鏈脂肪酸的含量，而乳酸菌干預(yù)可部分恢復(fù)短鏈脂肪酸含量，其中L.bulgaricusDQHXNS3L9和L.bulgaricusD2A49組能上調(diào)乙酸、丙酸、丁酸和異戊酸的含量,減輕PFOS暴露對(duì)腸道造成的損傷。

表3 乳酸菌對(duì)PFOS暴露小鼠糞便短鏈脂肪酸含量的影響 單位： μmol/g

通過(guò)4株乳酸菌與空白對(duì)照組在各指標(biāo)間的主成分分析(principal components analysis，PCA)，我們進(jìn)一步綜合評(píng)價(jià)了4株乳酸菌緩解PFOS毒害的能力大小。如圖10所示，雖然從肝臟炎癥因子的水平來(lái)看，2株戊糖片球菌組對(duì)炎癥反應(yīng)的緩解效果優(yōu)于2株保加利亞乳桿菌，但綜合肝臟指數(shù)及血清肝酶含量、結(jié)腸緊密連接蛋白含量、短鏈脂肪酸及腸道炎癥因子相關(guān)指標(biāo)來(lái)看，保加利亞乳桿菌L.bulgaricusDQHXNS3L9和L.bulgaricusD2A49對(duì)于緩解PFOS毒性損傷的效果較佳。

a-肝重、血清肝酶；b-肝臟炎癥因子；c-腸道緊密連接蛋白；d-腸道短鏈脂肪酸；e-腸道炎癥因子

2.6 相關(guān)性分析

從各個(gè)指標(biāo)之間的相關(guān)性分析結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，丙酸與血清肝酶AST呈顯著負(fù)相關(guān)，乳酸菌干預(yù)后小鼠腸道中丙酸含量有所升高，影響血清肝酶AST含量與肝臟毒性的緩解有關(guān)。另外和大多研究相似的是，我們發(fā)現(xiàn)丙酸與結(jié)腸緊密連接蛋白Claudin-1、Occludin呈正相關(guān)，短鏈脂肪酸乙酸、丙酸及丁酸之間呈正相關(guān)，與腸道IL-10正相關(guān)，則乳酸菌干預(yù)后小鼠腸道緊密連接蛋白的變化會(huì)在一定程度上和丙酸含量的變化有關(guān)，另外血清中肝酶AST含量與ALT和ALP含量呈正相關(guān)，則乳酸菌干預(yù)后小鼠腸道內(nèi)丙酸增加會(huì)降低血清肝酶含量的增加，一定程度上緩解肝臟損傷。因此，從相關(guān)性分析的結(jié)果推測(cè)，乳酸菌可能通過(guò)調(diào)節(jié)腸道中短鏈脂肪酸的含量，進(jìn)一步影響腸道緊密連接蛋白含量和IL-10含量，從而緩解周身性炎癥，緩解肝臟等臟器損傷并使血清中肝酶AST、ALT和ALP含量下降(表4)。

表4 小鼠各指標(biāo)間的相關(guān)性

3 結(jié)論

4株乳酸菌在一定程度上均具有緩解PFOS暴露導(dǎo)致的毒性損傷的能力，其中，根據(jù)各組在各指標(biāo)間的PCA分析，我們發(fā)現(xiàn)L.bulgricusDQHXNS3L9和L.bulgricusD2A49緩解PFOS毒性損傷的效果最明顯，可以改善PFOS造成的肝臟指數(shù)升高、血清中肝酶含量升高、腸道炎癥水平升高及緊密連接蛋白含量下降，另外，相關(guān)性分析初步發(fā)現(xiàn)乳酸菌緩解PFOS毒性損傷可能是通過(guò)調(diào)節(jié)腸道短鏈脂肪酸的含量實(shí)現(xiàn)的，此結(jié)論還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。而乳酸菌在緩解PFOS損傷的效果存在菌株差異，尤其是2株保加利亞乳桿菌和2株戊糖片球菌在肝臟和腸道TNF-α水平上表現(xiàn)出不同的結(jié)果，這種差異還有待于結(jié)合乳酸菌各自的遺傳背景進(jìn)行深入研究。乳酸菌對(duì)PFOS毒性損傷的緩解也為開(kāi)發(fā)安全有效的緩解PFOS毒性的膳食方案提供了思路。