miR-125b在大鼠頸動(dòng)脈球囊損傷中的表達(dá)及其對(duì)血管平滑肌增殖和遷移的作用

王孝高　王穎　陳衛(wèi)國　王孝榮　余朝文　孫勇　唐文波　陳世遠(yuǎn)　官澤宇　高涌

【摘? 要】目的：分析microRNA-125b （miR-125b）在大鼠頸動(dòng)脈球囊損傷模型中的表達(dá)及其對(duì)血管平滑肌細(xì)胞（arterial smooth muscle cells，ASMCs）增殖和遷移的作用。方法：建立大鼠頸動(dòng)脈球囊損傷模型鼠，分離并培養(yǎng)ASMCs。使用腺病毒攜帶的miR-125b模擬物（mimics）轉(zhuǎn)染ASMCs，使用實(shí)時(shí)熒光定量多聚酶鏈反應(yīng)（real time quantitative-polymerase chain reaction，RT-PCR）檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后ASMCs中miR-125b表達(dá)水平。通過Cell Counting Kit-8檢測(cè)miR-125b對(duì)ASMCs增殖的影響;通過Transwell實(shí)驗(yàn)及劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-125b對(duì)ASMCs遷移能力的影響。結(jié)果：成功建立大鼠頸動(dòng)脈球囊損傷模型并制備頸動(dòng)脈ASMCs。轉(zhuǎn)染miR-125b mimics，miR-125b的表達(dá)顯著上調(diào)（P<0.001）。過表達(dá)miR-125b后，ASMCs的增殖及遷移能力減弱（P均<0.05）。結(jié)論：miR-125b可以抑制ASMCs增殖及遷移。

【關(guān)鍵詞】miR-125b;頸動(dòng)脈球囊損傷模型;血管平滑肌細(xì)胞;細(xì)胞增殖;細(xì)胞遷移

【中圖分類號(hào)】R54????? 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A????? 【文章編號(hào)】1672-3783（2020）09-0050-02

動(dòng)脈硬化（Atherosclerosis，AS）的發(fā)展過程主要有三個(gè)時(shí)期：動(dòng)脈內(nèi)膜脂質(zhì)斑紋期、纖維斑塊形成期以及粥樣斑塊形成期。粥樣斑塊形成期的AS常表現(xiàn)為有臨床癥狀的動(dòng)脈缺血性病變，具體有冠狀動(dòng)脈性心臟病、腦梗死及下肢動(dòng)脈硬化閉塞癥（atherosclerosis obliterans， ASO）等^[1]。粥樣斑塊形成期AS的患者治療難度大且生活質(zhì)量差^[2-3]_。

在動(dòng)脈硬化的發(fā)生發(fā)展過程中，動(dòng)脈血管壁平滑肌細(xì)胞（arterial smooth muscle cells，ASMCs）進(jìn)行的增殖以及平滑肌細(xì)胞細(xì)胞的遷移都起到十分關(guān)鍵的作用。期研究表明，微小核糖核酸（miR，miR）與ASMCs的增殖和遷移密切相關(guān)。如miR-1298下調(diào)可以通過靶向連接蛋白間接調(diào)控血管平滑肌細(xì)胞的增殖及遷移，在新生血管內(nèi)膜生長和功能中起到的作用^[4]。本研究通過探索miR-125b對(duì)ASMCs增殖和遷移的作用，以期為治療AS尋找新思路。

1 資料與方法

1.1 試驗(yàn)試劑及儀器

主要試劑有：Trizol （life technologies）、 M-MLV （promega）、 dNTPs （promega） 、Bulge-LoopTM miRNA （廣州銳博）、Rnase Inhibitor （promega） 、SYBR Master Mixture （TAKARA）、oligod T （上海 生工）、DMEM（Gibco）、Transwell試劑盒（Corning）、0.25%胰酶（上?；瘜W(xué)試劑公司）、胎牛血清（GIBCO）、胎牛血清 FBS（Ausbian）、結(jié)晶紫（生工生物工程股份有限公司）。主要儀器有：Real time PCR儀 （MX3000p Agilent公司）、Nanodrop分光光度計(jì)（2000/2000C Thermo）、96孔板（Cornning）、生物安全柜（Thermo）、酶標(biāo)儀（Tecan infinite）、CO2培養(yǎng)箱（SANYO）、熒光顯微鏡（奧林巴斯）、血球計(jì)數(shù)板（求精）、離心機(jī)（賽默飛世爾科技中國有限公司）、倒置顯微鏡（上海蔡康光學(xué)儀器有限公司）。

1.2獲取ASMCs

以Wistar大鼠為研究對(duì)象，10%水合氯醛腹腔注射麻醉（300mg/kg），解剖并游離頸動(dòng)脈，穿刺頸動(dòng)脈并將0.014mm 導(dǎo)絲插至膈肌水平，導(dǎo)絲引導(dǎo)下插入直徑1mm球囊，以0.10-0.15ml肝素生理鹽水充盈球囊，緩慢來回抽動(dòng)3次血管內(nèi)膜制備大鼠頸動(dòng)脈損傷模型。對(duì)照組大鼠同等條件下進(jìn)行麻醉及游離頸動(dòng)脈，但不經(jīng)過上述頸動(dòng)脈損傷處理，同樣條件下與實(shí)驗(yàn)組Wistar大鼠培養(yǎng)1周。處死并切取頸動(dòng)脈標(biāo)本，顯微器械分離去除血管內(nèi)膜及外膜獲得動(dòng)脈中層組織，采用眼科剪刀剪碎動(dòng)脈中層組織，剪成1mm²左右不規(guī)則碎片，再將碎片置于含有20%胎牛血清的M199培養(yǎng)基中，再將組織懸液置于15ml離心管中800轉(zhuǎn)/分室溫下離心5分鐘，去除上清液，收集動(dòng)脈中層組織碎片，待組織塊略干涸，緊貼瓶底后，加入2ml含20%胎牛血清的M199培養(yǎng)基，靜置培養(yǎng)直到增殖達(dá)到融合。平滑肌細(xì)胞原代培養(yǎng)存在多種形狀，常見的有帶狀、梭狀、星狀等，傳至第3代可獲得純化的動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞，應(yīng)用a-action免疫組化進(jìn)行平滑肌細(xì)胞的鑒定，獲取研究的ASMCs。

1.3 qRT-PCR

收集ASMCs，先以2000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，移除上清液留存細(xì)胞沉淀液，將1 mL Trizol加至細(xì)胞沉淀液，于室溫下?lián)u勻混合液，再靜置5分鐘，轉(zhuǎn)移至新的1.5 mL EP管中。EP管加入200微升氯仿，倒置后靜置10分鐘后，再以12800轉(zhuǎn)/分速度離心，再經(jīng)過一系列處理后，待RNA沉淀基本透明時(shí)，加入RNase-free水至完全溶解，Nanodrop 2000/2000C分光光度計(jì)分析測(cè)定所抽提RNA的濃度及質(zhì)量。RNA逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA：每1 nmoL引物加入RNase-free water 200μL，渦旋振蕩充分溶解，然后瞬時(shí)離心，配成終濃度為5μM引物儲(chǔ)存液。取5μM的RT引物儲(chǔ)存液1μL，加入79μL的RNase-free water，配制成62.5 nM的RT引物工作液。將2μL逆轉(zhuǎn)錄miR-125b引物（0.5μg/μL） 和2.0μg Total RNA 加入到 PCR 小管中， 補(bǔ)RNase-Free H2O至11μL;混勻后離心，70°C溫浴10 min;之后立即置于冰水混合物中冰浴，使逆轉(zhuǎn)錄引物和模板退火在上述混合物中按下表的比例，在冰浴中進(jìn)行反應(yīng)體系（25μL 體系）配制，混勻，短暫離心。上述體系在42°C水浴反應(yīng)1h，然后在70°C水浴10 min使RT酶失活，將得到的逆轉(zhuǎn)錄miR-125b cDNA，置于-20°C保存?zhèn)溆?。?μLOligo dT（0.5μg/μL）和2.0μg Total RNA加入到PCR小管中，補(bǔ)充RNase-Free H2O至10μL，混勻后離心，70°C溫浴，10 min，之后立即置于冰水混合物中冰浴，使Oligo dT和模板退火，按下表的比例配制反應(yīng)體系（冰上進(jìn)行），混勻，短暫離心。miR-125b類似物序列：正向引物 5'-GCGCTCCCTGAGACCCTAAC-3'，反向引物 5'-TGCAGGGTCCGAGGTAT- 3'。最后應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量多聚酶鏈反應(yīng)（real time quantitative-polymerase chain reaction，RT-PCR）檢測(cè)miR-125b的表達(dá)，采用SDS2.4軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，Ct閾值設(shè)為0.2，對(duì)miR-125b在頸動(dòng)脈損傷模型大鼠ASMCs表達(dá)進(jìn)行分析。

1.4 ASMCs細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-125 mimics

將1×10⁵細(xì)胞置于24孔板中培養(yǎng)至貼壁，加入含6μg/ml嘌呤的培養(yǎng)基培養(yǎng)，并加入適量含miR-125b mimics的病毒，轉(zhuǎn)染4小時(shí)后加新鮮培養(yǎng)基稀釋嘌呤。繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)后用新鮮培養(yǎng)基替換含嘌呤的培養(yǎng)基，48小時(shí)后使用qRT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。

1.5 CCK-8檢測(cè)

將ASMCs置于96孔板中，分為對(duì)照組和miR-125b組，培養(yǎng)24小時(shí)后加入CCK-8試劑，并孵育1-4小時(shí)。最后酶標(biāo)儀測(cè)定在450nm處的吸光度。

1.6 細(xì)胞Transwell試驗(yàn)及劃痕試驗(yàn)

將ASMCs加入Transwell上室，使用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，分為對(duì)照組和miR-125b組。在24孔板中加入10%胎牛血清的培養(yǎng)基。將小室置于24孔板中培養(yǎng)6-8小時(shí)后取出上室，固定、染色，顯微鏡下計(jì)數(shù)遷移細(xì)胞數(shù)。

先在12孔背面劃上兩條橫線，將1.5×10⁵細(xì)胞置于12孔板中，分為對(duì)照組和miR-125b組。待細(xì)胞貼壁后劃痕并拍照，培養(yǎng)24h后拍照，計(jì)算劃痕遷移率。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS18.0軟件進(jìn)行處理，應(yīng)用t檢驗(yàn)分析兩組樣本間的數(shù)據(jù)。P<0.05表示差異顯著，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ASMCs中過表達(dá)miR-125b

從構(gòu)建的15只Wistar大鼠頸動(dòng)脈球囊損傷模型中提取ASMCs，并使用miR-125b轉(zhuǎn)染ASMCs。使用qRT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率發(fā)現(xiàn)，miR-125b在miR-125b組的表達(dá)約是其在對(duì)照組的2.3倍（P<0.001）（圖1，表1）。

2.2 過表達(dá)miR-125b對(duì)ASMCs增殖的影響

使用CCK8實(shí)驗(yàn)比較miR-125b組和對(duì)照組ASMCs的增殖能力，結(jié)果顯示miR-125b組的OD450/fold值約是對(duì)照組的0.469倍（P<0.001）（圖2，表1）。這提示miR-125b可抑制ASMCs的增殖。

2.3 過表達(dá)miR-125b對(duì)ASMCs遷移的影響

使用劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell遷移實(shí)驗(yàn)比較miR-125b組和對(duì)照組ASMCs的遷移能力。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示miR-125b組的劃痕遷移率約是對(duì)照組的的0.881倍（P=0.009）（圖3A，表1）。Transwell遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示miR-125b組的細(xì)胞遷移倍數(shù)約是對(duì)照組的的0.716倍倍（P<0.001）（圖3B，表1）。兩組實(shí)驗(yàn)均提示miR-125b可抑制ASMCs的遷移。

3 討論

動(dòng)脈硬化的病理生理過程是一個(gè)多機(jī)制參與的復(fù)雜過程，其中微小核糖酸是該過程的重要調(diào)節(jié)因子。miR-125b在乳腺癌、膀胱癌及肝癌等腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移中發(fā)揮作用。動(dòng)脈硬化的發(fā)展過程和腫瘤轉(zhuǎn)移有相似之處，如ASMCs過度增殖、遷移導(dǎo)致血管內(nèi)膜增厚。因此我們推測(cè)miR-125b在ASMCs的增殖和遷移過程中亦發(fā)揮作用。

近年來，越來越多的證據(jù)表明，microRNA可以通過調(diào)節(jié)VSMCs而影響AS的發(fā)生和發(fā)展。先前的研究已經(jīng)證實(shí)miR-21，miR-1298和miR-22-3p參與了AS的發(fā)病機(jī)制。例如，miR-21可以通過靶向磷酸酶和張力蛋白同源物（phosphatase and tensin homolog，PTEN）來調(diào)節(jié)VSMC的增殖和遷移，從而影響AS的發(fā)病機(jī)理和進(jìn)程。miR-1298的缺失與AS的CpG甲基化有關(guān)，而miR-1298的下調(diào)通過直接靶向連接蛋白43（connexin-43）來調(diào)節(jié)VSMC的增殖和遷移^[10]。miR-22-3p可靶向高機(jī)動(dòng)性組合箱-1 （high mobility group box-1，HMGB1）而抑制ASMCs的遷移和增生能力。

綜述所述，以Wistar大鼠為研究對(duì)象，以球囊摩擦方法制備大鼠頸動(dòng)脈損傷模型是可行的。

參考文獻(xiàn)

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基金項(xiàng)目：

蚌埠醫(yī)學(xué)院自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目（BYKY1862ZD）;安徽省高校自然科學(xué)重大項(xiàng)目（KJ2016SD38）;安徽省科技攻關(guān)項(xiàng)目：（201904a07020020）