苗藥課幣有水溶性黃酮的純化*

趙學(xué)芬，何席呈，2，杜汪洋，譚 波，張 婷，吳珊珊，杜 江，2▲

(1貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽 550025；2貴州省苗醫(yī)藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550025；3貴州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，貴州 貴陽 550025)

苗藥課幣有(kod bit vud)來源于天南星科植物一把傘南星Arisaemaerubescens(Wall.) Schott的塊莖[1]。多生于海拔3200米以下的林下、灌叢及陰濕的溝谷里；其植物除西北、西藏外，大部分省都有分布[2]。苗醫(yī)認(rèn)為課幣有(kod bit vud)味麻、辣，性熱；有毒，入冷經(jīng)，走中、里兩關(guān)，入腦、身兩架；具有敗毒，清風(fēng)毒，止痙，化痰散結(jié)的功能[3]?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，Arisaemaerubescens(Wall.) Schott(A.erubescens)的化學(xué)成分有：黃酮類[4]、脂肪酸[5]、生物堿[6-8]、揮發(fā)性成分[9]等；具有抗腫瘤[12]、抗氧化[13]、抗驚厥[14]、鎮(zhèn)痛[15]等藥理作用。為研究挖掘苗藥課幣有的使用價(jià)值，本文研究利用聚酰胺樹脂的氫鍵吸附作用，純化課幣有(kod bit vud)中水溶性黃酮的最優(yōu)工藝條件。

1 實(shí)驗(yàn)器材

1.1 儀器

MS105DU分析天平(梅特勒)、DK-98-Ⅱ數(shù)顯恒溫水浴鍋(天津市泰斯特儀器有限公司)、L530R離心機(jī)(長沙高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)湘儀離心機(jī)儀器有限公司)、UV-1800紫外分光光度儀(島津)等。

1.2 試藥

實(shí)驗(yàn)中用的藥材飲片，采購于貴陽太升藥材市場，經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)鑒定教研室劉曉龍老師鑒定為天南星科一把傘南星Arisaemaerubescens(Wall.) Schott.的塊莖；芹菜素對照品(廠家：貴州迪大生物科技有限責(zé)任公司，CAS NO：520-36-5)；實(shí)驗(yàn)過程中使用的水均為蒸餾水，無水乙醇、三乙胺均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 水溶性黃酮含量的測定

參照2015年版《中國藥典》一部天南星項(xiàng)下含量測定方法測定[15]。

2.1.1 對照品溶液的制備

精密稱取芹菜素對照品12.06 mg，置100 mL量瓶中，加0.1%三乙胺的60%乙醇溶液使溶解，并定容至刻度，搖勻，精密量取該溶液1 mL，于10 mL量瓶中，加0.1%三乙胺的60%乙醇溶液至刻度，搖勻，即得濃度為12.06 μg·mL-1的溶液。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密量取對照品溶液1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL，分別置10 mL量瓶中，各加60%乙醇溶液至5 mL，加1%三乙胺溶液至刻度，搖勻，以相應(yīng)試劑為空白，按照紫外-可見分光光度法(通則0401)，在400 nm波長處測定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，芹菜素濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其線性回歸方程為：y=0.059x+0.0056，相關(guān)系數(shù)r=0.9999，線性范圍為2.412～12.06 μg·mL-1。

2.2 水溶性黃酮純化工藝優(yōu)選

2.2.1 水溶性黃酮溶液的制備

取藥材粉末(過二號篩)12.0 g，精密稱定，加水240 mL，搖勻，在45 ℃的恒溫水浴鍋中加熱90 min，時(shí)時(shí)振搖；取出，放冷至室溫，離心(4000 r·min-1，10 min)，取上清液；殘?jiān)偌铀?40 mL，在同樣條件下再提取一次；合并兩次上清液，加水至600 mL，搖勻，即得。

2.2.2 聚酰胺樹脂預(yù)處理

將聚酰胺樹脂用濕法裝柱后，先用95%乙醇沖洗至流出液置蒸發(fā)皿中蒸干無殘?jiān)?，再分別用80%乙醇溶液、60%乙醇溶液、40%乙醇溶液、20%乙醇溶液各3個(gè)柱體積沖洗，最后用蒸餾水沖洗，至流出液無醇味，即可。

2.2.3 聚酰胺樹脂的動態(tài)吸附考察

取5 mL已處理的聚酰胺樹脂，以1 mL·min-1的流速加入水溶性黃酮溶液，溶液共計(jì)200 mL，收集流出液，每一個(gè)柱體積收集一份。將收集的流出液離心(4000 r·min-1，10 min)，精密量取上清液2 mL，照2.1.2項(xiàng)下自“置10 mL量瓶中，加水至5 mL……”依法測定。以柱體積為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制聚酰胺樹脂動態(tài)泄漏曲線，見圖1。結(jié)果表明，上樣水溶性黃酮溶液5個(gè)柱體積，聚酰胺樹脂出現(xiàn)明顯的泄漏。

圖1 聚酰胺動態(tài)泄漏曲線Fig.1 Dynamic leakage curve of polyamide

2.2.4 聚酰胺柱流速考察

分別取5 mL已處理的聚酰胺樹脂于直徑為1.5 cm的層析柱中，分別以流速：1 mL·min-1、2 mL·min-1、3 mL·min-1、4 mL·min-1加入水溶性黃酮溶液溶液各70 mL，收集流出液，照2.2.3項(xiàng)下的方法進(jìn)行測定。繪制不同流速聚酰胺樹脂的泄漏曲線，見圖2。結(jié)果顯示，在直徑為1.5 cm的層析柱中，以1 mL·min-1的流速上樣，聚酰胺樹脂泄漏緩慢，即以流速/直徑比為0.67時(shí)上樣，動態(tài)吸附能力最優(yōu)。

圖2 不同流速聚酰胺泄漏曲線Fig.2 Polyamide leakage curves of different flow rates

2.2.5 洗脫溶劑考察

依次以20%、40%、60%、80%、95%乙醇濃度，以流速1 mL·min-1洗脫上樣的聚酰胺柱各3個(gè)柱體積，收集不同濃度下洗脫液，分別以相應(yīng)溶劑定容至25 mL，搖勻；照2.2.3項(xiàng)下的方法進(jìn)行測定繪制洗脫曲線。見圖3。結(jié)果顯示，以乙醇濃度為60%的溶液洗脫，黃酮的累積洗脫量最高，故選擇60%乙醇溶液洗脫劑。

圖3 洗脫溶劑考察Fig.3 Investigation on the elution solvent

2.3 二次上樣的理論計(jì)算

根據(jù)圖1可知，連續(xù)上樣原液5個(gè)柱體積以后，聚酰胺層析柱吸附速率出現(xiàn)明顯下降，泄漏量增多，但層析柱還保有較多的吸附能力，本實(shí)驗(yàn)嘗試對此進(jìn)行優(yōu)化。根據(jù)動態(tài)泄漏曲線的結(jié)果，在上樣的每一時(shí)刻，將流出液重新加入層析柱中，由于流出液中目標(biāo)物質(zhì)濃度較低，使得該濃度下單位柱體積目標(biāo)物的量低于此時(shí)的吸附速率，那么理論上就不會有發(fā)生泄漏，從而流出液不必再做回收處理。如表1表2所示，上樣原液9個(gè)柱體積原液時(shí)，可最大限度利用樹脂的吸附能力；當(dāng)上樣原液10個(gè)柱體積時(shí)，采用二次上樣方法，聚酰胺樹脂理論上開始泄漏。

表1 一次上樣動態(tài)泄漏Tab.1 Dynamic leakage of the first sample loading

表2 二次上樣理論泄漏量Tab.2 Theoretical leakage of the second sample loading

2.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

2.4.1 樣品溶液的制備及含量測定

精密稱取藥材粉末(過二號篩)20.0123 g，加水400 mL，混勻，置于45 ℃的恒溫水浴鍋中加熱90 min，時(shí)時(shí)振搖；取出，放冷至室溫，離心10 min(4000 r·min-1)，取上清液，另存；殘?jiān)铀?00 mL，在同一條件下重復(fù)提取一次；合并兩次上清液，加水至1000 mL，搖勻，即得。精密量取其溶液2 mL，依法測定吸光度。結(jié)果以芹菜素計(jì)，溶液中黃酮含量為23.84 mg。樣品總膏重為4.4560 g，樣品含量為0.54%。

2.4.2 聚酰胺樹脂的純化

取110 mL聚酰胺樹脂于直徑為5.5 cm的層析柱中，用5倍柱體積蒸餾水沖洗，以3.7 mL·min-1的流速(流速/直徑為0.67)，加入樣品溶液共計(jì)950 mL(約9倍柱體積)，收集流出液，混合均勻，重新上樣到層析柱中；收集流出液，混合均勻，精密量取2 mL，依法測定吸光度為0.0810，說明流出液無目標(biāo)物。

以60%乙醇溶液作洗脫溶劑，以一個(gè)柱體積為單位收集洗脫液，分別精密量取洗脫液2 mL，依法測定繪制曲線，見圖4。結(jié)果表明5個(gè)柱體積洗脫效果較好。

圖4 洗脫溶劑體積考察Fig.4 Investigation on the volume of the elution solvent

純化后的樣品總量為48.0 mg；以相同方法測定吸光度，以芹菜素計(jì)，黃酮含量為18.86%，純度提高了34倍。

3 討論

運(yùn)用聚酰胺樹脂純化苗藥課幣有中水溶性黃酮，最優(yōu)條件為：采用二次上樣的方法，原液上樣9個(gè)柱體積，流速/直徑比為0.67，以60%乙醇溶液作洗脫劑，洗脫5個(gè)柱體積。經(jīng)放大22倍驗(yàn)證，二次上樣后幾乎無目標(biāo)物泄漏，水溶性黃酮含量比純化前提高了34倍。

運(yùn)用二次上樣的方法，能最大程度上利用樹脂和樣品，減少對流出液的后續(xù)處理步驟，極大提高了純化效率。本實(shí)驗(yàn)通過聚酰胺對課幣有中水溶性黃酮進(jìn)行富集與純化，為下一步更深入的研究奠定了基礎(chǔ)。