寧夏養(yǎng)雞場(chǎng)糞污及周邊土壤重金屬和細(xì)菌群落特征研究

張俊華，賈萍萍，劉吉利*，孫媛，尚天浩

（1.寧夏大學(xué)環(huán)境工程研究院，銀川750021；2.寧夏大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，銀川750021）

我國(guó)是畜禽養(yǎng)殖大國(guó)，每年都會(huì)產(chǎn)生大量畜禽糞便，其中規(guī)模化畜禽養(yǎng)殖產(chǎn)生新鮮糞便約1.019×109t[1]。畜禽糞便中含有大量有機(jī)質(zhì)和養(yǎng)分，可以改善土壤養(yǎng)分循環(huán)，提高作物產(chǎn)量，保持和改善土壤質(zhì)量，但同時(shí)也可能會(huì)引起重金屬污染或病原菌入侵，導(dǎo)致環(huán)境污染和健康風(fēng)險(xiǎn)[2]。

養(yǎng)殖場(chǎng)糞便中的重金屬與畜禽疾病預(yù)防、促進(jìn)生長(zhǎng)的飼料添加劑或獸藥有關(guān)[3]。畜禽糞便重金屬殘留是成品有機(jī)肥中重金屬污染的主要來(lái)源[4]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)每年生產(chǎn)飼料使用的微量元素添加劑約為15萬(wàn)～18萬(wàn)t，大約有10萬(wàn)t未被動(dòng)物利用而隨著畜禽糞便進(jìn)入環(huán)境[5]。倪治華等[6]收集了浙江省商品有機(jī)肥、農(nóng)家堆肥和畜禽糞便樣品檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，浙江商品有機(jī)肥平均合格率為72.5%，而重金屬超標(biāo)是產(chǎn)品不合格的主要原因。目前全國(guó)商品雞糞中Cd、Pb 和Cr 超標(biāo)率分別為10.3%、17.2%和17.2%，Cu、Zn 含量是20世紀(jì)90 年代初的1.5～16.2 倍[7]。養(yǎng)殖場(chǎng)糞污中Cu 和Zn 含量普遍較高，已成為一個(gè)世界性問(wèn)題[8]。在黑土中施用化肥和畜禽糞便有機(jī)肥3 a 后，土壤中Zn 含量高于對(duì)照土壤和單施化肥處理[9]。黑土和紅壤上有機(jī)肥與化肥配施與不施肥對(duì)照相比土壤Cu、Zn 和Cd含量顯著提高[10]。調(diào)查表明畜禽糞便農(nóng)用區(qū)小麥中的Cr、Ni、Cd 和As 均存在不同程度超標(biāo)情況，其中雞糞農(nóng)用區(qū)Cr 的超標(biāo)率達(dá)66.67%[3]?！锻寥牢廴痉乐涡袆?dòng)計(jì)劃》中也明確指出“要鼓勵(lì)農(nóng)民增施有機(jī)肥并減少化肥用量，合理使用化肥農(nóng)藥”，但連續(xù)大量施用畜禽糞便、有機(jī)肥勢(shì)必會(huì)向土壤-植物系統(tǒng)帶入大量外源重金屬元素，從而對(duì)土壤質(zhì)量造成負(fù)面影響，甚至威脅農(nóng)產(chǎn)品安全[11-12]。

畜禽糞便中攜帶的病原微生物主要包括細(xì)菌、病毒和寄生蟲(chóng)等，其中致病菌的種類(lèi)及數(shù)量最為豐富，且對(duì)動(dòng)物及人體的健康存在極大的威脅，其中大腸桿菌（Escherichi coli）、沙門(mén)氏菌（Salmonellai）、賈第鞭毛蟲(chóng)（Giardia）、彎曲桿菌（Campylobacter）、微小隱孢子蟲(chóng)（Cryptosporidim parvum）、結(jié)核桿菌（Mycobacterium tuberculosis）、炭疽桿菌（Bacillus anthracis）、馬爾他布魯氏菌（Brucella melitensis）和金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）等都是養(yǎng)殖場(chǎng)糞污中常見(jiàn)的致病菌[13]。這些致病菌直接或間接地威脅著人類(lèi)的健康[14]。Bloem 等[15]指出養(yǎng)殖場(chǎng)有機(jī)肥可以提高土壤中有機(jī)磷的含量和磷素利用率，但也會(huì)帶來(lái)有害金屬和病原菌。土壤中高濃度NH+4能夠顯著抑制病原微生物的生長(zhǎng)[16]。有機(jī)肥種類(lèi)不同或施用量不同對(duì)土壤中微生物相對(duì)含量有一定影響[17]，如雞糞施用量為30 t·hm-2和60 t·hm-2的土壤中微生物總量及各菌群生物量均高于其他處理[18]。養(yǎng)殖場(chǎng)糞污中重金屬含量與其微生物多樣性及優(yōu)勢(shì)種群的數(shù)量是否有關(guān)，也有待進(jìn)一步研究。

養(yǎng)殖場(chǎng)堆肥中的重金屬含量與新鮮糞污中的重金屬含量密切相關(guān)[6]。隨著養(yǎng)殖時(shí)間的推移，雞糞中重金屬和細(xì)菌群落有無(wú)規(guī)律性變化？養(yǎng)雞場(chǎng)的存在對(duì)周邊土壤中重金屬含量和細(xì)菌群落有無(wú)影響？針對(duì)這些問(wèn)題，本文以寧夏最大的蛋雞養(yǎng)殖區(qū)為例，開(kāi)展了不同養(yǎng)殖時(shí)期雞糞中7 種重金屬含量和細(xì)菌群落狀況分析研究，分析不同養(yǎng)殖期雞糞中重金屬含量水平及變化規(guī)律，明確養(yǎng)殖場(chǎng)對(duì)周邊土壤重金屬含量和細(xì)菌群落多樣性及組成的影響程度，揭示雞糞、土壤理化性質(zhì)、重金屬和細(xì)菌群落之間的關(guān)系，以期為當(dāng)?shù)氐半u飼料添加劑的科學(xué)規(guī)范使用以及雞糞有機(jī)肥施用的安全風(fēng)險(xiǎn)控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 采樣點(diǎn)概況及樣品采集

寧夏中衛(wèi)市沙坡頭區(qū)宣和鎮(zhèn)是全區(qū)蛋雞養(yǎng)殖存欄量最大的鄉(xiāng)鎮(zhèn)。本研究在宣和鎮(zhèn)選取有代表性的不同規(guī)模蛋雞養(yǎng)殖場(chǎng)12 家（其中養(yǎng)殖規(guī)模在5 000～30 000 只的3 家，30 000～100 000 只的9 家，主要品種為海蘭褐和京紅等）。同一養(yǎng)殖場(chǎng)相同養(yǎng)殖時(shí)間作為同一個(gè)處理，每個(gè)處理取樣時(shí)取3 個(gè)樣充分混合為一個(gè)樣，所有養(yǎng)殖場(chǎng)共采集新鮮糞污樣品（以下均簡(jiǎn)稱(chēng)雞糞）29 個(gè)。為了便于分析，按照蛋雞生長(zhǎng)期將不同養(yǎng)殖場(chǎng)所有雞糞樣品歸為5 個(gè)時(shí)期，分別為育雛期（P1）、育成期（P2）、初產(chǎn)期（P3）、高產(chǎn)期（P4）和終產(chǎn)期（P5）。具體各養(yǎng)殖場(chǎng)雞糞采集信息見(jiàn)表1。

為了探究養(yǎng)殖場(chǎng)的存在是否對(duì)其周邊土壤重金屬和細(xì)菌群落有影響，本研究選擇了建場(chǎng)時(shí)間較長(zhǎng)、衛(wèi)生條件很差的2 戶(hù)傳統(tǒng)小規(guī)模養(yǎng)雞場(chǎng)（其他規(guī)模較大的養(yǎng)雞場(chǎng)均遠(yuǎn)離居民區(qū)，且建場(chǎng)時(shí)間普遍少于10 a），均坐落在宣和鎮(zhèn)三營(yíng)村農(nóng)戶(hù)居住區(qū)邊緣，建場(chǎng)養(yǎng)殖分別為13 a 和11 a，規(guī)模較?。ū３衷? 000～15 000只），糞污處理為干清糞，每月清理一次（其他養(yǎng)雞場(chǎng)均為一日清理一次或兩次），每年只消毒2～3次。兩家養(yǎng)雞場(chǎng)旁都有一條排水溝，土壤取自排水溝邊（無(wú)人為添加任何肥料）。分別在距離養(yǎng)殖場(chǎng)20、50、100、200 m和300 m 處各采集表層土壤（0～20 cm）作為養(yǎng)殖場(chǎng)周邊土壤樣品。然后采集施用了雞糞的蔬菜地土壤表層樣品18 個(gè)（一般都在養(yǎng)殖場(chǎng)院內(nèi)，具體采樣信息見(jiàn)表1）。此外，在遠(yuǎn)離所有養(yǎng)殖場(chǎng)5 km處且沒(méi)有施用過(guò)任何肥料的荒地上采集對(duì)照土樣3個(gè)。土樣均采用多點(diǎn)混合取樣，每個(gè)樣品約1 kg。

采集的雞糞和土壤樣品均分為2 份，一份新鮮樣品冷凍于-20 ℃冰箱用于細(xì)菌群落組成和多樣性的測(cè)定，一份在塑料盤(pán)中剔除雜質(zhì)后自然風(fēng)干，一部分用木槌研磨后過(guò)尼龍篩用于樣品基本理化性狀的測(cè)定，剩余部分用陶瓷研缽研磨后過(guò)尼龍篩用于重金屬的測(cè)定。

1.2 指標(biāo)的測(cè)定

1.2.1 基本理化性質(zhì)的測(cè)定

在水∶樣品=5∶1 的條件下采用酸度計(jì)法和電導(dǎo)法測(cè)定土壤和雞糞pH 和電導(dǎo)率（EC）；有機(jī)質(zhì)采用重鉻酸鉀容量法-外加熱法測(cè)定；全N、全P 和全K 采用H2SO4-H2O2消解，全N 用凱氏定氮儀測(cè)定，全P 采用釩鉬黃比色法測(cè)定，全K采用火焰光度法測(cè)定。本研究雞糞和土壤的基本理化性狀如表2所示。

1.2.2 重金屬的測(cè)定

稱(chēng)取10.00 g 樣品，置于干燥具塞三角瓶中，加入DTPA 浸提劑20 mL，蓋緊瓶塞，于25 ℃±2.5 ℃溫度下振蕩2 h 后立即過(guò)濾，在48 h 內(nèi)用原子吸收分光光度計(jì)測(cè)定Cu和Zn的含量。

稱(chēng)取0.100 0 g 過(guò)100 目篩樣品于消煮管中，加入8 mL 王水（HCl∶HNO3=3∶1，體積比）并將管口封閉，冷消化過(guò)夜。次日使用密閉式微波消解法進(jìn)行樣品消解，待冷卻后將消解液轉(zhuǎn)移并進(jìn)行過(guò)濾。最后消解液中Cd、Pb 和Cr 的含量使用石墨爐原子吸收分光光度計(jì)測(cè)定，Hg 和As 含量使用氫化物發(fā)生原子熒光光度計(jì)測(cè)定。在整個(gè)測(cè)定過(guò)程中通過(guò)平行測(cè)定、加入空白樣和國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)參比物質(zhì)進(jìn)行全程質(zhì)量控制。

表1 雞糞和土壤樣品信息Table 1 The information of poultry manure and soil

表2 雞糞和土壤的基本理化性狀Table 2 The physiochemical properties of poultry manure and soil

1.2.3 細(xì)菌群落多樣性及組成測(cè)定

樣品DNA 提?。好總€(gè)樣品取0.5 g 提取DNA，本試驗(yàn)采用FastDNA?SPIN Kit For Soil 試劑盒提取雞糞和土壤微生物基因組DNA，按說(shuō)明書(shū)操作步驟進(jìn)行。用1%的瓊脂糖凝膠檢驗(yàn)DNA 純度。DNA 濃度用NanoDrop（ND-2000）檢測(cè)。

Illumina HiSeq 測(cè)序及數(shù)據(jù)分析：將雞糞和土壤樣品送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行16S rDNA 高通量測(cè)序，雞糞細(xì)菌的通量引物序列為338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′）和806r（5′-GGACTAC HVGGGTWTCTAAT-3′），土壤細(xì)菌的通量所用引物為515f（GTGCCAGCMGCCGCGGTAA）和806r（GGACTA CHVGGGTWTCTAAT）。

微生物測(cè)序指數(shù)等的分析：Illumina MiseqTM得到的原始圖像數(shù)據(jù)文件經(jīng)CASAVA 堿基識(shí)別（Base calling）分析轉(zhuǎn)化為原始測(cè)序序列（Sequenced reads，文中簡(jiǎn)寫(xiě)為Sequence）。將所有樣本序列按照序列間的距離進(jìn)行聚類(lèi)，后根據(jù)序列之間的相似性將序列分成不同的操作分類(lèi)單元（OTU）。通常在97%的相似水平下對(duì)OTU 進(jìn)行生物信息統(tǒng)計(jì)分析。在OTU 聚類(lèi)結(jié)果的基礎(chǔ)上，獲取OTU 聚類(lèi)中的代表性序列，選擇豐度最高的序列作為OTU 的代表性序列。細(xì)菌群落各多樣性指數(shù)算法如下：

式中：Sobs為實(shí)際觀(guān)測(cè)到的OTU 數(shù)；ni為第i個(gè)OTU 包含的序列數(shù)；N為所有個(gè)體數(shù)目，此處為序列總數(shù)。

式中：Chao1 為估計(jì)的OTU 數(shù)；Sobs為實(shí)際觀(guān)測(cè)到的OTU 數(shù)；n1為只含有一條序列的OTU 數(shù)目；n2為只含有兩條序列的OTU數(shù)目。

式中：Sobs為實(shí)際觀(guān)測(cè)到的OTU 數(shù)；ni為第i個(gè)OTU 包含的序列數(shù)；N為所有個(gè)體數(shù)目，此處為序列總數(shù)。

1.3 重金屬污染評(píng)價(jià)

本研究運(yùn)用單因子指數(shù)法和內(nèi)梅羅綜合污染指數(shù)法[19]對(duì)雞糞和土壤中重金屬含量進(jìn)行污染評(píng)價(jià)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用SAS進(jìn)行數(shù)據(jù)的方差比較，采用LSD 法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。利用R對(duì)物種分類(lèi)學(xué)統(tǒng)計(jì)結(jié)果進(jìn)行作圖；利用R的gplots package 作物種豐度熱圖。雞糞和土壤中微生物群落組成與土壤理化性質(zhì)、重金屬之間的Pearson 相關(guān)性分析采用SPSS 13.0 計(jì)算。圖表中數(shù)據(jù)均為相同處理的平均值。

2 結(jié)果與討論

2.1 雞糞及養(yǎng)雞場(chǎng)周邊土壤中重金屬含量

2.1.1 雞糞中重金屬含量

寧夏蛋雞養(yǎng)殖場(chǎng)雞糞中Cu、Cd、Cr、Pb、Hg 和As含量都較低（表3），其平均值分別比全國(guó)雞糞平均值[7]低67.06%、86.00%、90.13%、93.23%、88.24% 和26.83%；而Zn 含量比全國(guó)雞糞平均值高28.74%。參考我國(guó)有機(jī)肥料中重金屬限量標(biāo)準(zhǔn)[20]和德國(guó)有機(jī)肥料中重金屬限量標(biāo)準(zhǔn)[21]，Zn含量超過(guò)德國(guó)有機(jī)肥料中重金屬限量標(biāo)準(zhǔn)6.94%，其他6種重金屬則都未超標(biāo)。Zn 可以提高畜禽生殖能力，增強(qiáng)免疫力，調(diào)節(jié)食欲，加快畜禽生長(zhǎng)[22]；所以蛋雞飼料中Zn 是最常用的添加劑之一。Zn 是生物必需的營(yíng)養(yǎng)元素，當(dāng)土壤中的Zn 供給不足時(shí)，農(nóng)作物及畜產(chǎn)品的產(chǎn)量和質(zhì)量都會(huì)受到影響，而我國(guó)北方石灰性土壤Zn 含量偏低[23]，所以施用雞糞可能有助于提升農(nóng)產(chǎn)品Zn 含量，從而在一定程度上解決缺Zn 問(wèn)題。但長(zhǎng)期施用高含量Zn雞糞是否會(huì)導(dǎo)致土壤Zn 污染，從而進(jìn)入食物鏈影響人體健康還需要繼續(xù)監(jiān)測(cè)。

2.1.2 不同養(yǎng)殖期雞糞中重金屬差異

隨著養(yǎng)殖時(shí)間的推移，雞糞中Cu、Cd 和As 含量均先減少后增加（圖1），但As 增幅較Cu 和Cd 更大，終產(chǎn)期雞糞As 含量居全養(yǎng)殖期之首。Zn 和Cr 則呈減少-增加-減少變化，但Zn含量除了育成期外，其他4 個(gè)養(yǎng)殖期含量差異均未達(dá)到顯著水平；Cr 含量在整個(gè)產(chǎn)蛋期差異很小，與育雛期和育成期均呈顯著差異。育雛期Cu、Zn、Cd 和Hg 含量在全養(yǎng)殖期都相對(duì)最高，尤其是Hg 含量比其他4 個(gè)時(shí)期的平均值高142.05%。這是由于雛雞生長(zhǎng)發(fā)育迅速，代謝旺盛，但消化器官容積小，消化能力弱，且該時(shí)期飼料中常含有石灰礦石粉、多種維生素和多種微量元素及載體[24]，所以雛雞重金屬排出體外的量較其他時(shí)期大。Hg 能起到殺菌作用，但對(duì)動(dòng)物的毒性很大，家禽對(duì)其非常敏感，中毒后的雛禽表現(xiàn)為消瘦、厭食、生長(zhǎng)發(fā)育受阻[22]。據(jù)檢測(cè)，雞飼料的主要原料玉米、麩皮、豆粕、花生粕、棉籽粕、DDGS 和微量元素預(yù)混料中Hg 的檢出率均為100%[25]。因此，要特別注意飼料原料中Hg 元素的污染超標(biāo)情況，尤其是育雛期。育成期雞糞Cu、Zn、Cr、Pb 和As 含量均最低。育成雞食欲旺盛，生長(zhǎng)迅速，消化機(jī)能逐漸健全，采食量與日俱增，此時(shí)日糧中粗蛋白質(zhì)含量較育雛期低，飼料一般為濃縮料加入粉碎的玉米和麩皮[24]，故該時(shí)期雞糞中的重金屬含量最低。

表3 雞糞中重金屬含量Table 3 Heavy metal contents of poultry manure

2.1.3 雞糞中重金屬污染評(píng)價(jià)

在雞糞重金屬單項(xiàng)污染指數(shù)中，Zn 的單項(xiàng)污染指數(shù)最高（表4），除育成期處在安全水平外其他4 個(gè)時(shí)期Zn均屬于輕度污染；Hg和Cd的單項(xiàng)污染指數(shù)均低于0.10；Pb 和Cr 也較低。整個(gè)養(yǎng)殖期雞糞重金屬單項(xiàng)污染指數(shù)平均值順序?yàn)閆n＞Cu＞As＞Cr＞Pb＞Cd＞Hg，除Zn 外其他重金屬含量在整個(gè)養(yǎng)殖期單項(xiàng)污染指數(shù)均小于0.70，屬于未污染水平。不同養(yǎng)殖期雞糞中各重金屬綜合污染指數(shù)順序?yàn)镻4＞P1≈P3＞P5＞P2，除育成期屬于安全水平外，其他4 個(gè)時(shí)期均屬于警戒限水平；高產(chǎn)期雞糞重金屬綜合污染指數(shù)最高?？梢钥闯?，養(yǎng)殖戶(hù)在產(chǎn)蛋高峰期為了保證產(chǎn)蛋量給雞食用的飼料或藥品中含有較高的重金屬。

2.1.4 養(yǎng)雞場(chǎng)周邊土壤重金屬含量及污染評(píng)價(jià)

分別將距離養(yǎng)雞場(chǎng)20、50、100、200 m和300 m的土樣依次編號(hào)為DP1、DP2、DP3、DP4和DP5，CK 為距離所有養(yǎng)殖場(chǎng)約5 km 處荒地土壤，AP 為施用了雞糞的18 塊菜地土壤。由圖2 可知，對(duì)照土壤CK 中Cu、Zn和As含量最低，與其他土壤呈顯著性差異；對(duì)照土壤Pb和Hg含量也較低。距養(yǎng)雞場(chǎng)較近的土壤中Cu、Zn、Cr、Pb、Hg 和As 含量比相對(duì)較遠(yuǎn)的土壤低，這說(shuō)明養(yǎng)雞場(chǎng)的存在對(duì)周邊土壤這5 種重金屬含量并無(wú)影響，但Cd含量則表現(xiàn)出離養(yǎng)殖場(chǎng)越遠(yuǎn)含量越低，是否與養(yǎng)殖場(chǎng)的存在有關(guān)還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。施用雞糞的土壤Pb 含量最高，但其他6 種重金屬含量與養(yǎng)殖場(chǎng)周邊土壤平均值差異很小。依據(jù)《土壤環(huán)境質(zhì)量 農(nóng)用地土壤污染風(fēng)險(xiǎn)管控標(biāo)準(zhǔn)（試行）》（GB 15618—2018）[26]，所有土壤各重金屬含量均未超標(biāo)。茹淑華等[4]指出與施化肥處理相比，連續(xù)7 a 施用雞糞的處理土壤Cu、Zn 和Cr 含量顯著增加；連續(xù)7 a 施用高量雞糞的處理小麥籽粒Zn 和Cd 含量顯著增加。本研究中養(yǎng)殖場(chǎng)周邊土壤和施用了雞糞的土壤Cu、Zn 含量均高于對(duì)照土壤，且雞糞中Zn有超標(biāo)現(xiàn)象，所以仍需謹(jǐn)慎施用。

表4 養(yǎng)雞場(chǎng)糞污重金屬污染指數(shù)Table 4 Pollution index of heavy metals of poultry manure at different breeding periods

圖1 不同養(yǎng)殖期雞糞重金屬變化情況Figure 1 Heavy metal content of poultry manure at different breeding periods

圖2 養(yǎng)雞場(chǎng)周邊土壤重金屬含量Figure 2 Heavy metal contents of soil around poultry farms

養(yǎng)殖場(chǎng)土壤Hg 和Cd 的單項(xiàng)污染指數(shù)均小于0.10（表5），其次為Zn、Cr 和Cu，距離養(yǎng)雞場(chǎng)200 m 處土壤As 單因子污染指數(shù)大于1.0，屬于輕度污染，其他土壤中As 單項(xiàng)污染指數(shù)也較其他重金屬大，但都屬于無(wú)污染等級(jí)。整體來(lái)講，養(yǎng)殖場(chǎng)周邊土壤各重金屬單項(xiàng)污染指數(shù)由小到大的順序?yàn)镠g＜Cd＜Zn＜Cr＜Cu＜Pb＜As。各土壤重金屬的綜合污染指數(shù)均小于0.30，都為安全水平，其中距離養(yǎng)雞場(chǎng)200 m的表層土壤綜合污染指數(shù)略大，其次是距離養(yǎng)雞場(chǎng)300 m 的土壤；不同土壤綜合污染指數(shù)間并無(wú)顯著差異。說(shuō)明養(yǎng)殖場(chǎng)存在10 a以?xún)?nèi)并不影響周邊土壤重金屬含量，施用雞糞對(duì)土壤重金屬綜合污染指數(shù)的影響也不顯著。

2.2 雞糞及周邊土壤細(xì)菌群落相對(duì)豐度分析

2.2.1 不同養(yǎng)殖期雞糞細(xì)菌群落相對(duì)豐度分析

從門(mén)水平來(lái)計(jì)算雞糞中不同細(xì)菌相對(duì)豐度（圖3a）。整體來(lái)講，雞糞中優(yōu)勢(shì)菌門(mén)種類(lèi)較少，F(xiàn)irmicutes 相對(duì)豐度最大，平均高達(dá)50.58%，其中育成期最高，占總量的70.96%，而育雛期最低，只占總量的21.51%；從育成期到終產(chǎn)期Firmicutes 豐度逐漸降低。其次為Proteobacteria，平均豐度為30.46%（育雛期最高，占該時(shí)期總量的54.03%）；Bacteroidetes豐度列第3（平均為11.33 %），整個(gè)養(yǎng)殖期這3 類(lèi)平均占細(xì)菌豐度總量的92.37%，其他還有少量的Actinobacteria、Verrucomicrobia 和Planctomycetes 等。育雛期和終產(chǎn)期細(xì)菌門(mén)類(lèi)相對(duì)較豐富。

2.2.2 養(yǎng)雞場(chǎng)周邊土壤細(xì)菌群落相對(duì)豐度分析

與雞糞細(xì)菌門(mén)種類(lèi)相比，土壤細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌門(mén)種類(lèi)更豐富（圖3b）。土壤中Proteobacteria相對(duì)豐度最高，平均為36.62%；其次是Bacteroidetes和Actinobacteria，各 占 比 約15%，而Acidobacteria、Planctomycetes、Gemmatimonadetes 和Firmicutes 平均豐度分別為7.33%、4.12%、2.72%和2.22%。對(duì)照、距養(yǎng)殖場(chǎng)不同距離、施用了雞糞的土壤中各優(yōu)勢(shì)菌門(mén)豐度雖然各不相同，但整體并無(wú)顯著差異。施用了雞糞的土壤Firmicutes 和Gemmatimonadetes 相對(duì)豐度比其他土壤高，而Actinobacteria 豐度相對(duì)略低，說(shuō)明施用雞糞后土壤細(xì)菌在門(mén)水平上數(shù)量發(fā)生變化，但變幅并不顯著。

2.3 雞糞及周邊土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成分析

通過(guò)高通量測(cè)序，在不同養(yǎng)殖期雞糞中共檢測(cè)到548個(gè)屬的細(xì)菌，對(duì)屬水平的細(xì)菌群落數(shù)量在前30的屬進(jìn)行熱圖分析（圖4a）。雞糞中優(yōu)勢(shì)屬主要有Lactobacillus、Ignatzschineria、Escherichia/Shigella、Enterococcus、Psychrobacter和Erysipelothrix，這幾種優(yōu)勢(shì)菌屬是家畜腸道內(nèi)常見(jiàn)菌屬[27]。育雛期Escherichia/Shigella和Ignatzschineria所占比例最大，分別為17.56%和16.88%，顯著高于其他時(shí)期，而Enterococcus、Psychrobacter和Erysipelothrix數(shù)量明顯少于其他時(shí)期，Escherichia/Shigella可引起人腹瀉或食物中毒，Ignatzschineria是與蒼蠅有關(guān)的細(xì)菌，該時(shí)期雛雞養(yǎng)殖時(shí)間短、消化系統(tǒng)不完善，免疫能力也較差，故雞糞中有大量致病菌存在[28]。育成期乳桿菌屬Lactobacillus數(shù)量顯著高于其他時(shí)期，Lactobacillus具有維護(hù)機(jī)體健康和調(diào)節(jié)免疫功能的作用，可能是由于該養(yǎng)殖期雞糞中重金屬普遍較低，故雞的健康狀況良好，免疫能力也較強(qiáng)；該養(yǎng)殖期Ignatzschineria數(shù)量很少。終產(chǎn)期Psychrobacter、Erysipelothrix和Bacteroides數(shù)量少于初產(chǎn)期和高產(chǎn)期。

選取土壤細(xì)菌中數(shù)量居前30 位的屬進(jìn)行熱圖分析（圖4b）。養(yǎng)雞場(chǎng)周邊土壤中Salinimicrobium、Rhodoligotrophos、Nitriliruptor、Thioprofundum、Aliifodinibius、Sphingomonas、Halomonas、Gp10、Gp6 和Gemmatimonas數(shù)量普遍較多。因養(yǎng)雞場(chǎng)周邊土壤取自旁邊排水溝，整體土壤鹽堿化程度較嚴(yán)重，所以Salinimicrobium、Rhodoligotrophos、Nitriliruptor、Thioprofundum、Aliifodinibius、Sphingomonas、Halomonas這些耐鹽堿屬的數(shù)量都較多，Gp10、Gp6 屬于Acidobacteria中的優(yōu)勢(shì)亞屬，是土壤中的常見(jiàn)屬[29]。在施用了雞糞的蔬菜地中優(yōu)勢(shì)屬為Gemmatimonas、Sphingomonas、Gp6、Lysobacter、Massilia、Gp4 和Pedobacter，其中Sphingomonas和Massilia在環(huán)境保護(hù)及工業(yè)生產(chǎn)方面具有巨大的應(yīng)用潛力，可以有效降解多環(huán)芳烴（PAHs）及六六六（HCH）異構(gòu)體等，但也都是致病菌，能夠引起植物根部或動(dòng)物傷口感染[30]，而Lysobacter對(duì)植物病原真菌及卵菌具有廣譜的抗菌活性[31]，這也說(shuō)明施用雞糞在增加降解有機(jī)污染物菌屬的同時(shí)，也會(huì)有帶入致病菌的危險(xiǎn)。雖然雞糞呈弱堿性，但當(dāng)?shù)赝寥纏H 普遍在8.0～8.5，所以施用雞糞后土壤pH 會(huì)略有降低，適合鹽堿化條件下生長(zhǎng)的優(yōu)勢(shì)菌屬數(shù)量會(huì)減少。李曉華[27]指出未施糞肥土壤中Firmicutes的比例顯著低于糞肥還田土壤，細(xì)菌群落組成在糞污與土壤樣品中的差異極大，但糞肥還田土壤中保留了部分糞污中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的特征，結(jié)論與本研究相似。

表5 養(yǎng)雞場(chǎng)周邊土壤重金屬污染指數(shù)Table 5 Pollution index of heavy metals of soils around poultry farms

圖3 不同養(yǎng)殖期雞糞和周邊土壤中門(mén)水平優(yōu)勢(shì)細(xì)菌相對(duì)豐度Figure 3 Relative abundances of dominant bacteria at phylum level at different periods of menure and soil

圖4 雞糞及周邊土壤中屬水平優(yōu)勢(shì)細(xì)菌相對(duì)豐度Figure 4 The relative percentages of the bacterial genus in manure and soil

2.4 雞糞及周邊土壤細(xì)菌群落與其理化性質(zhì)及重金屬的相關(guān)性分析

2.4.1 雞糞細(xì)菌群落與其理化性質(zhì)及重金屬的相關(guān)性分析

從雞糞的基本理化性狀、重金屬與其細(xì)菌群落多樣性及優(yōu)勢(shì)菌門(mén)豐度的相關(guān)性來(lái)看（表6），雞糞中 細(xì) 菌 群 落OTU、Shannon、Chao1、Actinobacteria、Acidobacteria、 Planctomycetes、 Gemmatimonadetes、Candidatus Saccharibacteria 與pH 值均呈極顯著正相關(guān)，但Simpson 與pH 呈顯著負(fù)相關(guān)。細(xì)菌群落Shannon、Bacteroidetes 與EC 呈顯著負(fù)相關(guān)，Simpson與EC 呈極顯著正相關(guān)。研究區(qū)雞糞EC 為25.27 mS·cm-1，鹽分含量較高，所以對(duì)群落多樣性有抑制作用，但對(duì)均勻度有促進(jìn)作用。只有Bacteroidetes 與有機(jī)質(zhì)呈極顯著負(fù)相關(guān)，其他優(yōu)勢(shì)菌門(mén)、多樣性指數(shù)與有機(jī)質(zhì)含量均無(wú)相關(guān)性；全N與細(xì)菌群落多樣性和各門(mén)類(lèi)均不相關(guān)；Shannon 和Candidatus Saccharibacteria與全P 呈顯著正相關(guān)，Spirochaetes 與全P 呈顯著負(fù)相關(guān)；細(xì)菌多樣性和多數(shù)主要門(mén)類(lèi)與全K均呈極顯著正相關(guān)關(guān)系（除Proteobacteria 與全K 呈顯著負(fù)相關(guān)外），說(shuō)明細(xì)菌群落在這個(gè)全K 水平條件下適合生長(zhǎng)和繁殖。

不同重金屬與雞糞細(xì)菌群落相關(guān)性不同。除Sequence 與Zn、Shannon 與Hg 呈顯著和極顯著負(fù)相關(guān)、Sequence 與As、Simpson 與Hg 呈顯著和極顯著正相關(guān)外，其他細(xì)菌多樣性指數(shù)與各重金屬含量相關(guān)性均未達(dá)到顯著水平。Firmicutes 與Cu 和Zn、Bacteroidetes 與Hg呈極顯著和顯著負(fù)相關(guān)，這也進(jìn)一步解釋了育雛期Cu、Zn 含量高，但其Firmicutes 相對(duì)豐度很低，而育成期Cu、Zn 含量較低，但其Firmicutes相對(duì)豐度較高的現(xiàn)象。Firmicutes 雖有耐重金屬的特性[32]，但由于雞糞中Cu 和Zn 含量過(guò)高，致使Firmicutes 生長(zhǎng)受到抑制。雞糞中Bacteroidetes、Verrucomicrobia 與Cu、Proteobacteria、Actinobacteria、Verrucomicrobia 、Acidobacteria 、Spirochaetes 、Gemmatimonadetes與Zn、Bacteroidetes、Verrucomicrobia與Cd、Firmicutes、Proteobacteria 與Cr、Proteobacteria與As 均達(dá)極顯著或顯著正相關(guān)。整體而言，在雞糞基本理化性質(zhì)中，pH 和全K 對(duì)細(xì)菌群落多樣性和優(yōu)勢(shì)菌門(mén)有顯著的促進(jìn)作用，重金屬中Zn的影響較大，全N 和Pb 含量對(duì)雞糞細(xì)菌群落無(wú)影響。研究區(qū)雞糞pH 平均值為7.26，呈微堿性，適合大多數(shù)微生物的生長(zhǎng)和繁殖。K 是微生物生長(zhǎng)所必需的營(yíng)養(yǎng)素，雞糞全K 含量平均為24.93 g·kg-1，顯著高于豬糞和牛糞[33]。劉殿鋒[34]指出富K 生境中細(xì)菌OTU 和克隆數(shù)量都顯著高于低K 生境，K 能夠顯著提高細(xì)菌的組成和多樣性。雞糞中Zn 含量相對(duì)最高，所以對(duì)細(xì)菌群落組成和多樣性均有顯著影響。雞糞中Proteobacteria、Actinobacteria 和Gemmatimonadetes 3 類(lèi) 菌 門(mén) 可 適 應(yīng)重金屬污染環(huán)境，并可能可以通過(guò)自身代謝降低重金屬的毒性[35]。

表6 雞糞細(xì)菌群落特征與其理化性質(zhì)、重金屬含量的相關(guān)性Table 6 Correlations between bacterial community and physichemical properties，heavy metal contents of poultry manure

2.4.2 養(yǎng)雞場(chǎng)周邊土壤細(xì)菌群落與其理化性質(zhì)及重金屬的相關(guān)性分析

在養(yǎng)雞場(chǎng)周邊土壤基本理化性質(zhì)中有機(jī)質(zhì)對(duì)細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌門(mén)豐度影響最大（表7），pH、EC 和全N 對(duì)細(xì)菌群落影響較小，全P 和全K 幾乎無(wú)影響。土壤細(xì)菌群 落Sequence、Firmicutes 與pH、Planctomycetes、Chloroflexi 與EC、Planctomycetes、Gemmatimonadetes、Chloroflexi 與 有 機(jī) 質(zhì)、Gemmatimonadetes 與 全N、Actinobacteria 與全K 均達(dá)極顯著或顯著正相關(guān)；Bacteroidetes 與pH、Simpson、Firmicutes 與 有 機(jī) 質(zhì)、Simpson與全氮之間呈顯著負(fù)相關(guān)。除土壤pH外，土壤有機(jī)質(zhì)也是影響細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的主要因素，該結(jié)論與黃健等[36]研究結(jié)論相似。

土壤重金屬中Cu 和Zn 對(duì)微生物多樣性和優(yōu)勢(shì)菌門(mén)普遍具有顯著影響，Pb 和As 影響較小，而Cd、Cr、Hg 對(duì)細(xì)菌群落影響甚微。除Simpson、Firmicutes和Cu、Zn 呈負(fù)相關(guān)關(guān)系外，細(xì)菌群落多樣性指數(shù)、大部分主要優(yōu)勢(shì)菌門(mén)與Cu 和Zn 均呈極顯著或顯著正相關(guān)；其他重金屬中除Verrucomicrobia 與Cd、Firmicutes 與 As、Deinococcus - Thermus 與 Cr、Gemmatimonadetes 與Pb、Proteobacteria 與Hg 間呈顯著或極顯著正相關(guān)或負(fù)相關(guān)外，與各多樣性指數(shù)、主要門(mén)類(lèi)均無(wú)相關(guān)性。Jiang等[37]發(fā)現(xiàn)影響耐Cu植物根際土壤細(xì)菌群落的最重要的環(huán)境因素是土壤pH而不是Cu 濃度，而本研究中Cu 對(duì)土壤細(xì)菌群落的影響明顯大于pH，這可能與不同生境微生物對(duì)重金屬的適應(yīng)性和選擇性有關(guān)。Du 等[38]指出重金屬Zn、Cd 和Cr對(duì)沉積物微生物多樣性沒(méi)有影響，但由于本研究土壤中Zn 含量較高，已對(duì)微生物群落多樣性和分布產(chǎn)生顯著影響，但Cd 和Cr 含量很低，所以對(duì)細(xì)菌群落多樣性沒(méi)有影響。

李曉華[27]研究指出，理化性質(zhì)差異僅對(duì)畜禽糞便和土壤耐藥菌的組成和分布具有顯著影響，本研究與該結(jié)論不完全一致，雞糞理化性質(zhì)對(duì)優(yōu)勢(shì)菌門(mén)的組成、多樣性和分布均有影響，但土壤理化性質(zhì)對(duì)其優(yōu)勢(shì)菌門(mén)的組成和分布具有顯著影響。整體來(lái)講，雞糞理化性質(zhì)與細(xì)菌群落多樣性和組成的相關(guān)性高于重金屬，而養(yǎng)殖場(chǎng)周邊土壤中Cu 和Zn 含量對(duì)細(xì)菌群落的影響均大于土壤理化性質(zhì)。理化性質(zhì)中雞糞pH、全K對(duì)其細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性的影響最大；重金屬中土壤Cu和Zn對(duì)其細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性的影響最大。

表7 養(yǎng)雞場(chǎng)周邊土壤細(xì)菌群落特征與其理化性質(zhì)、重金屬的相關(guān)性Table 7 Correlations between bacterial community and physichemical properties，heavy metal contents of soil around poultry farms

3 結(jié)論

（1）寧夏蛋雞養(yǎng)殖場(chǎng)雞糞中Zn 含量高出全國(guó)平均值26.83%，其他重金屬含量都顯著低于全國(guó)平均值。育成期雞糞重金屬含量普遍最低，其綜合污染指數(shù)屬安全水平，其他4 個(gè)時(shí)期均處于警戒限水平。土壤重金屬并非離養(yǎng)雞場(chǎng)越近含量越高；養(yǎng)雞場(chǎng)周邊土壤和施用了雞糞的土壤重金屬含量均在安全范圍內(nèi)，但其土壤Cu 和Zn 含量均高于對(duì)照土壤，所以仍需謹(jǐn)慎施用。

（2）雞糞優(yōu)勢(shì)菌門(mén)種類(lèi)較少，F(xiàn)irmicutes 相對(duì)豐度最大，其次為Proteobacteria 和Bacteroidetes，育成期Firmicutes 豐度最高。養(yǎng)殖場(chǎng)周邊土壤中細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌門(mén)種類(lèi)更多，主要是Proteobacteria、Bacteroidetes 和Actinobacteria。對(duì)照、距養(yǎng)殖場(chǎng)不同距離、施用了雞糞的土壤中各優(yōu)勢(shì)菌門(mén)豐度雖各不相同，但整體上并無(wú)顯著差異。

（3）雞糞細(xì)菌優(yōu)勢(shì)屬主要有Lactobacillus、Ignatzschineria、Escherichia/Shigella、Enterococcus、Psychrobacter和Erysipelothrix。養(yǎng)雞場(chǎng)周邊土壤中Salinimicrobium、Rhodoligotrophos、Nitriliruptor、Thioprofundum、Aliifodinibius、Sphingomonas等數(shù)量普遍較多。

（4）雞糞基本理化性質(zhì)中pH 和全K 對(duì)細(xì)菌群落多樣性和優(yōu)勢(shì)菌門(mén)的影響最大；重金屬中Zn 的影響較大。養(yǎng)殖場(chǎng)周邊土壤基本理化性質(zhì)中有機(jī)質(zhì)對(duì)細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌門(mén)豐度影響最大；重金屬中Cu 和Zn 對(duì)土壤細(xì)菌多樣性和優(yōu)勢(shì)菌門(mén)普遍具有顯著影響。