硫酸氫氯吡格雷固體分散體的制備及生物相關性體外評價

王眾勤，盧恩先，沈 琦

(1.上海交通大學藥學院，上海 200240；2.上海奧科達生物醫(yī)藥科技有限公司研發(fā)部，上海 201318)

口服難溶性藥物的生物利用度取決于藥物自身的溶解度和溶解狀態(tài)的維持時間，而其溶解狀態(tài)的維持時間是藥物起效的關鍵因素。目前已有多種提高難溶性藥物溶解度的方法，如減小粒徑，加入表面活性劑，或者制成包合物、固體分散體、多晶型物、溶劑化物、前藥、微粒(脂質體、微球、納米粒)等新劑型。在這些新劑型的藥物中，無定形或亞穩(wěn)態(tài)晶型、弱堿、晶鹽或共晶型藥物可形成過飽和制劑[1]。弱堿性藥物因其本身特性和胃腸道生理特性，在胃中已經(jīng)溶解的藥液進入小腸時可能出現(xiàn)沉淀，進而導致藥物吸收變異大并影響體內(nèi)行為的預測。而常規(guī)的體外評價方法不能預測這類藥物的體內(nèi)行為，需要模擬實際生理條件來進行實驗[[2-3]。硫酸氫氯吡格雷是弱堿性藥物，在生物藥劑學分類系統(tǒng)中屬于Ⅱ類藥物，即具有低溶解性和高滲透性。硫酸氫氯吡格雷易溶于pH 1的溶液，在近中性、中性或堿性介質中不溶，因此該藥在胃中能夠充分溶解，但是進入到腸道后因pH變化，溶解度下降而析出沉淀。本研究采用不同工藝制備硫酸氫氯吡格雷固體分散體，用差示掃描量熱法和X射線衍射法對固體分散體的晶體形態(tài)進行檢測，并用具有生物相關性的兩單元介質轉運法來評價其溶出特性，以提高藥物在生理pH環(huán)境下的溶解性。

1 儀器和試藥

1.1 儀器 EYELA N-1100旋轉蒸發(fā)儀(日本東京理化器械株式會社)；B-290/B-295噴霧干燥機(瑞士BüCHI公司)；Process 11熱熔擠出機(美國ThermoFisher Scientific公司);RCZ-8M溶出儀(天津天大天發(fā)科技有限公司)；Bruker D8 Advance粉末衍射儀(德國Bruker有限公司)；Q1000差示掃描量熱儀(德國TA通用儀器公司)；UV 2400PC紫外可見分光光度計(上海舜宇恒平科學儀器有限公司)；KBF240型恒溫恒濕箱(德國Binder公司)。

1.2 藥品和試劑 硫酸氫氯吡格雷(含量99%，湖北康寶泰精細化工有限公司，批號170415)；Soluplus(德國BASF公司，批號84414368E0)；水為蒸餾水(屈臣氏集團公司)。

2 方法和結果

2.1 硫酸氫氯吡格雷含量測定方法的建立

2.1.1 標準曲線的建立 取硫酸氫氯吡格雷原料藥適量，以50%甲醇水溶液(V/V)稀釋，配制成系列濃度(10.024、20.048、40.096、60.144、80.192、100.240 μg/ml)的標準曲線工作液，用紫外可見分光光度計于240 nm處測定吸光度。以硫酸氫氯吡格雷的吸光度(A)對濃度(c)做線性回歸，得到標準曲線方程為A=0.015 3c+0.020 8(r=0.999 8)，表明硫酸氫氯吡格雷在10.024～100.240 μg/ml濃度范圍內(nèi)有良好的線性關系。

2.1.2 精密度實驗 精密稱取適量的硫酸氫氯吡格雷原料藥，加20 ml甲醇溶解，分別用pH 2.0的鹽酸溶液和pH 6.8的磷酸鹽緩沖液稀釋，制成20 μg/ml的溶液，用紫外可見分光光度計于240 nm處測定吸光度，平行測定6次。結果測得pH 2.0的鹽酸溶液中6份樣品含量的RSD為0.57%，pH 6.8的磷酸鹽緩沖液中6份樣品含量的RSD為0.47%(n=6)。結果表明，該含量測定方法的精密度符合規(guī)定。

2.1.3 回收率實驗 取硫酸氫氯吡格雷原料藥適量，以50%甲醇水溶液(V/V)稀釋，配制成低、中、高濃度(10.024、40.096、80.192 μg/ml)的樣品溶液各3份，用紫外可見分光光度計于240 nm處測定吸光度，根據(jù)標準曲線計算回收率。結果低、中、高濃度溶液中硫酸氫氯吡格雷的回收率分別為(100.33±1.65)%、(98.49±0.59)%和(101.33±0.80)%(n=3)。結果表明，該含量測定方法的回收率符合規(guī)定。

2.2 物理混合物和固體分散體的制備

2.2.1 物理混合物的制備 稱取硫酸氫氯吡格雷原料藥和載體Soluplus，按1∶1(w/w)混合均勻，過60目篩，即得物理混合物，備用。

2.2.2 固體分散體的制備 (1)溶劑蒸發(fā)法：取2.2.1項下的物理混合物粉末，加入適量乙醇溶解，將充分溶解的溶液轉移至旋轉蒸發(fā)儀中，設定溫度為60 ℃，抽真空。待溶劑蒸干后，收集蒸餾瓶中的固體，置真空干燥器中干燥48 h。將干燥后的固體粉碎，過60目篩，即得硫酸氫氯吡格雷固體分散體。(2)噴霧干燥法：取2.2.1項下的物理混合物粉末，加入適量乙醇充分溶解。設定進風溫度為80 ℃，抽氣為100%，Q-flow球調節(jié)至40 mm，將含藥乙醇溶液以8 ml/min速度泵入噴霧干燥機中，此時出風溫度控制在約46 ℃。收集噴干后的固體，置真空干燥器中干燥48 h。將干燥后的固體粉碎，過60目篩，即得硫酸氫氯吡格雷固體分散體。(3)熱熔制粒法：由于Soluplus的玻璃態(tài)轉化溫度為70 ℃，故設定自進料口至出料口各區(qū)段的溫度分別為60 ℃、80 ℃、100 ℃、100 ℃、90 ℃、70 ℃、60 ℃和30 ℃，螺桿轉速為30 r/min，扭矩為60%～80%。將制得的顆粒冷卻至室溫后粉碎，過60目篩，即得硫酸氫氯吡格雷固體分散體。(4)熱熔擠出法：由于硫酸氫氯吡格雷原料藥的熔點約為180 ℃，故設定自進料口至出料口各區(qū)段的溫度分別為140 ℃、155 ℃、170 ℃、180 ℃、185 ℃、170 ℃、150 ℃和140 ℃，螺桿轉速為50～70 r/min，扭矩為30%～40%，擠出?？诪? mm。將擠出的條狀物冷卻至室溫后粉碎，過60目篩，即得硫酸氫氯吡格雷固體分散體。

2.3 固體分散體溶解度的測定 (1)物理混合物的溶解度：稱取過量的硫酸氫氯吡格雷原料藥粉末，分別溶于10 ml的pH 2.0鹽酸溶液、pH 3.0鹽酸溶液、pH 4.0檸檬酸鹽溶液、pH 5.0檸檬酸鹽溶液、pH 6.0磷酸鹽緩沖液、pH 6.8磷酸鹽緩沖液中。結果物理混合物中硫酸氫氯吡格雷原料藥在pH 2.0、pH 3.0、pH 4.0、pH 5.0、pH 6.0和pH 6.8介質中的溶解度分別為>10 mg/ml，(1.657±0.022)、(0.134±0.011)、(0.036±0.004)、(0.018±0.008)和(0.010±0.003) mg/ml。由此可見，硫酸氫氯吡格雷原料藥在不同pH的介質中溶解度不同，隨著pH值增加，溶解度大幅下降，這是弱堿性藥物的基本特性。(2)固體分散體的溶解度：稱取各工藝制備的過量硫酸氫氯吡格雷固體分散體及2.2.1項下的物理混合物，分別溶于10 ml的pH 6.8磷酸鹽緩沖液中，確保溶液中有未溶解的固體。振搖48 h后，以相對離心力1.073×103×g離心15 min，取上清液適當稀釋后，用紫外可見分光光度計在240 nm處測定吸光度[[4-5]，據(jù)此計算溶解度。結果溶劑蒸發(fā)法、噴霧干燥法、熱熔制粒法和熱熔擠出法制備的硫酸氫氯吡格雷固體分散體在pH 6.8介質中的溶解度分別為(0.275±0.009)、(0.268±0.002)、(0.245±0.011)和(0.278±0.009) mg/ml，物理混合物在pH 6.8介質中的溶解度為(0.233 ± 0.012) mg/ml。與硫酸氫氯吡格雷原料藥相比，物理混合物在pH 6.8介質中的溶解度明顯增加，提高至約20倍，表明載體Soluplus對硫酸氫氯吡格雷具有明顯的增溶效果。物理混合物在pH 6.8介質中的溶解度略低于各工藝制備的固體分散體，而各工藝制備的固體分散體的溶解度之間無顯著性差異。

2.4 固體分散體晶型的測定

2.4.1 X射線衍射分析 取適量硫酸氫氯吡格雷固體分散體、硫酸氫氯吡格雷原料藥、載體Soluplus以及物理混合物，分別裝入X射線衍射儀的樣品皿中。設定條件為：Cu靶，40 kV，電流40 mA，掃描范圍3°～40°，步寬0.02°，掃描速度為0.2 s/步，繪制X射線衍射圖，見圖1。由圖1可見，硫酸氫氯吡格雷原料藥的X射線衍射圖存在明顯的特征衍射峰，載體材料未見明顯衍射峰；在物理混合物和熱熔制粒法制備的固體分散體中，硫酸氫氯吡格雷所有的衍射峰均有顯現(xiàn)，表明在物理混合物和熱熔制粒法制備的固體分散體中硫酸氫氯吡格雷是以晶體存在的。而溶劑蒸發(fā)法、熱熔擠出法和噴霧干燥法制備的固體分散體的X射線衍射圖中該特征峰消失，表明其中的硫酸氫氯吡格雷與載體形成無定形結構。

2.4.2 差示掃描量熱分析 分別取適量各工藝制備的硫酸氫氯吡格雷固體分散體、硫酸氫氯吡格雷原料藥、載體Soluplus以及物理混合物，分別置于差示掃描量熱儀的鋁坩堝內(nèi)，以空鋁坩堝為參比，以10 ℃/min的速率升溫，溫度掃描范圍為40 ℃～200 ℃，氮氣流速50 ml/min，得到差示掃描量熱分析圖見圖2。由圖2可見，硫酸氫氯吡格雷原料藥和物理混合物在180 ℃有特征吸收峰。將圖2中3、4、5、6、7保持橫坐標不變，縱坐標放大10倍，發(fā)現(xiàn)熱熔制粒法制備的固體分散體的差示掃描量熱分析圖在約160 ℃有一個較小的特征吸收峰(見圖3)，而噴霧干燥法、溶劑蒸發(fā)法和熱熔擠出法制備的固體分散體并沒有該特征吸收峰。因此，進一步驗證了以熱熔制粒法制備的固體分散體中的硫酸氫氯吡格雷是以晶體形態(tài)分散在Soluplus中，而在噴霧干燥法、溶劑蒸發(fā)法和熱熔擠出法制備的固體分散體中，硫酸氫氯吡格雷與Soluplus形成了無定形結構。

2.5 固體分散體過飽和溶解的測定 采用兩單元介質轉運法測定不同工藝制備的固體分散體的溶解度[6]。分別精密稱取300 mg硫酸氫氯吡格雷原料藥及含等量硫酸氫氯吡格雷的固體分散體，分別采用兩單元介質轉運法檢測硫酸氫氯吡格雷的溶解狀態(tài)及析出情況。參照《中華人民共和國藥典》2015年版第四部附錄0931第二法(槳法)，設置轉速為50 r/min，介質溫度(37±0.5) ℃。在開始的5 min內(nèi)，先將樣品溶解于盛有300 ml的pH 2.0鹽酸溶液的溶出杯中(相當于胃單元)，然后模擬胃排空過程，將溶液以5 或10 ml/min速度泵入盛有300 ml的pH 6.8磷酸鹽緩沖液的溶出杯中(相當于腸單元)，60或30 min后泵完，最終介質為600 ml的pH 6.52的混合溶液。在5、15、30、40、50、60、90、120、180 min 分別從pH 6.8磷酸鹽緩沖液中取樣4 ml，同時補充4 ml相同的介質，濾過，棄去2 ml初濾液，取1 ml續(xù)濾液置試管中，用乙醇稀釋至2倍體積，渦旋混勻，作為供試品溶液。用紫外可見分光光度計于240 nm處測定吸光度，計算溶解量，繪制溶出曲線(見圖4和圖5)。由圖4可見，在泵速為5 ml/min時，熱熔制粒法、熱熔擠出法和噴霧干燥法制備的固體分散體在pH 6.8介質中的溶解量遠高于溶劑蒸發(fā)法制備的固體分散體，并且?guī)缀跸喈斢谕耆芙獾耐端幜?。溶劑蒸發(fā)法制備的固體分散體雖未能全部溶解，有部分藥物析出，但其溶解量仍優(yōu)于物理混合物。在泵速為10 ml/min時，熱熔制粒法、熱熔擠出法和噴霧干燥法制備的固體分散體在pH 6.8介質中的溶解量雖然高于溶劑蒸發(fā)法制備的固體分散體，但是與泵速5 ml/min相比，最終溶解量有所下降，意味著有少量藥物析出；而溶劑蒸發(fā)法制備的固體分散體在泵速10 ml/min時的最終溶解量有所上升。因此，后續(xù)實驗選擇泵速為5 ml/min。

2.6 穩(wěn)定性實驗 熱熔制粒法制備的固體分散體中，原料藥大部分以固體晶型存在，制備過程中物料與螺桿之間存在較大的摩擦力，導致工藝不順暢，不具有連續(xù)生產(chǎn)的可行性；溶劑蒸發(fā)法制備的固體分散體在pH 6.8介質中的最終溶解量相對更低。因此，結合制備工藝的實際操作性及溶解量評價結果，僅選取噴霧干燥法和熱熔擠出法制備的固體分散體進行穩(wěn)定性實驗。取噴霧干燥法和熱熔擠出法制備的固體分散體適量，用鋁箔袋密封，置于25 ℃且相對濕度65%的恒溫恒濕箱中，放置6個月后，測定X射線衍射圖和差示掃描量熱分析圖，檢查其無定形穩(wěn)定性情況(見圖6和圖7)。熱熔擠出法制備的固體分散體，初始時X射線衍射圖譜上無特征峰，差示掃描量熱圖譜上無吸收峰；在25 °C且相對濕度60%條件下放置6個月后，X射線衍射圖譜上出現(xiàn)特征峰，并且差示掃描量熱分析圖譜上出現(xiàn)吸收峰，表明熱熔擠出法制備的固體分散體在儲存的過程中由無定形轉變?yōu)榫停环€(wěn)定。而噴霧干燥法制備的固體分散體在初始條件和25 °C、相對濕度60%條件下放置6個月，X射線衍射圖譜上均無特征峰顯現(xiàn)，差示掃描量熱分析圖譜上均無吸收峰，表明噴霧干燥法制備的固體分散體穩(wěn)定，在室溫條件下放置6個月內(nèi)未發(fā)生晶型變化。因此，確定噴霧干燥法為生產(chǎn)硫酸氫氯吡格雷固體分散體的最優(yōu)工藝。

3 討 論

3.1 輔料種類及比例的確定 本研究為固體分散體選取的載體材料為Soluplus，其安全性高，被美國藥典、歐洲藥典等收錄，有較低的臨界膠束濃度，具有增溶、抑制晶體析出、空間穩(wěn)定、助懸、熱敏、成膜等特性，可廣泛用于制備固體分散體[7-8]。一般來說，載體的用量越大，抑制藥物析出效果越顯著，維持過飽和狀態(tài)越好?？紤]到載藥量，并且需要為后續(xù)添加其他輔料留有空間，以及便于不同工藝制備的固體分散體之間的對比，故選擇硫酸氫氯吡格雷原料藥與Soluplus的比例為1∶1(w/w)。

3.2 泵速的選擇 由于硫酸氫氯吡格雷為弱堿性藥物，在胃液中完全溶解后，以溶液形式進入小腸，將藥物以溶液的形式泵入pH 6.8的磷酸鹽緩沖液與藥物在體內(nèi)的過程一致，因此考察藥物在pH 6.8介質中的溶解情況及持續(xù)時間，可以初步判斷藥物在體內(nèi)的實際吸收情況?？疾旖橘|轉運速度時，將泵速設定為5 ml/min，是根據(jù)人體空腹時胃完全排空需要的時間約為1 h確定的[9]。300 ml溶液在60 min內(nèi)轉移完，故介質的轉運速度為5 ml/min。選取含300 mg硫酸氫氯吡格雷的固體分散體進行投藥，其在600 ml的pH 6.8介質中完全溶解時終濃度為0.5 mg/ml，超出固體分散體的溶解度，以此評估不同工藝制備的硫酸氫氯吡格雷固體分散體在pH 6.8介質中維持過飽和的能力。物理混合物的最終溶解量約占投藥量的40%，此時的藥物濃度約為0.2 mg/ml，等于其溶解度。對于熱熔制粒法、熱熔擠出法和噴霧干燥法制備的固體分散體，將溶解的藥物泵入pH 6.8的磷酸鹽緩沖液的時間較長，過飽和狀態(tài)增加的速度和程度較慢，整個溶出過程也僅為3 h。分析原因是載體與硫酸氫氯吡格雷原料藥分子間有緊密包合的相互作用力，加上Soluplus具有優(yōu)良的抑制藥物析出和維持過飽和能力，使固體分散體的藥物溶液在泵入的過程中均為溶解狀態(tài)，并且泵入后仍能維持過飽和狀態(tài)，所以最終溶解量大于溶解度。而溶劑蒸發(fā)法制備的固體分散體，因載體與藥物分子相互作用不強，維持過飽和能力較弱，有藥物析出，所以最終溶解量略高于溶解度?？紤]到在特殊情況下，胃排空時間可能會縮短，將泵速調整為10 ml/min，即30 min內(nèi)排空300 ml溶液。當泵速為10 ml/min時，泵入時間縮短，過飽和程度提高得較快，各工藝制備的固體分散體的溶解趨勢也發(fā)生一定變化。熱熔擠出法、熱熔制粒法和噴霧干燥法制備的固體分散體，隨著泵速加快，出現(xiàn)少量藥物析出，泵入量要遠大于析出量，故整體仍呈快速上升趨勢，但是藥物最終溶解量較泵速為5 ml/min時略低。對于溶劑蒸發(fā)法，將泵速提高為10 mg/min時，藥物泵入速度的增加大于析出速度的增加，且排空時間縮短，沉淀時間也相對縮短，所以藥物溶解量整體也呈上升趨勢，并且最終溶解量比泵速5 ml/min時更多。此時溶劑蒸發(fā)法制備的固體分散體與熱熔制粒法、熱熔擠出法、噴霧干燥法制備的固體分散體在pH 6.8介質中的藥物溶解量之差減小，區(qū)分力減弱，因此泵速是區(qū)分溶劑蒸發(fā)法與其他工藝制備的固體分散體的關鍵因素。這可能意味著當胃排空速度發(fā)生變化時，各工藝制備的固體分散體的體內(nèi)吸收情況也會不同，進一步證實了兩單元介質轉運法具有生物相關性和區(qū)分力。

3.3 不同工藝制備的固體分散體中分子相互作用機制 溶劑蒸發(fā)法在制備硫酸氫氯吡格雷固體分散體時，由于溶劑緩慢蒸發(fā)，固體逐漸析出，在這個緩慢過程中，溶劑中的乙醇分子可影響硫酸氫氯吡格雷分子與載體分子之間的結合和作用，硫酸氫氯吡格雷原料藥被Soluplus包裹得不緊密，因此在pH 6.8介質中的最終溶解量只是略高于物理混合物。而噴霧干燥法制備硫酸氫氯吡格雷固體分散體時，溶劑瞬間干燥，Soluplus與硫酸氫氯吡格雷原料藥分子之間的乙醇分子迅速蒸發(fā)，兩者迅速聚攏、相互包裹、緊密結合，所以在藥物泵入后仍能保持溶解狀態(tài)，維持較高的過飽和度。熱熔擠出法和熱熔制粒法制備的硫酸氫氯吡格雷固體分散體中，只有硫酸氫氯吡格雷原料藥與Soluplus兩種分子相互作用，且Soluplus為液態(tài)，硫酸氫氯吡格雷原料藥能更好地分散在載體分子中，并與載體相互作用。因此，雖然溶劑蒸發(fā)法制備的固體分散體為無定形狀態(tài)，但其在pH 6.8介質中抑制藥物析出和維持藥物過飽和狀態(tài)的能力要低于熱熔擠出法和噴霧干燥法制備的固體分散體，甚至還低于熱熔制粒法制備的晶體狀態(tài)的固體分散體。由于泵速相同，雖然在熱熔制粒法制備的固體分散體中，藥物以晶體形態(tài)分散，但是在泵入的過程中一直處于溶解狀態(tài)且未析出，所以其固體分散體在pH 6.8介質中的溶解量占投藥量的百分比隨時間的變化趨勢與噴霧干燥法和熱熔擠出法制備的固體分散體相近，維持過飽和能力相當，最終溶解量也就相同。這也說明固體分散體的溶解情況和藥物過飽和狀態(tài)的維持除了與藥物的晶體形態(tài)相關外，還與制備時載體與藥物的結合情況相關。載體與藥物的結合情況會影響藥物與載體的相互作用，從而也會影響藥物的溶解狀態(tài)和維持過飽和狀態(tài)的能力。各種工藝制備的固體分散體中藥物與載體分子微觀結構示意圖猜想見圖8。

3.4 總結和展望 對不同工藝制備的硫酸氫氯吡格雷固體分散體做對比和評價可知，以熱熔制粒法制備固體分散體時，原料藥未熔融，除了少量藥物分子溶于液態(tài)的載體內(nèi)，大部分藥物仍以固體粉末形式存在。故制備過程中，物料與螺桿之間存在較大的摩擦力，雖然轉速小于熱熔擠出法，但螺桿間扭矩大，工藝不順暢，不具有連續(xù)生產(chǎn)的可行性。溶劑蒸發(fā)法制得的固體分散體在pH 6.8磷酸鹽緩沖液中的溶解量和過飽和狀態(tài)低于噴霧干燥法和熱熔擠出法制備的固體分散體。而熱熔擠出法制備的固體分散體在儲存的過程中會從無定形轉變?yōu)榫?，不穩(wěn)定。綜上所述，確定噴霧干燥法為生產(chǎn)硫酸氫氯吡格雷固體分散體的最優(yōu)工藝。

本研究采用生物相關性的兩單元介質轉運法對不同工藝制備的硫酸氫氯吡格雷固體分散體的溶解狀態(tài)及析出情況進行了考察。該方法基于生理環(huán)境而設計，兩單元分別代表藥物崩散、溶解的胃室和藥物溶出、吸收的腸室，很好地模擬了藥液在胃腸道轉運過程中的pH值變化對藥物溶解及吸收的影響。兩單元介質轉運法中，泵速是關鍵影響因素，保持5 ml/min的泵速具有較好的區(qū)分性。雖然不同工藝制備的固體分散體的溶解度與物理混合物無明顯差異，但采用該方法可區(qū)分不同工藝制備的固體分散體之間的差異。兩單元介質轉運法也可用于其他弱堿類藥物的過飽和狀態(tài)特性評價。