基于PAMAM樹枝狀大分子納米免疫傳感器快速檢驗嬰幼兒奶粉中的阪崎腸桿菌

柴曉玲 郝雅茹 王佳蕊 李書國

（河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院 石家莊050018）

阪崎腸桿菌是一種周生鞭毛、能運動、無芽胞的革蘭氏陰性菌，也是一種條件致病菌，能夠引起嚴重的新生兒腦膜炎、 壞死性小腸結(jié)腸炎和菌血癥，并可能存在嚴重的神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥，在新生兒中的致死率可達50%～80%[1-2]。國際食品微生物標準委員會 （International Committee on Microbiological Standards for Food，ICMSF）將其列為“嚴重危害特定人群生命， 引起長期慢性實質(zhì)性后遺癥”的一種致病菌[3]。 將阪崎腸桿菌放置并對其危險性進行評估，與最初相比發(fā)現(xiàn)：溫度25 ℃，放置6 h，阪崎腸桿菌的相對危險性增加30 倍；放置10 h，增加30 000 倍[4]。 其廣泛存在于環(huán)境和食品中，科學(xué)家從多種食物和飲料中分離出阪崎腸桿菌，并發(fā)現(xiàn)土壤、水、下水道、動物和人類排泄物以及植物的根和徑等處都有阪崎腸桿菌[5-7]。此外，有報道臨床也是其來源之一[8-11]。

目前， 阪崎腸桿菌的檢測方法有傳統(tǒng)檢驗方法、分子生物學(xué)法、電化學(xué)免疫傳感器法、基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜檢驗法、 金標快速診斷法以及免疫學(xué)檢測方法[12-24]。傳統(tǒng)的檢測方法存在操作繁瑣、耗時長以及不易分辨結(jié)果等缺點。分子生物學(xué)檢測技術(shù)的不斷完善和發(fā)展， 克服了傳統(tǒng)檢測方法存在的問題， 為食源性病原微生物的檢測提供了一種快速、靈敏、特異的方法，可作為一種可靠的檢測方法。 電化學(xué)免疫傳感器檢測阪崎腸桿菌具有操作簡單、響應(yīng)快速、靈敏度高、不受樣品顏色和濁度影響等優(yōu)點，在食品、醫(yī)學(xué)和環(huán)境等領(lǐng)域有很多研究和初步的應(yīng)用。 張曉等[25]通過將硫堇（Thi）和辣根過氧化物酶標記的阪崎腸桿菌抗體依次自組裝固定于多壁碳納米管（MWCNT）/十二烷基苯磺酸鈉（SDBS）修飾的四通道絲網(wǎng)印刷電極上，制成一次性免疫傳感器，該方法檢測阪崎腸桿菌的線性范圍為102～108mL-1，檢測限為5.7×101CFU/mL。

以玻碳電極為基礎(chǔ)電極， 以聚酰胺胺樹枝狀大分子材料結(jié)合還原性石墨烯納米復(fù)合物為電活性修飾膜層，固定于玻碳電極表面，采用物理吸附法或牛血清白蛋白-戊二醛交聯(lián)方法固定化辣根過氧化物酶標記的阪崎腸桿菌抗體制備納米傳感器，建立免疫傳感器技術(shù)，用于快速測定嬰幼兒奶粉中阪崎腸桿菌的殘留量。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

磷酸二氫鈉（分析純）、磷酸氫二鈉（分析純）、氯化鉀（分析純）、過氧化氫（分析純），天津博迪化工股份有限公司；聚酰胺胺樹脂，無錫市阿爾茲化工有限公司；石墨烯，北京德科島金。

1.2 儀器與設(shè)備

LK98Bп 型微型電化學(xué)分析系統(tǒng)，天津蘭力科化學(xué)電子高技術(shù)有限公司；三電極系統(tǒng)、電解杯，上海CHI 儀器公司；KQ2200 型超聲波清洗儀，昆山市超聲儀器有限公司；HH-4 型恒溫水浴鍋，鞏義市予華儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 電極的預(yù)處理 將玻碳電極 （Glassy carbon electrode，GCE）用Al2O3拋光粉拋光打磨至鏡面后先用蒸餾水清洗干凈， 再依次用二次去離子水、 無水乙醇以及二次去離子水超聲清洗3～5 min，最后用氮氣吹干。 在pH 7.0 的磷酸鹽緩沖液中加入鐵氰化鉀、氯化鉀和過氧化氫，使其濃度分別為2，0.1 mol/L 和0.5 mmol/L，得到電解質(zhì)溶液。將玻碳電極、Ag/AgCl 參比電極和鉑絲（片）對電極插入電解質(zhì)溶液中， 采用循環(huán)伏安法 （電位：-0.2～+0.6 V；掃描速度：50 mV/s）掃描處理，持續(xù)掃描直至循環(huán)伏安圖穩(wěn)定， 取出玻碳電極用二次蒸餾水清洗干凈，氮氣吹干，備用。

1.3.2 石墨烯-聚酰胺-胺復(fù)合物的制備 將一定量的石墨烯粉末加到二次蒸餾水中， 使其質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL， 攪拌1～2 min， 超聲處理15～20 min，得到均勻一致的黑色石墨烯懸浮液，備用。

將2.0 代聚酰胺-胺溶于1%的乙酸溶液中，使聚酰胺-胺的質(zhì)量濃度為1.0×10-3g/mL，在室溫條件下， 磁力攪拌55～60 min， 得到聚酰胺-胺溶液。將聚酰胺-胺溶液和石墨烯懸浮液按體積比1∶1 混合均勻，超聲處理1.5～2 h，得到均勻穩(wěn)定的石墨烯-聚酰胺-胺納米復(fù)合物溶液。

1.3.3 免疫傳感器的制備 準確量取5 μL 石墨烯-聚酰胺-胺納米復(fù)合物溶液滴涂到洗凈的玻碳電極表面， 于室溫下自然晾干或用便攜式紅外干燥器烘干。在玻碳電極表面滴涂5 μL 的辣根過氧化物酶標記的阪崎腸桿菌抗體， 置于4 ℃冰箱內(nèi)反應(yīng)1.5 h。 滴涂5 μL 1%牛血清白蛋白溶液于37 ℃處理60 min 封閉非特異性吸附位點。 將修飾后的電極取出， 用二次去離子水沖洗去除未結(jié)合的多余辣根過氧化物酶標記的阪崎腸桿菌抗體，得到阪崎腸桿菌納米免疫傳感器， 于4 ℃避光條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 電化學(xué)檢驗方法 電化學(xué)試驗采用三電極體系： 免疫電極為工作電極，Ag/AgCl 電極為參比電極，鉑絲（片）電極為對電極，采用循環(huán)伏安法對免疫傳感器電化學(xué)表征。 用循環(huán)伏安法檢測阪崎腸桿菌， 測試底液為含2 mmol/L 鐵氰化鉀，0.1 mol/L 氯化鉀和0.5 mmol/L 過氧化氫的磷酸鹽緩沖溶液（pH 7.0）。 用生理鹽水制備各濃度梯度的阪崎腸桿菌菌懸液，在每個電極上滴加3～8 μL 菌懸液，于室溫孵育20 min，用雙蒸水沖洗干凈，晾干。 通過差分脈沖伏安法檢測免疫傳感器還原峰電流值來檢測樣品中的阪崎腸桿菌。

1.3.5 免疫傳感器法測定樣品中阪崎腸桿菌 取100 g 檢測已有阪崎腸桿菌的奶粉樣品加入已預(yù)熱至（45±1）℃裝有900 mL 滅菌水的錐形瓶中，緩緩搖動至樣品充分溶解，（36±1）℃培養(yǎng)18～22 h。移取1 mL 轉(zhuǎn)種于10 mL 改良月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯中，（36±1）℃培養(yǎng)18～22 h。 取1 mL 培養(yǎng)液備用。

采用1.3.4 節(jié)三電極測試系統(tǒng)，在電解質(zhì)溶液中進行電化學(xué)測試。 用差分脈沖伏安法進行掃描處理，掃描速度50 mV/s，電壓范圍-0.2～+0.6 V。取出免疫傳感器， 用二次去離子水沖洗去除電極表面的電解質(zhì)，備用。

在納米免疫傳感器上滴涂5 μL 備用的培養(yǎng)液，室溫孵育20 min，再次進行電化學(xué)測試。

1.3.6 實時熒光PCR 法測定 反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，58 ℃退火15 s，72 ℃延伸10 s，共計40 個循環(huán)。

以細菌16Sr DNA 和23Sr DNA 保守序列為通用引物對6 株阪崎腸桿菌區(qū)間序列擴增、 測序并設(shè)計引物。 提取培養(yǎng)菌DNA，采用熒光PCR 擴增。 確定反應(yīng)條件，得出溶解曲線，建立一種高特異性、高靈敏度、簡捷快速的熒光染料PCR 檢測方法， 并將實際樣品的檢測結(jié)果與納米免疫傳感器法的結(jié)果對比。

1.3.7 納米免疫傳感器法與國標法檢驗阪崎腸桿菌的對比 收集30 份不同批次的奶粉，用納米免疫傳感器法和國標法分別檢測其阪崎腸桿菌，討論納米免疫傳感器法在檢驗結(jié)果上是否可行。

2 結(jié)果與分析

2.1 電極修飾過程的循環(huán)伏安表征

采用循環(huán)伏安法研究不同電極對電極電化學(xué)特征的影響，結(jié)果如圖1 所示。

由圖1 可知，a 電極（玻碳電極）在電解質(zhì)溶液中出現(xiàn)1 對可逆的氧化-還原峰， 當修飾電極后，氧化-還原峰電流值增大，這是因為修飾物加強了電子傳遞能力。而加入抗體后氧化-還原峰電流值降低， 說明酶標抗體成功地包埋在修飾物復(fù)合膜中。免疫反應(yīng)后，氧化-還原峰電流值大幅降低，說明電極表面上抗原-抗體免疫反應(yīng)后生成的免疫復(fù)合物在空間上阻礙了媒介體和底物的擴散，電子傳遞受阻所致。

2.2 優(yōu)化的試驗條件

2.2.1 測試底液中過氧化氫濃度 在底液中加入不同濃度的過氧化氫，分別為0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7 mmol/L，其它底液成分同樣，觀察免疫電極的還原峰電流值。

如圖2 所示， 過氧化氫濃度小于0.5 mmol/L時，免疫電極還原峰電流值逐漸變大，隨著過氧化氫濃度的增大， 免疫電極還原峰電流值雖然在增大，但是增幅變小。 考慮到檢測的靈敏度、酶催化的活性以及高濃度的過氧化氫可能損壞辣根過氧化物酶活性， 底液中過氧化氫的濃度以0.5 mmol/L 為最佳濃度。

圖1 不同電極在測試底液中的循環(huán)伏安圖Fig.1 Cyclic voltammogram of different electrodes in the base solution

2.2.2 測試底液中pH 值 測試底液的pH 值過高或過低都會影響酶標抗體的活性， 從而影響抗原與抗體的結(jié)合。 固定除pH 值外的所有條件，不同pH 條件下循環(huán)伏安法測試還原峰電流值的響應(yīng)結(jié)果如圖3 所示。 當pH 7.0 時，免疫電極信號最強。 最終選擇測試底液的pH 值為7.0。

圖2 測試底液過氧化氫濃度與免疫電極還原峰電流的關(guān)系Fig.2 The relationship between the concentration of hydrogen peroxide in the base solution and the peak current of the immunoreduction electrode

2.2.3 孵育時間 孵育時間和溫度是影響免疫反應(yīng)的重要因素。 圖4 顯示，隨著孵育時間的增加，免疫響應(yīng)電流值增大，孵育時間超過20 min，免疫電極還原峰電流值的增幅變小，幾乎不再增長?？紤]到免疫反應(yīng)效率， 試驗中選擇孵育時間為20 min。 考慮到抗體的活性，選擇（37±1）℃為最佳孵育溫度。

2.3 免疫電極對不同濃度阪崎腸桿菌懸液的差分脈沖檢測結(jié)果

采用循環(huán)伏安法檢測免疫前、 后還原峰的電流值。 由圖5 可知，阪崎腸桿菌的含量在102～108CFU/mL 之間變化時，免疫前、后的電流值變化與阪崎腸桿菌濃度的對數(shù)呈良好的線性關(guān)系， 線性方程為ΔIpc（μA）=1.1817 lgC-1.723，相關(guān)系數(shù)為0.9989，檢出限為5.8×101CFU/mL（S/N=3）。

2.4 樣品中阪崎腸桿菌的檢驗結(jié)果

由圖6 可知，a 以Ag/AgCl 電極為參比電極，鉑絲（片）為對電極，免疫傳感器為工作電極，組成三電極測試系統(tǒng)， 在電解質(zhì)溶液中進行電化學(xué)測試。 用差分脈沖伏安法掃描處理，掃描速度為50 mV/s， 電壓范圍-0.2～+0.6 V， 得到差分脈沖伏安圖。 b 以涂有阪崎腸桿菌抗原的免疫傳感器為工作電極的三電極測試系統(tǒng)得到的差分脈沖伏安圖。 將a 與b 重疊后得到圖6。 結(jié)果表明，與a 相比，b 的響應(yīng)電流值明顯變小，說明抗原與抗體結(jié)合，也就是說，奶粉中有阪崎腸桿菌被檢測出來。

圖3 底液pH 值與免疫還原峰電流值的關(guān)系Fig.3 The relationship between pH value of base solution and the reduction peak current

圖4 孵育時間與免疫還原峰電流值的關(guān)系Fig.4 Relationship between incubation time and the reduction peak current

圖5 免疫電流還原峰電流值與阪崎腸桿菌濃度對數(shù)的差分脈沖伏安圖Fig.5 Differential pulse voltammetry between the peak and the logarithm of Enterobacter sakazakii concentration

圖6 樣品中阪崎腸桿菌的脈沖伏安圖Fig.6 Pulse voltammograms of Enterobacter sakazakii in samples

2.5 實際樣品檢測結(jié)果與國標檢測結(jié)果的比較

為了驗證此方法在實際操作中的可行性，采用免疫傳感器法檢測30 個未知樣品。 分析此數(shù)據(jù)，從30 個樣品中均沒有檢出阪崎腸桿菌。 同時，采用國標方法檢測30 個樣品，檢測結(jié)果與免疫傳感器法結(jié)果一致。 為了證明此方法可行，對其中兩個樣品按標準添加阪崎腸桿菌，然后做檢測，檢測結(jié)果為陽性，符合率達到100%。 證明此方法可行。

表1 國標方法和免疫電極法檢測奶粉樣品Table 1 Determination of milk powder samples by national standard method and immunoelectrode methods

2.6 納米免疫傳感器法檢驗阪崎腸桿菌的方案

2.6.1 樣品的增菌 按照1.3.5 節(jié)方法增菌。

2.6.2 納米免疫傳感器法檢測 按照1.3 節(jié)方法進行電極的預(yù)處理、 石墨烯-聚酰胺-胺復(fù)合物的制備以及免疫傳感器的制備。

2.6.3 電化學(xué)檢測 對免疫傳感器滴涂3～8 μL備用的培養(yǎng)液，室溫孵育20 min。 以Ag/AgCl 電極為參比電極，鉑絲（片）為對電極，阪崎腸桿菌免疫傳感器為工作電極，組成三電極測試系統(tǒng)，在電解質(zhì)溶液中進行電化學(xué)測試。 用差分脈沖伏安法掃描處理，掃描速度50 mV/s，電壓范圍-0.2 ～+0.6 V。

2.6.4 結(jié)果 被測樣本免疫前、 后傳感器的還原峰電流的變化值幾乎為0 時，未檢出阪崎腸桿菌。被測樣本免疫前、 后傳感器的還原峰電流的變化值ΔI 大于等于0.36 μA 時，阪崎腸桿菌篩選呈陽性。 若ΔI 在0～0.36 μA 之間，需重復(fù)1 次，結(jié)果仍是ΔI 在0～0.36 μA 之間， 說明阪崎腸桿菌未檢出。

3 結(jié)論

阪崎腸桿菌作為一種食源性致病菌， 可引起多種病狀。 基于阪崎腸桿菌與抗體的免疫電化學(xué)響應(yīng)， 提出以聚酰胺樹脂和石墨烯溶液修飾玻碳電極并加上辣根過氧化物酶標記的阪崎腸桿菌抗體為檢測阪崎腸桿菌工作電極的電化學(xué)檢測方法，構(gòu)建了一種速度快、靈敏度高、穩(wěn)定性強的納米免疫傳感器， 并應(yīng)用于實際嬰幼兒奶粉中阪崎腸桿菌的檢測。 采用微分脈沖法測定嬰幼兒奶粉中的阪崎腸桿菌，并對其檢測條件進行優(yōu)化，最佳條件為： 底液中過氧化氫濃度為0.5 mmol/L，pH 7.0 的PBS 溶液作為檢測底液， 孵育時間為20 min。采用微分脈沖伏安法確定阪崎腸桿菌的免疫響應(yīng)電流與其濃度之間的線性關(guān)系， 確定其線性方程為ΔIpc（μA）=1.1817 lgC-1.723，相關(guān)系數(shù)為0.9989，其最低檢測限達到5.8×101CFU/mL（S/N=3）。 此方法檢測奶粉中阪崎腸桿菌的結(jié)果與國標方法的結(jié)果一致， 說明此方法用于奶粉中阪崎腸桿菌的快速檢測是可行的，具有簡便、快速及準確的特點，在食品安全檢測方面具有應(yīng)用價值。

Rapid Determination of Enterobacter sakazakii in Infant Formula Powders by Nano-immunosensor Based on Dendrimer-PAMAM