基于SPME-MS技術識別不同生產(chǎn)工藝和醋齡的鎮(zhèn)江香醋

孫宗保 閆曉靜 劉 源 鄒小波* 李國權 周 軒 王天真 梁黎明

（1 江蘇大學食品與生物工程學院 江蘇鎮(zhèn)江212013 2 江蘇大學農(nóng)業(yè)工程研究院 江蘇鎮(zhèn)江212013 3 鎮(zhèn)江市食品藥品監(jiān)督檢驗中心 江蘇鎮(zhèn)江212000 4 江蘇恒順醋業(yè)股份有限公司 江蘇鎮(zhèn)江212000）

鎮(zhèn)江香醋是中國著名的食醋之一， 通過技術革新，將其傳統(tǒng)生產(chǎn)工藝逐漸轉變成機械化、規(guī)?；⒅悄芑妥詣踊默F(xiàn)代化生產(chǎn)工藝。 2 種生產(chǎn)工藝的主要區(qū)別在于食醋生產(chǎn)過程中酒精發(fā)酵階段菌種和發(fā)酵方式的不同。 傳統(tǒng)鎮(zhèn)江香醋生產(chǎn)工藝利用麥曲進行多菌種混合發(fā)酵， 麥曲中含有霉菌和酵母菌等， 多菌種的共同作用為鎮(zhèn)江香醋的色、香、味、形奠定了較好的基礎。用傳統(tǒng)工藝生產(chǎn)食醋的效率雖較低，但具有獨特風味，深受消費者喜愛，具有較高的市場價值，早在2006年就被首批列入國家非物質文化遺產(chǎn)名錄。 現(xiàn)代化鎮(zhèn)江香醋生產(chǎn)工藝是在酶制劑作用下經(jīng)液化、糖化，然后加入純化的釀酒酵母進行單菌種純種發(fā)酵， 確保了菌種品質，提高了淀粉利用率。在繼承傳統(tǒng)生產(chǎn)工藝優(yōu)勢的同時，借鑒先進技術，從最初的小批量醋壇發(fā)酵變成現(xiàn)在的大批量發(fā)酵罐發(fā)酵， 提高了生產(chǎn)效率。鎮(zhèn)江香醋風味物質形成，不僅與生產(chǎn)工藝有關，而且與后熟陳釀有關。 未經(jīng)陳釀的香醋，口感與香氣較差，隨著醋齡增加，形成的酯類物質較多，香醋具有明顯的香氣[1-2]。

2 種工藝生產(chǎn)以及不同醋齡食醋的風味各具特色。 目前食醋生產(chǎn)工藝與醋齡的標識不規(guī)范或存在假冒產(chǎn)品，導致食醋產(chǎn)業(yè)競爭秩序混亂。僅用感官評價或者簡單的理化試驗鑒別， 不僅操作過程費時、費力，而且結果具有較大的主觀性和片面性，這給消費者和生產(chǎn)者帶來一定的困擾。為維護市場秩序，幫助消費者辨識和選購，急需尋求行之有效的鑒別鎮(zhèn)江香醋生產(chǎn)工藝和醋齡的技術，使鎮(zhèn)江香醋得到更好的保護、傳承和發(fā)揚。

固相微萃取質譜技術（Solid phase micro extraction-mass spectrometry， SPME-MS）通過固相微萃取方法萃取樣品中的揮發(fā)性成分， 采用未涂層熔融石英毛細管柱替代毛細管色譜柱， 將萃取樣品的揮發(fā)性成分未經(jīng)色譜分離直接導入質譜儀，短時間內獲取所有揮發(fā)性成分的質譜信息，并結合化學計量學等數(shù)據(jù)分析方法對樣品定性、定量分析[3-4]。 與氣相色譜-質譜（GC-MS）檢測技術相比， 不需GC 分離， 具有檢測速度快的優(yōu)點，結合化學計量學方法更能達到快速識別目的[5-7]。 與光譜和嗅覺傳感器技術相比， 不易受環(huán)境影響。SPME-MS 技術結合化學計量學方法在食品檢測領域得到廣泛應用[8-9]。 尤其是在食品等級[10-12]、原產(chǎn)地[13]以及原材料[14-15]等的識別方面具有突出優(yōu)勢。 目前SPME-MS 用于香醋工藝及醋齡鑒別尚未見相關報道。 本研究選取不同醋齡的傳統(tǒng)工藝生產(chǎn)的鎮(zhèn)江香醋（手工醋）與現(xiàn)代化工藝生產(chǎn)的鎮(zhèn)江香醋（工業(yè)醋）為研究對象，利用線性判別分析（Linear discriminant analysis，LDA）、 支持向量機（Support vector machine，SVM）和反向傳播神經(jīng)網(wǎng)絡（Back-propagation neural network，BPANN）3種化學計量學方法鑒別， 同時比較3 種模型的預測效果，選取最佳鑒別模型。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

傳統(tǒng)工藝生產(chǎn)的鎮(zhèn)江香醋與現(xiàn)代化工藝生產(chǎn)的鎮(zhèn)江香醋均由鎮(zhèn)江香醋某生產(chǎn)企業(yè)提供。 2 種工藝鎮(zhèn)江香醋分別選取5 種醋齡：新醋（XC）、半年（BN）、2年（2N）、3年（3N）、4年（4N），每種醋齡各取30 個樣本， 獲得傳統(tǒng)工藝生產(chǎn)的鎮(zhèn)江香醋——手工醋（SG）和現(xiàn)代化工藝生產(chǎn)的鎮(zhèn)江香醋——工業(yè)醋（GY）各150 個樣本，共300 個樣本。

1.2 儀器與設備

HP6890-5973 氣相色譜-質譜聯(lián)用儀， 美國Agilent 公司；75 μm CAR-PDMS 萃取纖維頭，美國Supelco 公司；手動SPME 進樣器，美國Supelco公司；15 mL 帶硅膠墊的樣品瓶， 上海安譜公司；BS224S 電子天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；PC-420 磁力恒溫攪拌器， 美國Coing 公司；10 mL、100 μL 移液槍，熱電（上海）儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 SPME 預處理 將8 mL 醋樣、2.5 g NaCl、轉子放入15 mL 樣品瓶中。 磁力恒溫攪拌器溫度設置為50 ℃，轉速250r/min，將樣品恒溫水浴平衡5 min。 將75 μm CAR-PDMS 萃取頭插入樣品液面上方1 cm 處，頂空萃取20 min。 萃取完成后將萃取頭插入GC-MS 的氣相色譜進樣口，解吸脫附5 min。 每個醋樣平行測定3 次。

1.3.2 色譜條件 色譜柱： 未涂層熔融石英毛細管柱（1 m×0.15 mm i.d.）；升溫程序：柱溫200 ℃，保持6 min；載氣（He）流速1.1 mL/min；進樣口溫度280 ℃；不分流進樣。

1.3.3 質譜條件 電離方式EI+； 電子能量70 eV；離子源溫度200 ℃；接口溫度250 ℃；質量掃描范圍m/z 33～400 amu。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

通過SPME-MS 技術檢測2 種工藝生產(chǎn)的5種醋齡鎮(zhèn)江香醋，獲得質荷比m/z 33～400 amu 范圍的離子豐度值，即質譜數(shù)據(jù)。對每個樣本的3 次平行質譜數(shù)據(jù)求取平均值作為該樣本的質譜數(shù)據(jù)，按行排列成數(shù)據(jù)矩陣，并用MATLAB 軟件數(shù)據(jù)分析。

首先利用MATLAB 自帶的歸一化函數(shù)mapminmax 對原始數(shù)據(jù)歸一化預處理，然后利用主成分分析（PCA）對預處理后的數(shù)據(jù)降維，提取主成分數(shù)。 最后選取總樣本的2/3 作為訓練集，1/3 作為預測集， 利用LDA，SVM，BPANN3 種化學計量學方法建立鑒別模型， 通過比較3 種模型的識別率獲得最佳鑒別模型。

2 結果與分析

通過SPME-MS 技術檢測2 種工藝生產(chǎn)的5種醋齡鎮(zhèn)江香醋，獲得質荷比在33～400 amu 范圍內的離子豐度值。 通過對平均離子豐度質譜圖的直觀分析， 發(fā)現(xiàn)不同生產(chǎn)工藝和醋齡的鎮(zhèn)江香醋樣本中既有相似的離子信息也有差異較明顯的離子信息。 以手工新醋與工業(yè)新醋的平均離子豐度質譜圖（圖1）為例，首先兩者具有相似的變化趨勢：質荷比為96 的離子豐度值最高，是糠醛的特征離子； 高質荷比的離子豐度值明顯低于低質荷比的離子豐度值，某些甚至趨于0。 其次，某些離子的平均豐度值存在差異， 手工新醋中離子平均豐度值較高的有質荷比為39，69，96，而工業(yè)新醋中離子平均豐度值較高的有質荷比為39，55，73，96。 由于通過SPME-MS 技術獲取的鎮(zhèn)江香醋總離子流圖中包含了豐富的離子信息， 僅依靠直觀分析質譜圖差異難以對鎮(zhèn)江香醋的生產(chǎn)工藝和醋齡進行有效鑒別， 因此嘗試利用化學計量學方法建立鑒別模型， 實現(xiàn)對不同工藝和醋齡的鎮(zhèn)江香醋的準確區(qū)分。

圖1 手工新醋與工業(yè)新醋在m/z 33～400 范圍內的離子豐度質譜圖Fig.1 The mass spectrum of the traditional and modern Zhenjiang fresh vinegar in the range of m/z 33-400

2.1 主成分分析結果

選用MATLAB 自帶的歸一化函數(shù)mapminmax 對原始數(shù)據(jù)歸一化預處理， 使所有數(shù)據(jù)處于相同范圍內， 變量分布更加均衡。 主成分分析（PCA）通常用于數(shù)據(jù)可視化的第1 階段[16]，把多個變量化成少數(shù)幾個主成分， 通常為原始變量的線性組合，可以避免信息重疊、簡化數(shù)據(jù)量，廣泛應用于數(shù)據(jù)分析中。主成分得分圖，在一定程度上反映樣本的聚類趨勢， 各類樣本在主成分空間有不同的分布[17-19]。

圖2 鎮(zhèn)江香醋樣本的三維主成分得分圖Fig.2 3-Dimension score plot of the Zhenjiang aromatic vinegar in the different ageings after PCA

將每個樣本的3 次平行質譜數(shù)據(jù)求取的平均值作為該樣本的質譜數(shù)據(jù)，按行排列成數(shù)據(jù)矩陣。經(jīng)歸一化預處理， 使所有數(shù)據(jù)范圍在-1～1 之間。使用PCA 方法對預處理后的數(shù)據(jù)降維，提取主成分數(shù)，便于本研究所用模型的輸入。以前3 個主成分為坐標軸， 得到鎮(zhèn)江香醋樣本的三維主成分得分圖（圖2），結果發(fā)現(xiàn)樣本分布在3 個區(qū)域，而且不同工藝相同醋齡的樣本呈現(xiàn)一定的聚類趨勢：手工新醋與工業(yè)新醋重疊在一起， 與其它樣本明顯區(qū)分； 半年醋、2年醋和4年醋分布在一個區(qū)域， 而工業(yè)半年和工業(yè)4年醋不僅未出現(xiàn)樣本間重疊，而且與該區(qū)域內其它香醋樣本區(qū)分明顯；手工3年醋與工業(yè)3年醋分布在同一個區(qū)域， 沒有重疊樣本出現(xiàn)，區(qū)分效果較好。陳釀時間較短的樣本與陳釀時間較長的樣本區(qū)分較為明顯， 陳釀期越接近，品質越接近，分布越集中。 紅色標記的樣本代表手工醋，藍色標記的樣本代表工業(yè)醋，從圖2 可以看出手工醋和工業(yè)醋樣本重疊現(xiàn)象較為嚴重，難以區(qū)分。 需進一步利用LDA，SVM，BPANN方法鑒別工藝、醋齡及不同醋齡的兩種工藝醋。

2.2 不同生產(chǎn)工藝鎮(zhèn)江香醋的識別結果

BPANN 方法主要特點是信號前向傳遞，誤差反向傳播，具有較強的運算能力[20-22]。 SVM 方法是建立一個分類超平面作為決策曲面， 使來自于訓練集分布的少量樣本接近類之間的邊界[18，23]。LDA方法是一種有監(jiān)督的模式識別方法， 組間距離的長短決定組間差異的大小， 可以實現(xiàn)不同模式的分類[24-25]。

僅識別1.1 節(jié)所有樣本中鎮(zhèn)江香醋的不同生產(chǎn)工藝，不考慮醋齡。 利用SPME-MS 技術獲取其質譜數(shù)據(jù)，運用PCA 方法選取不同主成分數(shù)作為輸入變量并分別建立LDA，SVM，BPANN 鑒別模型，其中訓練集中共有200 個樣本（手工醋與工業(yè)醋樣本各100 個），測試集中共有100 個樣本（手工醋與工業(yè)醋樣本各50 個）， 鑒別結果如表1 所示。 當主成分數(shù)較低時，LDA 與SVM 模型訓練集誤判率很高。 隨著主成分數(shù)增加， 識別率逐漸提高。 當最佳主成分數(shù)達到7 時， SVM 模型訓練集和測試集的正確率均達到91%。 當最佳主成分數(shù)為8 時，LDA 模型的訓練集的識別率達到100%，而測試集識別率為98%。 建立BPANN 模型時，優(yōu)化模型的各個參數(shù)，通過比較多次試驗結果，最終分別選取目標誤差為10-8，學習速率0.1，動量因子0.7， 網(wǎng)絡學習次數(shù)1 000 次。 鑒別結果如表1所示， 當主成分數(shù)為7 時， 訓練集識別率達到100%， 測試集識別率99%， 只有一個樣本誤判。BPANN 模型的鑒別結果較好，可作為有效識別手工醋與工業(yè)醋的手段。

表1 LDA，SVM，BPANN 模型在不同主成分數(shù)下訓練集和測試集的結果Table 1 The discriminating results of LDA， SVM and BPANN model in training set and test set under different principal components

2.3 不同醋齡鎮(zhèn)江香醋識別結果

僅識別1.1 節(jié)所有樣本中不同醋齡的鎮(zhèn)江香醋，不考慮生產(chǎn)工藝方式。 利用SPME-MS 技術獲取其質譜數(shù)據(jù)，運用PCA 方法選取不同主成分數(shù)作為輸入變量并分別建立LDA，SVM，BPANN 識別模型， 其中訓練集中共有200 個樣本（XC，BN，2N，3N，4N 樣本各40 個）， 測試集中共有100 個樣本（XC，BN，2N，3N，4N 樣本各20 個），鑒別結果如表2 所示。 隨著主成分數(shù)不斷增加，3 種判別模型的測試集和訓練集的識別率不斷上升。 當主成分數(shù)為7 時，SVM 模型的訓練集和測試集識別率均為90%，BPANN 模型的訓練集識別率達100%，而測試集識別率為99%，只有一個樣本識別錯誤。 此時，BPANN 模型中的各個優(yōu)化參數(shù)與2.2 節(jié)一致。 當主成分數(shù)為9，LDA 模型訓練集的識別率達到89.5%， 測試集的識別率達到84%。BPANN 模型的效果最佳。

提取前9 個主成分作為線性判別分析模型輸入變量， 得到不同醋齡鎮(zhèn)江香醋的線性判別分析二維得分圖（圖3）。隨著醋齡增加，樣本在LD1 的方向上從左至右分布，說明未經(jīng)陳釀（新醋）或陳釀時間較短的醋樣（半年醋和2年醋）與陳釀時間較長的醋樣（3年醋和4年醋）得到顯著區(qū)分；而新醋與半年醋因陳釀期接近而無法區(qū)分。

圖3 不同醋齡鎮(zhèn)江香醋的線性判別分析二維得分圖Fig.3 The LDA 2-dimensional diagram of Zhenjiang aromatic vinegar with different ages

表2 LDA，SVM，BPANN 在不同主成分數(shù)下訓練集和測試集的結果Table 2 The discriminating results of LDA， SVM and BPANN in training set and test set under different principal components

2.4 不同醋齡的手工醋與工業(yè)醋識別結果

同時識別1.1 節(jié)所有鎮(zhèn)江香醋樣本中的醋齡和生產(chǎn)工藝方式。 利用SPME-MS 技術獲取其質譜數(shù)據(jù)，運用PCA 方法選取不同主成分數(shù)作為輸入變量并分別建立LDA，SVM，BPANN 識別模型，其中訓練集中共有200 個樣本（SGXC，GYXC，SGBN，GYBN，SG2N，GY2N，SG3N，GY3N，SG4N，GY4N 樣本各20 個）， 測試集中共有100 個樣本（SGXC，GYXC，SGBN，GYBN，SG2N，GY2N，SG3N，GY3N，SG4N，GY4N 樣本各10 個），鑒別結果如表3 所示。 隨著主成分因子數(shù)不斷增加，訓練集和測試集的識別率基本呈增加趨勢， 當主成分因子數(shù)為6，SVM 模型訓練集和測試集的識別率分別為96%和95%； 當主成分因子數(shù)為7 時，BPANN 模型訓練集和測試集的識別率分別達到100%和99%，LDA 模型訓練集和測試集的識別率均達到100%。 此時，BPANN 模型中的各個優(yōu)化參數(shù)與2.2 節(jié)相同。

提取前7 個主成分作為線性判別分析的模型輸入，得到2 種工藝、不同醋齡鎮(zhèn)江香醋的線性判別分析二維得分圖（圖4）。 由圖4 可知，紅色代表手工醋，基本位于LD2 的負半軸，新醋與半年醋、3年醋與4年醋區(qū)分不明顯， 而2年醋與其它年份醋得到很好地區(qū)分，并且醋齡稍短（新醋、半年）的手工醋與醋齡較長（3年、4年）的手工醋相距較遠，因此在LD1 方向上陳釀期從左至右依次增長。藍色代表工業(yè)醋，除工業(yè)新醋外均位于LD2 的正半軸，不同醋齡的醋樣間無重疊，區(qū)分較為明顯，而且工業(yè)醋的醋齡分布與手工醋分布相似， 說明手工醋與工業(yè)醋、 陳釀期較短與較長的醋樣之間的品質存在差異。

圖4 兩種工藝不同醋齡鎮(zhèn)江香醋的線性判別二維得分圖Fig.4 The LDA 2-dimensional diagram of Zhenjiang vinegar with two brewing process and different agings

表3 LDA，SVM，BPANN 在不同主成分數(shù)下訓練集和測試集的結果Table 3 The discriminating results of LDA， SVM and BPANN in training set and test set under different principal components

3 結論

本研究采用SPME-MS 技術結合化學計量學方法識別2 種生產(chǎn)工藝生產(chǎn)的5 種醋齡鎮(zhèn)江香醋。 利用SPME 技術提取鎮(zhèn)江香醋中的揮發(fā)性成分，不經(jīng)色譜分離直接導入質譜儀獲取質譜信息。以獲取的離子豐度值為變量，利用PCA 方法對數(shù)據(jù)降維，選取不同主成分數(shù)作為輸入變量，分別建立LDA，BPANN，SVM 模型，以訓練集和測試集的識別率作為衡量模型優(yōu)劣的指標，主要結論如下：

1）分別區(qū)分2 種生產(chǎn)工藝的鎮(zhèn)江香醋和5種醋齡鎮(zhèn)江香醋，發(fā)現(xiàn)BPANN 模型的訓練集識別率達到100%， 而測試集識別率為99%， 說明BPANN 模型能有效區(qū)分鎮(zhèn)江香醋的生產(chǎn)工藝和醋齡，原因可能是采用SPME-MS 技術獲取的質譜數(shù)據(jù)是所有揮發(fā)性成分整體作用的結果， 而這種作用與生產(chǎn)工藝或醋齡之間的聯(lián)系較為復雜，這種復雜的關系更傾向于非線性關系，BPANN 模型的結果優(yōu)于LDA 和SVM 模型。

2）同時區(qū)分鎮(zhèn)江香醋的工藝和醋齡， 發(fā)現(xiàn)LDA 模型具有優(yōu)勢， 其訓練集和測試集的識別率均達到100%。 因LDA 模型考慮了類與類之間的差異，并將差異最大化，故使2 種生產(chǎn)工藝生產(chǎn)的5 種醋齡鎮(zhèn)江香醋得以區(qū)分。

不同生產(chǎn)工藝和醋齡的鎮(zhèn)江香醋風味存在差異，利用SPME-MS 方法結合不同的化學計量學方法可以很好地區(qū)分，解決了常規(guī)檢測方法復雜、耗時等問題，可以達到快速鑒別的目的，使鎮(zhèn)江香醋得到更好地保護、傳承和發(fā)揚。