微藻裂殖壺菌藻粕酶解肽抑制水產(chǎn)魚類腸道炎癥的功效研究

李孟研 柴力彬 張延杰 鄺麗紅 李 昊，2*

（1 福州大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院 應(yīng)用生物技術(shù)研究所 福州350108 2 福建藍(lán)昊生物科技有限公司 福州350109）

魚類水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)為人類提供了大量?jī)?yōu)質(zhì)動(dòng)物蛋白食品，其產(chǎn)業(yè)增長(zhǎng)速度迅猛。 隨著集約化、工廠化養(yǎng)殖的大幅度增加，各類養(yǎng)殖病害急劇上升，如果不對(duì)疾病進(jìn)行及時(shí)的預(yù)防和控制， 就會(huì)導(dǎo)致養(yǎng)殖水產(chǎn)動(dòng)物大規(guī)模死亡。 魚類腸道不僅是消化及營(yíng)養(yǎng)吸收的主要器官[1]，也是體內(nèi)病原微生物及毒素聚集的主要場(chǎng)所， 因此魚類腸道炎癥是目前最為普遍的養(yǎng)殖疾病。 目前臨床上還沒(méi)有開(kāi)發(fā)出針對(duì)魚類腸炎性疾病的靶向性藥物， 大多是使用人類藥物或獸藥對(duì)魚類腸炎進(jìn)行治療， 然而長(zhǎng)期頻繁使用抗生素等化學(xué)物質(zhì)， 不僅會(huì)使魚體產(chǎn)生耐藥性， 降低其抗病能力， 而且還會(huì)導(dǎo)致藥物殘留。 此類物質(zhì)在魚類體內(nèi)殘留，被人體攝入后，對(duì)人體健康也會(huì)造成嚴(yán)重危害。 迫切需要應(yīng)用現(xiàn)代生物技術(shù)， 開(kāi)發(fā)既能防治疾病又無(wú)毒副作用的水產(chǎn)藥物替代品。

生物活性肽是氨基酸以酰胺鍵互相連接在一起形成的具有多種生物活性的化合物[2]。其對(duì)生物機(jī)體具有一定的生理作用，例如抗炎[3]、抗微生物[4]以及抗氧化[5]等作用，在食品科學(xué)、飼料添加以及生物醫(yī)藥等方面具有重要的應(yīng)用價(jià)值。 生物活性肽不僅有強(qiáng)大的生理功能， 而且易于消化吸收[6]，對(duì)生物體沒(méi)有任何毒副作用和依賴性， 是具有長(zhǎng)遠(yuǎn)發(fā)展的功能因子。 目前應(yīng)用生物活性肽治療魚類腸道炎癥疾病鮮有研究。 本課題組通過(guò)研究生物活性肽抑制魚類腸道炎癥的功效及機(jī)理， 為開(kāi)發(fā)新型抗炎癥水產(chǎn)藥替代品提供了重要的理論依據(jù)，為新型水產(chǎn)品養(yǎng)殖提供關(guān)鍵技術(shù)。

魚類腸炎在魚類疾病中最為常見(jiàn)， 是養(yǎng)殖用戶最棘手的問(wèn)題。 魚類腸炎具體的發(fā)病原因主要包括水質(zhì)中存在微生物以及營(yíng)養(yǎng)過(guò)剩時(shí)會(huì)引發(fā)病原菌的大量繁殖，導(dǎo)致魚類腸炎和其它病癥；體內(nèi)寄生蟲引起的腸炎；飼料引起的腸炎[7]。 細(xì)菌感染引起的腸道炎癥以及藥物引起的腸炎， 如大量使用抗生素可使魚腸道內(nèi)正常菌群減少， 導(dǎo)致耐抗生素菌群改變腸道內(nèi)的微環(huán)境， 最終引起腸道炎癥。

針對(duì)魚類腸道炎癥使用的藥物為抗菌類藥物，包括抗生素類[8]、磺胺類和喹諾酮類。其殺菌方式主要有3 種，分別是阻止蛋白質(zhì)的合成，破壞細(xì)胞壁的形成以及影響DNA 的復(fù)制。長(zhǎng)期使用抗生素會(huì)打破機(jī)體內(nèi)微生態(tài)平衡[9]，導(dǎo)致條件致病菌占上風(fēng)，從而引發(fā)機(jī)體內(nèi)源感染。 同時(shí)，某些抗生素進(jìn)入機(jī)體后無(wú)法代謝而導(dǎo)致魚體內(nèi)藥物殘留[10]，從而間接危害人類健康。 由于抗生素會(huì)給人類及牲畜帶來(lái)很多副作用，因此，許多抗菌類藥物被禁用，例如抗生素類中的紅霉素、氯霉素、呋喃唑酮和呋喃西林等藥物，磺胺類藥物中的磺胺噻唑和磺胺咪等被禁止用于魚類疾病防治和飼料添加劑。

目前，上述漁藥類都沒(méi)有針對(duì)性的治療作用，大多是使用人類藥物或獸藥治療魚類腸炎， 而長(zhǎng)期使用抗生素等化學(xué)物質(zhì)， 不僅導(dǎo)致魚類自身腸黏膜免疫系統(tǒng)遭到破壞，降低其抗病能力，而且頻繁使用這些藥物還會(huì)有藥物殘留現(xiàn)象。 本文研究生物活性肽抑制魚類腸道炎癥的功效及機(jī)理，研發(fā)水產(chǎn)藥物替代品。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 藻粕 海洋微藻裂殖壺菌藻粕及飼料中的維生素AD 復(fù)合物由廈門金達(dá)威集團(tuán)股份有限公司提供。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 草魚100 尾，體重（35±5）g；鰻魚100 尾，體重（50±5）g，分別分為正常組、陰性組、 陽(yáng)性對(duì)照恩諾沙星組以及裂殖壺菌酶解產(chǎn)物和復(fù)合飼料中維生素AD 組，簡(jiǎn)稱MESH 組，共4組，每組10 尾，由福州大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院提供。

1.1.3 試劑及配制 5%三硝基苯磺酸（TNBS），美國(guó)Sigma 公司；無(wú)水乙醇、甲醛及磷酸鹽緩沖液，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；PBS 所用試劑為分析純級(jí)。

2.5%三硝基苯磺酸溶液配制：5%TNBS 水溶液和無(wú)水乙醇 （按體積比1 ∶1）配制成2.5%的TNBS 乙醇溶液[11-12]，現(xiàn)配現(xiàn)用。

動(dòng)物組織固定液的配制：將100 mL 甲醛加入800 mL 磷酸鹽緩沖溶液中，定容1 000 mL，混合均勻，常溫保存。 PBS 所用試劑為分析純級(jí)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)魚的飼養(yǎng) 將草魚和鰻魚分別放在魚缸里飼養(yǎng)，試驗(yàn)用水為充分曝氣的自來(lái)水，水溫控制在（25±2）℃，并使用增氧泵24 h 不間斷充氧。適應(yīng)期間飼喂不含任何藥物的全價(jià)飼料（飼料中含有維生素AD），每天9：00 投喂，飼喂量為魚體重的1%。 每?jī)商旄鼡Q1 次水， 每次換水量約為30%并及時(shí)清除水底殘餌和排泄物。

1.2.2 TNBS 腸道炎癥模型的建立 將5%TNBS水溶液和無(wú)水乙醇配制成2.5%的TNBS 乙醇溶液。 參考趙杰等[13]的方法，確定TNBS 的灌注量為魚體質(zhì)量80～90 mg/kg，即規(guī)格為35 g 左右的實(shí)驗(yàn)魚。2.5%TNBS 乙醇溶液灌注量約0.13 mL，不會(huì)造成實(shí)驗(yàn)魚死亡并有明顯的腸道炎癥。 實(shí)驗(yàn)魚被灌注2.5%TNBS 乙醇溶液或PBS 前，禁食24 h，以清除腸道內(nèi)排泄物。 將實(shí)驗(yàn)魚放入質(zhì)量濃度為60 mg/L 的MS-222 溶液中浸泡麻醉5 min[14]，用灌胃針輕輕推入魚肛門上端3 cm 處， 緩慢灌入2.5%TNBS 乙醇溶液。 灌注等體積PBS 作為正常組，灌注后將灌胃針保持在原位30 s 后緩慢抽出， 將魚倒置30 s，確保灌注試劑不會(huì)流出。

1.2.3 腸道炎癥的防治方法 取配制好的酶解液MESH 溶液、恩諾沙星溶液和PBS 溶液，在實(shí)驗(yàn)魚適應(yīng)7 d 后，對(duì)其腸道炎癥做預(yù)防處理。每天9：00分別投喂含有不同藥物的飼料， 飼喂量為實(shí)驗(yàn)魚體重的1%，連續(xù)投喂7 d。正常組、陰性組按PBS 0.01 mol/L，恩諾沙星組按10 mg/kg，MESH 組按2.5 mg/kg 的藥餌劑量給藥。 用噴霧器均勻地噴灑在飼料上，使每一顆都沾上MESH、恩諾沙星和PBS溶液，將配制好的藥餌放入25 ℃烘箱烘干。 提前1 d 配制好，放入4 ℃冰箱保存。

1.2.4 疾病活動(dòng)指數(shù)評(píng)分（DAI）為了更好地監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)魚患腸炎的過(guò)程，通過(guò)表1 的評(píng)分系統(tǒng)[15-16]，對(duì)實(shí)驗(yàn)魚腸道炎癥進(jìn)行整體性評(píng)價(jià)。 從建立實(shí)驗(yàn)魚腸道炎癥模型的第1 天開(kāi)始， 每天對(duì)魚游動(dòng)能力、攝食量、肛門炎癥、體表充血和腹水等體表形態(tài)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)評(píng)分。 該評(píng)分可以直觀反映實(shí)驗(yàn)魚腸道炎癥水平。疾病活動(dòng)指數(shù)評(píng)分越高，其腸道炎癥越嚴(yán)重；反之，其健康狀況良好。

1.2.5 試驗(yàn)樣品的獲取及處理方法 使用60 mg/L 的MS-222 溶液將實(shí)驗(yàn)魚浸泡麻醉，然后從肛門處插入手術(shù)剪， 沿腹中線向前經(jīng)腹鰭中間剪至下頜。 將魚側(cè)臥，左側(cè)向上，自肛門處向背上方剪到脊柱，沿脊柱下方剪至鰓蓋后緣，再沿鰓蓋后緣剪至下頜，除去左側(cè)體壁肌肉，使內(nèi)臟暴露在外，用鑷子將魚整條腸道取出。 使用預(yù)冷的PBS 將腸道沖洗干凈，用于蘇木精-伊紅（Hematoxylin-eosin，HE）染色。

表1 疾病活動(dòng)指數(shù)打分Table 1 Criteria for scoring disease activity index

1.2.6 消化道指數(shù)的測(cè)定 患腸炎的實(shí)驗(yàn)魚腸道會(huì)相應(yīng)變短，腸壁變薄（甚至透明），腸的質(zhì)量明顯下降。消化道指數(shù)可反映實(shí)驗(yàn)魚腸道炎癥的程度。

實(shí)驗(yàn)魚被灌注TNBS 或者PBS 1，3，7 d 后，分別對(duì)其進(jìn)行活體解剖， 觀察腸道炎癥反應(yīng)狀況并測(cè)量魚的體重、體長(zhǎng)（自吻端到尾鰭部）、腸長(zhǎng)和腸重。 計(jì)算實(shí)驗(yàn)魚消化道指數(shù)。 消化道指數(shù)[17]：

1.2.7 髓過(guò)氧化物酶的測(cè)定 髓過(guò)氧化物酶（MPO）是中性粒細(xì)胞特有的酶。在炎癥狀態(tài)下，它被釋入細(xì)胞外液，進(jìn)入循環(huán)。 MPO 在中性粒細(xì)胞中含量是一定的， 通過(guò)供氫體鄰連茴香胺供氫后生成黃色化合物，在波長(zhǎng)460 nm 處用比色法測(cè)定MPO 的活力。

分別在肛灌TNBS 或PBS 后的第1，3，7 天對(duì)近肛門一段的后腸取樣，用于MPO 活性檢測(cè)。 檢測(cè)方法按照南京建成生物工程研究所MPO 試劑盒說(shuō)明書操作。

1.2.8 組織切片及HE 染色方法 將固定在10%福爾馬林溶液中24～48 h 的腸道取出， 用預(yù)冷的PBS 沖洗腸道，然后用鑷子夾住肛門遠(yuǎn)端一側(cè)，將腸道的內(nèi)側(cè)暴露于外面，旋轉(zhuǎn)鑷子，向腸道近肛門端，一圈圈纏繞成“螺絲狀”，將卷好的腸道用大頭針固定后置于包埋盒里， 常溫保存于10%福爾馬林溶液固定。 按蘇木精-伊紅（Hematoxylin-eosin，HE）染色常規(guī)方法染色。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

用Microsoft Excel 2016 軟件進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)均用（±s）表示，組間比較用T-test 檢驗(yàn)，**、## 代表P＜0.01，*、# 代表P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

將體重 （35±5）g 的草魚隨機(jī)分成正常組、陰性組、陽(yáng)性對(duì)照恩諾沙星組和活性肽MESH 組，每組18 尾。 草魚被灌注TNBS 或PBS 1，3，7 d 后分別對(duì)其進(jìn)行活體解剖， 結(jié)果顯示活性肽MESH 可明顯改善草魚體表形態(tài)及腸道損傷程度， 降低疾病活動(dòng)指數(shù)，表現(xiàn)出顯著的抗腸道炎癥作用?；寄c炎的草魚隨著病情的加重消化道指數(shù)明顯下降，而活性肽MESH 可有效緩解患病期草魚消化道指數(shù)的下降程度。 髓過(guò)氧化物酶（MPO）的活性隨著炎癥程度的增加而升高， 活性肽MESH 抑制中性粒細(xì)胞含量增加，從而降低MPO 活性。 不同試驗(yàn)組草魚腸道組織病理變化存在明顯差異， 活性肽MESH 組實(shí)驗(yàn)魚腸灌1 d 后，其腸道炎癥現(xiàn)象與其它試驗(yàn)對(duì)照組相比，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)較少，腸絨毛只有少部分脫落，結(jié)締組織腫脹程度不高。 腸灌3 d后，其恢復(fù)速度明顯高于陰性組和陽(yáng)性對(duì)照組，腸道炎性細(xì)胞數(shù)量逐漸減少，腸絨毛開(kāi)始迅速恢復(fù)。腸灌7 d 后， 腸道病理組織切片與正常組相比基本一致， 說(shuō)明活性肽MESH 通過(guò)維持草魚腸黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu)的完整性，促進(jìn)腸道細(xì)胞及組織恢復(fù)，從而達(dá)到防治的效果。

2.1 活性肽對(duì)草魚腸道炎癥的影響分析

2.1.1 草魚肛門及腸道炎癥反應(yīng)結(jié)果 根據(jù)草魚體表及腸道組織結(jié)構(gòu)表面的變化， 判斷草魚腸道炎癥的程度。 草魚被灌注TNBS 或PBS 1，3，7 d后， 對(duì)活體解剖， 觀察肛門及腸道炎癥的反應(yīng)狀況。

正常組，圖1a 所示，灌注PBS 1 d 后肛門及腸道炎癥狀況，肛門周圍無(wú)炎癥現(xiàn)象。解剖后取其腸道觀察， 腸道粘膜形狀連續(xù)且有韌性， 糞便成形，腸壁無(wú)充血情況。 如圖2a 及圖3a 所示，灌注PBS 3 d 及7 d 后肛門及腸道炎癥狀況，與第1 天相同，肛門及腸道并沒(méi)有炎癥狀況。

陰性組，圖1b 所示，灌注TNBS 致炎1 d 后，其體表有多處掉鱗現(xiàn)象，胸鰭基部有充血，肛門周圍炎癥明顯，腸道內(nèi)沒(méi)有食物，腸黏膜充血，腸道末端糜爛嚴(yán)重，有明顯的腸道炎癥現(xiàn)象。 如圖2b所示，灌注TNBS 致炎3 d 后，肛門周圍炎癥區(qū)域有擴(kuò)大現(xiàn)象，輕擠壓腹部有黃色液體流出，腸道內(nèi)的糞便間有很長(zhǎng)的透明的“膠體”，形成“腸套”，腸壁變薄， 腸黏膜充血糜爛， 有嚴(yán)重的腸道炎癥現(xiàn)象。 如圖3b 所示，灌注TNBS 7 d 后，其肛門周圍炎癥狀況有所減輕，解剖后觀察其腸道，腸道內(nèi)有少量食物，腸壁部分充血。

圖1 不同處理組草魚腸灌1 d 后肛門及腸道組織炎癥反應(yīng)Fig.1 Inflammatory response of anal and intestinal tissues of grass carp after intestinal enema for 1 day in different treatment groups

恩諾沙星組，如圖1c 所示，灌注TNBS 致炎1 d 后，肛門周圍發(fā)紅，解剖后取其腸道觀察，腸道內(nèi)有不成形的食物，腸道近肛門端有充血現(xiàn)象。如圖2c 所示，灌注TNBS 3 d 后，肛門周圍炎癥區(qū)域擴(kuò)大，腸道內(nèi)有成型的食物，前腸有充血現(xiàn)象。 如圖3c 所示， 灌注TNBS 7 d 后， 肛門周圍炎癥好轉(zhuǎn)，腸道有一定的韌性，腸壁無(wú)充血現(xiàn)象。

活性肽MESH 組， 如圖1d 所示， 灌注TNBS致炎1 d 后，腹部有充血現(xiàn)象，肛門周圍有輕微的炎癥， 解剖后取其腸道觀察， 腸道內(nèi)有少量的食物， 腸壁末端有充血現(xiàn)象。 如圖2d 所示， 灌注TNBS 致炎3 d 后，體表好轉(zhuǎn)無(wú)充血現(xiàn)象，肛門周圍炎癥依然存在，腸道內(nèi)有成型的糞便。 如圖3d所示，灌注TNBS 致炎7 d 后，體表完好，肛門周圍炎癥好轉(zhuǎn)，腸道連續(xù)且有韌性，腸壁較厚。

圖2 不同處理組草魚腸灌3d 后肛門及腸道組織炎癥反應(yīng)Fig.2 Inflammatory response of anal and intestinal tissues of grass carp after 3 days enema in different treatment groups

圖3 不同處理組草魚腸灌7d 后肛門及腸道組織炎癥反應(yīng)Fig.3 Inflammatory response of anal and intestinal tissues of grass carp in different treatment groups after 7 days enema

綜上所述， 根據(jù)肛門及腸道炎癥現(xiàn)象，MESH組在腸灌TNBS1d 后相較于陰性組和恩諾沙星組，肛門周圍炎癥區(qū)域顯著縮小，腸道充血現(xiàn)象較輕，說(shuō)明活性肽MESH 有一定的預(yù)防效果。通過(guò)后期對(duì)草魚的治療，可以觀察到MESH 組灌注TNBS 3 d 及7 d 后，肛門及腸道周圍炎癥恢復(fù)速度明顯高于陰性組，具體表現(xiàn)為：肛門周圍炎癥區(qū)域明顯縮小，腸道連續(xù)且有韌性。 灌注TNBS 7 d 后肛門和腸道組織恢復(fù)到與正常組幾乎相同的水平，說(shuō)明活性肽MESH 有治療草魚腸道炎癥的效果。

2.1.2 草魚臨床評(píng)分 草魚的疾病活動(dòng)指數(shù)評(píng)分越高，其腸道炎癥越嚴(yán)重；反之，說(shuō)明草魚健康狀況良好。不同處理組草魚疾病活動(dòng)指數(shù)（DAI）評(píng)分見(jiàn)圖4。

如圖4 所示，草魚在灌注TNBS 后，其游動(dòng)能力明顯緩慢， 攝食量減少， 肛門周圍炎癥現(xiàn)象明顯，與正常組相比較疾病活動(dòng)指數(shù)顯著升高，說(shuō)明腸道灌注TNBS 的草魚都有不同程度的炎癥。MESH 組灌注TNBS 1 d 后，其疾病活動(dòng)指數(shù)與陰性組相比顯著下降（P＜0.01），說(shuō)明通過(guò)前期對(duì)草魚腸道進(jìn)行為期7 d 的藥餌投喂， 達(dá)到預(yù)防腸道炎癥的效果。 通過(guò)后期的治療，MESH 組疾病活動(dòng)指數(shù)一直處于下降的狀態(tài)， 與陰性組草魚疾病活動(dòng)指數(shù)相比有顯著性差異（P＜0.01），且疾病活動(dòng)指數(shù)一直低于恩諾沙星組， 說(shuō)明活性肽MESH 對(duì)草魚腸道炎癥有一定的治療效果， 比恩諾沙星的效果顯著。

圖4 不同處理組草魚疾病活動(dòng)指數(shù)（DAI）評(píng)分Fig.4 Disease activity index score of grass carp in different treatment groups

2.1.3 草魚消化道指數(shù) 草魚被灌注TNBS 或PBS 1，3，7 d 后分別對(duì)其活體解剖。觀察腸道炎癥反應(yīng)狀況并測(cè)量草魚體重、體長(zhǎng)（自吻端至尾鰭基部）、腸長(zhǎng)以及腸重，計(jì)算草魚消化道指數(shù)。結(jié)果見(jiàn)圖5～6。

消化道指數(shù)反映草魚腸道炎癥的程度。 如圖6 所示，灌注TNBS 1 d 后的實(shí)驗(yàn)魚，與正常組相比，比腸重明顯下降，陰性組尤為顯著（P＜0.01），下降了33.81%。 MESH 組與陰性組相比較，比腸重上升了21.58%，且有顯著性差異（P＜0.05）。灌注TNBS 3 d 后，恩諾沙星組和陰性組比腸重還在持續(xù)下降，而MESH 組明顯上升，與陰性組比較有顯著性差異（P＜0.01）。 灌注TNBS 7 d 后，恩諾沙星組和MESH 組幾乎與正常組相一致， 而陰性組仍顯著低于正常組。如圖5 所示，在各試驗(yàn)組之間比腸長(zhǎng)差異并不顯著，說(shuō)明TNBS 誘導(dǎo)草魚炎癥，使其腸道長(zhǎng)度縮短不明顯。 綜上所述，TNBS 灌注草魚后，引起腸黏膜脫落，腸質(zhì)量顯著下降，從而引起不同程度的腸道炎癥。MESH 組灌注TNBS 后有一定的腸炎，其嚴(yán)重程度明顯輕于陰性組，且灌注TNBS 3 d 后，其比腸重高于恩諾沙星組，說(shuō)明活性肽MESH 對(duì)草魚的腸炎有一定的防治效果，且治療效果比恩諾沙星顯著。

圖5 不同處理組草魚比腸長(zhǎng)的變化情況Fig.5 Changes of specific intestinal length of grass carp in different treatment

圖6 不同處理組草魚比腸重的變化情況Fig.6 Changes of specific intestinal weight of grass carp in different treatments

2.1.4 草魚腸道MPO 活性變化 髓過(guò)氧化物酶（MPO）是中性粒細(xì)胞的標(biāo)志，其含量增高，反映中性粒細(xì)胞在某一組織中增高， 間接反映組織有炎癥。

草魚被灌注TNBS 或PBS 的1，3，7 d 后分別對(duì)其活體解剖，觀察草魚腸道MPO 活性的變化。

如圖7 所示，TNBS 處理1 d 后的草魚MPO活性顯著高于正常組（P＜0.05），其中恩諾沙星組和陰性組極顯著高于正常組（P＜0.01）。 MESH 組MPO 活性相較于陰性組和恩諾沙星組最低，說(shuō)明通過(guò)前期對(duì)草魚進(jìn)行為期7 d 的藥餌預(yù)防， 可以提高腸道抗病能力，抑制中性粒細(xì)胞含量增高，對(duì)草魚腸道炎癥有一定的預(yù)防效果。 灌注TNBS 3 d后，草魚MPO 活性降低，然而陰性組MPO 活性還極顯著高于正常組（P＜0.01），MESH 組和恩諾沙星組MPO 活性雖高于正常組，但與陰性組相比顯著低于陰性組（P＜0.05）。 灌注TNBS 7 d 后，草魚MPO 活性持續(xù)下降，MESH 組和恩諾沙星組MPO活性降低明顯，與陰性組比有極顯著的差異（P＜0.01），說(shuō)明通過(guò)后期的治療，活性肽MESH 和恩諾沙星對(duì)草魚腸道炎癥有明顯的治療效果。 綜上所述， 活性肽MESH 通過(guò)控制中性粒細(xì)胞含量增加，從而對(duì)草魚的腸道炎癥起到防治作用。

圖7 不同處理組草魚腸道MPO 活性的變化Fig.7 Changes of MPO activity in intestinal tract of grass carp in different treatments

2.1.5 草魚腸道組織結(jié)構(gòu)變化 腸道病理組織切片具有一定組織學(xué)特征， 對(duì)腸道疾病的診斷具有重要意義。通過(guò)觀察腸黏膜的損傷程度、炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)程度以及隱窩結(jié)構(gòu)的改變， 可判斷出腸道炎癥的病變程度。 草魚被灌注TNBS 或PBS 的1，3，7 d 后分別對(duì)其活體解剖，觀察草魚腸道組織結(jié)構(gòu)的變化，見(jiàn)圖8。

如圖8 所示， 橫向?yàn)橥M實(shí)驗(yàn)魚不同時(shí)期腸道組織的變化情況， 縱向?yàn)椴煌囼?yàn)組同一時(shí)期腸道組織的變化情況。

圖8 草魚腸道病理組織結(jié)構(gòu)變化情況Fig.8 Intestinal structure change of pathological tissue of grass carp

正常組，如圖8a 所示，PBS 處理1 d 后僅出現(xiàn)輕度炎癥，上皮細(xì)胞排列規(guī)則，腸道遠(yuǎn)端僅有部分腸絨毛損傷， 杯狀細(xì)胞分布在上皮細(xì)胞間。 陰性組，如圖8d 所示，TNBS 處理1 d 后，炎性水腫引起小腸絨毛上的柱狀上皮細(xì)胞壞死、脫落，大部分腸絨毛消失。 上皮細(xì)胞粘連在一起，黏膜層、黏膜下層結(jié)締組織間以及環(huán)縱肌的肌層間腔， 有大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。炎性水腫引起腸壁顯著增厚，有明顯的急性炎癥的狀況，且嚴(yán)重程度較為明顯。相比較而言，MESH 組，如圖8j 所示，腸道絨毛只有部分損傷，腸壁增厚不顯著，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)較少，與陰性組相比有顯著性差異， 并且比恩諾沙星組腸道組織病理變化輕微， 說(shuō)明活性肽MESH 通過(guò)前期的預(yù)防對(duì)草魚腸道結(jié)構(gòu)有保護(hù)的作用， 從而抑制TNBS 毒性物質(zhì)進(jìn)入腸道內(nèi)與組織蛋白結(jié)合形成抗原引起腸道炎癥。 正常組灌注PBS 3 d 后，腸絨毛和腸上皮細(xì)胞排列整齊、緊湊，腸道組織已經(jīng)恢復(fù)正常。陰性組，如圖8e 所示，與第1 天組織狀況相比，其炎性細(xì)胞依然大量存在，腸道絨毛部分恢復(fù)，然而，其柱狀上皮細(xì)胞還是有崩解、脫落現(xiàn)象， 固有層及黏膜下層結(jié)締組織發(fā)生腫脹、壞死、解體現(xiàn)象。 相比恩諾沙星組和MESH 組，如圖8h 和圖8k 所示，草魚腸道病理變化均有改善，腸絨毛基本恢復(fù)，腸道黏膜下層、肌層及結(jié)締組織間炎性細(xì)胞明顯減少。 陰性組灌注TNBS 7 d 后，草魚由急性炎癥轉(zhuǎn)為慢性炎癥，如圖8f 所示，損傷部位募集炎性細(xì)胞，形成新的腸絨毛，杯狀細(xì)胞大量存在，腸道炎癥有所減緩。 MESH 組，如圖8l 所示，腸道組織變化基本恢復(fù)正常。 恩諾沙星組，如圖8i 所示，仍有部分腸絨毛正在恢復(fù)，還沒(méi)有完全恢復(fù)正常。

綜上所述， 活性肽MESH 對(duì)草魚腸道炎癥有防治的效果，且其效果比恩諾沙星更加顯著。

2.2 活性肽對(duì)鰻魚腸道炎癥的影響

采用和草魚同樣的測(cè)試方法， 獲得系列數(shù)據(jù)結(jié)果與草魚的結(jié)果一致， 列舉兩項(xiàng)最直接數(shù)據(jù)如下。

2.2.1 鰻魚消化道指數(shù) 如圖9 和圖10 所示。

3 結(jié)論

裂殖壺菌藻粕酶解產(chǎn)物MESH 應(yīng)用在含有維生素AD 的飼料中， 對(duì)草魚和鰻魚腸道炎癥有顯著的防治效果。 其能明顯改善草魚和鰻魚魚體表形態(tài)及腸道損傷程度， 降低疾病活動(dòng)指數(shù)評(píng)分情況，表現(xiàn)出顯著的抗腸道炎癥作用。 經(jīng)TNBS 誘導(dǎo)后，魚髓過(guò)氧化物酶（MPO）的活性隨著炎癥程度的加深而升高，MESH 組通過(guò)抑制中性粒細(xì)胞含量增加，降低MPO 的活性。 不同試驗(yàn)組草魚和鰻魚腸道組織病理變化存在明顯差異，MESH 組實(shí)驗(yàn)魚灌注TNBS 1 d 后，其腸道發(fā)生炎癥現(xiàn)象與其它試驗(yàn)對(duì)照組相比，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯較少，腸絨毛只有少部分脫落，結(jié)締組織腫脹程度不高。灌注TNBS 3 d 后，其恢復(fù)速度明顯高于陰性組和陽(yáng)性對(duì)照組，腸道炎性細(xì)胞逐漸減少，腸絨毛開(kāi)始迅速恢復(fù)。 灌注TNBS 7 d 后，腸道病理組織切片與正常組相比較基本一致， 說(shuō)明MESH 通過(guò)維持草魚和鰻魚腸黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu)的完整性， 促進(jìn)腸道細(xì)胞及組織的恢復(fù)能力，從而達(dá)到防治的效果。

圖9 鰻魚消化道指數(shù)比腸長(zhǎng)的變化Fig.9 Changes of specific intestinal length of eel in different treatment

圖10 鰻魚消化道指數(shù)比腸重的變化Fig.10 Changes of specific intestinal weight of eel in different treatment

微藻裂殖壺菌藻粕酶解活性肽MESH 及復(fù)合飼料中的維生素AD 可有效抑制水產(chǎn)魚類腸炎，替代現(xiàn)有抗生素應(yīng)用于治療魚類腸炎。