綠豆寡肽對脂多糖誘導(dǎo)巨噬細胞RAW264.7的抗炎作用

于 笛 周 偉 郭增旺 刁靜靜，2 遲治平 張麗萍，2*

（1 黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 黑龍江大慶 163319 2 國家雜糧工程技術(shù)研究中心 黑龍江大慶163319）

炎癥是機體針對各種致炎因子如感染和組織損傷而產(chǎn)生的一系列以防御為主的生理性或病理性應(yīng)答反應(yīng)，是機體天然免疫的重要組成部分。過度的炎癥會對機體造成損害或疾病， 嚴(yán)重時還會危及生命[1-2]。 巨噬細胞是機體固有免疫的重要組成細胞，不僅參與機體的大多數(shù)免疫反應(yīng)，而且在炎癥反應(yīng)過程中具有重要作用[3]。 炎癥狀態(tài)下，巨噬細胞通過分泌細胞因子及抗原提呈等作用影響并調(diào)控炎癥反應(yīng)，其自身的吞噬能力也增強，能夠殺滅和消化機體內(nèi)抗原性異物[4-5]。 脂多糖（lipopolyssacharide，LPS）是全身炎癥反應(yīng)綜合征的一種重要致病因子， 可與巨噬細胞表面抗原識別受體相結(jié)合而刺激細胞， 繼而激活多條炎癥通路，產(chǎn)生一系列促炎因子，引起機體嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)[6-7]。

有研究顯示，大豆、豌豆、羽扇豆等的蛋白水解產(chǎn)物具有調(diào)節(jié)炎癥的潛力。 Vernaza 等[8]發(fā)現(xiàn)利用大豆制備的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物能夠顯著減弱LPS誘導(dǎo)的巨噬細胞RAW264.7 中炎性標(biāo)志物如NO、iNOS、PGE2 的產(chǎn)生。 Millan-Linares 等[9]發(fā)現(xiàn)羽扇豆的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物可以減弱THP-1 巨噬細胞中促炎性細胞因子IL-1β，IL-6，TNF-α 和NO 的產(chǎn)生。 Ndiaye 等[10]發(fā)現(xiàn)來源于黃豌豆種子的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物通過抑制活化的巨噬細胞中NO、TNF-α 和IL-6 的產(chǎn)生來發(fā)揮其抗炎作用。綠豆蛋白的水解產(chǎn)物綠豆肽 （mung bean peptides，MBPs）含有多種活性物質(zhì)。 綠豆肽不僅能提高缺氧耐受力和人體的免疫力，還具有抗氧化性、ACE抑制活性、抗腫瘤、降血壓、降膽固醇、改善腎功能等作用[11-15]。 然而，國內(nèi)關(guān)于綠豆肽抗炎作用的研究鮮有報道。 本課題組有關(guān)綠豆肽的免疫調(diào)節(jié)作用已得到證實[16]。 本文通過LPS 誘導(dǎo)巨噬細胞RAW264.7 產(chǎn)生炎癥反應(yīng)， 觀察綠豆肽對所產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)是否有抑制作用， 為研究綠豆肽的抗炎作用及其機制提供基礎(chǔ)理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

綠豆寡肽（水解度30%），實驗室自制；巨噬細胞RAW264.7，中國科學(xué)院上海細胞庫。

綠豆蛋白粉，山東招遠市溫記食品有限公司；堿性蛋白酶，丹麥諾維信公司；胎牛血清，杭州四季青生物工程材料有限公司；DMEM 培養(yǎng)基，Hyclone；青霉素-鏈霉素溶液，碧云天生物技術(shù)有限公司；PBS，索萊寶生物科技有限公司；胰酶，碧云天生物技術(shù)有限公司；LPS，Sigma 公司；LDH 試劑盒、MPO 試劑盒、GSH 試劑盒，南京建成生物工程研究所；BCA 蛋白濃度測定試劑盒，Wanleibo 公司；細胞因子試劑盒，聯(lián)科生物有限公司；WST-1試劑盒， 碧云天生物技術(shù)有限公司； 中性紅試劑盒，碧云天生物技術(shù)有限公司；其它試劑為分析純級，國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 主要儀器、設(shè)備

倒置顯微鏡（AE31），麥克奧迪；酶標(biāo)儀（ELX-800），美國BIOTEK；CO2恒溫培養(yǎng)箱（HF-90），上海力申；SW-CJ-IF 型超凈工作臺，北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司； 低溫高速冷凍離心機 （H-2050R），德國SORVALL。

1.3 試驗方法

1.3.1 綠豆寡肽的制備方法 根據(jù)實驗室前期的研究成果，參照王凱凱等[17]的方法制備綠豆蛋白水解液。 將制備的綠豆蛋白水解液用孔徑為22 mm 的透析袋脫鹽24 h。將脫鹽處理的水解液用超濾分離裝置進行超濾。超濾條件為壓力0.25 MPa，常溫，分子質(zhì)量1 000 u 有機超濾膜。 收集分子質(zhì)量低于1 000 u 組分，真空冷凍干燥，備用。將收集的樣品用氨基酸自動分析儀參照GB/T5009.124-2003 測定氨基酸組成，Waters2695 高效液相色譜儀測定相對分子質(zhì)量分布。

1.3.2 細胞培養(yǎng)及試驗分組 巨噬細胞RAW264.7 培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基（含100 IU/mL 青霉素和100 IU/mL 鏈霉素），在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞長至對數(shù)生長期時， 用0.25%胰酶（含0.01% EDTA）消化，DMEM 培養(yǎng)基洗滌、離心，PBS 重新洗滌、離心后接種到培養(yǎng)皿中， 按試驗分組進行培養(yǎng)。 對照組：加入等量的PBS 溶液；LPS 組：加入終質(zhì)量濃度為2 μg/mL 的LPS；LPS+MBPs 處理組： 加入終質(zhì)量濃度為2 μg/mL LPS 預(yù)孵育4 h，再分別加入終質(zhì)量濃度為25，50，100 μg/mL 的MBPs。細胞培養(yǎng)12 h 后， 分別收集培養(yǎng)基和細胞做進一步分析。

1.3.3 細胞增殖檢測 將對數(shù)生長期巨噬細胞RAW264.7 按照1×104/孔密度接種于96 孔板，按照試驗分組培養(yǎng)12 h 后， 采用WST-1 法檢測細胞增殖。 將各組細胞加入20 μL WST-1 溶液，置于細胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育2 h 后，將96 孔板置于搖床上搖動1 min，以充分混勻待檢測體系。 以酶標(biāo)儀波長630 nm 作為參考波長， 在波長450 nm處測定吸光值。

1.3.4 細胞吞噬能力檢測 將對數(shù)生長期巨噬細胞RAW264.7 按照1×104/孔密度接種于96 孔板，按照試驗分組培養(yǎng)12 h 后，采用中性紅檢測細胞吞噬活性，PBS 溶液洗滌細胞1 次， 加入200 μL細胞培養(yǎng)液、20 μL 中性紅染色液，在細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育2 h，去除含有中性紅染色液的細胞培養(yǎng)液，用PBS 溶液洗滌1 次，加入200 μL 中性紅檢測裂解液，室溫?fù)u床上裂解10 min，在波長690 nm 處測量吸光值。

1.3.5 髓過氧化物酶（MPO）活性檢測 將對數(shù)生長期巨噬細胞RAW264.7 按照3×105/孔密度接種于6 孔板，按照試驗分組培養(yǎng)12 h 后，采用比色法測定細胞內(nèi)髓過氧化物酶活性。 試驗步驟按照試劑盒操作說明書進行。

1.3.6 乳酸脫氫酶（LDH）活性檢測 將對數(shù)生長期巨噬細胞RAW264.7 按照3×105/孔密度接種于6 孔板，按照試驗分組培養(yǎng)12 h 后，采用比色法測定細胞培養(yǎng)上清液中乳酸脫氫酶活性。 試驗步驟按照試劑盒操作說明書進行。

1.3.7 還原型谷胱甘肽（GSH）含量檢測 將對數(shù)生長期巨噬細胞RAW264.7 按照3×105/孔密度接種于6 孔板，按照試驗分組培養(yǎng)12 h 后，采用比色法檢測細胞內(nèi)還原型谷胱甘肽含量， 試驗步驟按照試劑盒操作說明書進行。

1.3.8 炎癥因子含量檢測 將對數(shù)生長期巨噬細胞RAW264.7 以3×105/孔密度接種于6 孔板，按照試驗分組培養(yǎng)12 h 后，采用酶聯(lián)免疫吸附測定試驗（ELISA）測定細胞培養(yǎng)液中細胞因子IL-1α、IL-6、TNF-α 的含量，按照試劑盒說明書中方法和步驟測定。

1.3.9 數(shù)據(jù)處理方法 采用SPSS 19.0 進行方差分析和Duncan 式進行多重比較， 試驗重復(fù)5 次，取平均值，結(jié)果以±s 表示。

2 試驗結(jié)果

2.1 MBPs 對LPS 誘導(dǎo)巨噬細胞RAW264.7 細胞增殖的影響

適度的巨噬細胞增殖可提高機體抵御外界和修復(fù)機體損傷的能力， 而過度刺激會引起細胞的免疫反應(yīng)，導(dǎo)致細胞凋亡和機體損傷[18]。 由表1 可知， 與對照組相比，LPS 顯著抑制巨噬細胞增殖；與LPS 組相比，MBPs 低、中、高劑量組均顯著緩解LPS 對巨噬細胞增殖的抑制作用（P＜0.05）， 并隨MBPs 濃度的升高，緩解作用逐漸增強，呈現(xiàn)量效關(guān)系。 結(jié)果表明，MBPs 具有緩解LPS 抑制巨噬細胞增殖的能力。

2.2 MBPs 對LPS 誘導(dǎo)巨噬細胞RAW264.7 細胞吞噬能力的影響

吞噬能力指巨噬細胞通過吞噬侵入的病原體及體內(nèi)衰老、 畸變的細胞而提高機體的抗感染能力，是衡量巨噬細胞活性的一個重要指標(biāo)[19]。 巨噬細胞通過吞噬清除異物、 病原體以及外來細胞發(fā)揮免疫效應(yīng)。 由圖1 可知，與對照組相比，當(dāng)巨噬細胞受到LPS 刺激時， 其吞噬能力顯著增強；與LPS 組相比，MBPs 低劑量組差異無統(tǒng)計學(xué)意義，而低、中、高劑量的綠豆寡肽均能下調(diào)LPS 所引起的巨噬細胞吞噬能力增高， 并呈現(xiàn)量效關(guān)系。MBPs 對LPS 激活的巨噬細胞的吞噬能力具有顯著抑制作用。

2.3 MBPs 對LPS 誘導(dǎo)巨噬細胞RAW264.7 髓過氧化物酶（MPO）活性的影響

髓過氧化物酶（MPO）是一種存在于髓系細胞嗜苯胺藍顆粒中重要的含鐵溶酶體酶， 由中性粒細胞、單核細胞和某些組織的巨噬細胞分泌，是免疫細胞的功能標(biāo)志和激活標(biāo)志[20]。 由圖2 可知，與對照組相比，LPS 顯著增強巨噬細胞MPO 活性（P＜0.05）； 與LPS 組相比，MBPs 顯著降低巨噬細胞MPO 活性（P＜0.05），并且隨MBPs 濃度的升高，效果明顯，呈現(xiàn)量效關(guān)系。 MBPs 對LPS 誘導(dǎo)的巨噬細胞內(nèi)MPO 活性的升高具有顯著抑制作用。

2.4 MBPs 對LPS 誘導(dǎo)巨噬細胞RAW264.7 乳酸脫氫酶（LDH）活性的影響

乳酸脫氫酶 （LDH）是葡萄糖酵解所必需的酶， 具有將葡萄糖催化脫氫為丙酮酸和丙酮酸還原為乳酸的能力， 參與細胞內(nèi)能源物質(zhì)的無氧酵解和有氧氧化。 LDH 活性與巨噬細胞激活程度相關(guān)，是巨噬細胞激活的標(biāo)志之一[21]。 由圖3 可知，與對照組相比，LPS 促使巨噬細胞LDH 活性顯著升高（P＜0.05）；與LPS 組相比，MBPs 顯著降低巨噬細胞LDH 活性（P＜0.05），并且隨MBPs 濃度的升高，降低效果逐漸增強，呈現(xiàn)量效關(guān)系。MBPs 對LPS 誘導(dǎo)的巨噬細胞內(nèi)LDH 活性的升高具有顯著抑制作用。

表1 MBPs 對LPS 誘導(dǎo)巨噬細胞RAW264.7增殖的影響Table 1 Effect of MBPs on LPS-induced proliferation of macrophage RAW264.7

圖1 MBPs 對LPS 誘導(dǎo)巨噬細胞RAW264.7吞噬能力的影響Fig.1 Effect of MBPs on LPS-induced phagocytosis of macrophage RAW264.7

2.5 MBPs 對LPS 誘導(dǎo)巨噬細胞RAW264.7 還原型谷胱甘肽（GSH）含量的影響

圖2 MBPs 對LPS 誘導(dǎo)巨噬細胞RAW264.7 MPO 活性的影響Fig.2 Effect of MBPs on MPO activity produced by LPS-induced macrophage RAW264.7

谷胱甘肽（GSH）是一種含γ-酰胺鍵和巰基的三肽，由谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸組成，屬于一種全身細胞保護性因子，具有抗凋亡、抗炎、促進組織修復(fù)、減輕細胞損傷、清除自由基、解毒、促進細胞生長發(fā)育及細胞免疫等多種重要生理功能[22]。由圖4 可知，與對照組相比，LPS 能顯著降低巨噬細胞內(nèi)GSH 含量；與LPS 組相比，MBPs 可以顯著緩解LPS 所導(dǎo)致的巨噬細胞胞內(nèi)GSH 水平下降（P＜0.05），呈現(xiàn)量效關(guān)系，且MBPs 中、高劑量組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。MBPs 對LPS 誘導(dǎo)的巨噬細胞內(nèi)GSH 含量的下調(diào)具有明顯的改善作用。

2.6 MBPs 對LPS 誘導(dǎo)巨噬細胞RAW264.7 分泌細胞因子水平的影響

圖3 MBPs 對LPS 誘導(dǎo)巨噬細胞RAW264.7 LDH 活性的影響Fig.3 Effect of MBPs on LDH activity produced by LPS-induced macrophage RAW264.7

2.6.1 MBPs 對LPS 誘導(dǎo)巨噬細胞RAW264.7 腫瘤壞死因子（TNF-α）含量的影響 TNF-α 是炎癥初期最早出現(xiàn)的炎癥因子，主要由巨噬細胞分泌，能促進炎癥的發(fā)生與發(fā)展。由圖5 可知，與對照組相比，LPS 顯著增加TNF-α 的分泌水平（P＜0.05）；與LPS 組相比，MBPs 組顯著抑制TNF-α 的分泌水平（P＜0.05），并隨MBPs 濃度的升高，抑制作用逐漸增強， 呈現(xiàn)量效關(guān)系。 MBPs 可以顯著抑制LPS 誘導(dǎo)巨噬細胞分泌TNF-α。

2.6.2 對LPS 誘導(dǎo)巨噬細胞RAW264.7 分泌IL-1α 水平的影響 IL-1α 又稱淋巴細胞活化因子，可作用于機體的各個系統(tǒng)， 具有廣泛的生物學(xué)作用，在介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，參與免疫調(diào)節(jié)和影響組織代謝方面發(fā)揮著積極的作用。由圖6 可知，與對照組相比，LPS 顯著增加IL-1α 的分泌水平（P＜0.05）；與LPS 組相比，MBPs 組顯著抑制IL-1α 的分泌水平（P＜0.05），并隨MBPs 濃度的升高，抑制作用逐漸增強，呈現(xiàn)量效關(guān)系。 MBPs 可以顯著下調(diào)LPS所誘導(dǎo)巨噬細胞分泌的IL-1α 水平。

圖4 MBPs 對LPS 誘導(dǎo)巨噬細胞RAW264.7 GSH 含量的影響Fig.4 Effect of MBPs on GSH content produced by LPS-induced macrophage RAW264.7

圖5 MBPs 對LPS 誘導(dǎo)巨噬細胞RAW264.7分泌TNF-α 水平影響Fig.5 Effect of MBPs on TNF-α level produced by LPS-induced macrophage RAW264.7

2.6.3 對LPS 誘導(dǎo)巨噬細胞RAW264.7 細胞IL-6 含量的影響 IL-6 又被稱為B 細胞刺激因子，具有增強免疫、促進造血、誘導(dǎo)B 細胞和T 細胞增殖分化等作用。 由圖7 可知， 與對照組相比，LPS能顯著增強巨噬細胞分泌IL-6（P＜0.05）；與LPS組相比，MBPs 可以顯著抑制LPS 刺激引起的巨噬細胞IL-6 水平升高，且MBPs 濃度越高，抑制越顯著，呈現(xiàn)量效關(guān)系。 MBPs 可以緩解LPS 對巨噬細胞分泌IL-6 的抑制作用，減輕炎癥程度，具有一定的抗炎效果。

圖6 MBPs 對LPS 誘導(dǎo)巨噬細胞RAW264.7分泌IL-1α 水平的影響Fig.6 Effect of MBPs on IL-1α level produced by LPS-induced macrophage RAW264.7

圖7 MBPs 對LPS 誘導(dǎo)巨噬細胞RAW264.7分泌IL-6 水平的影響Fig.7 Effect of MBPs on IL-6 level produced by LPS-induced macrophage RAW264.7

3 討論

巨噬細胞在炎癥反應(yīng)中具有關(guān)鍵作用， 通過促進機體免疫系統(tǒng)釋放炎癥介質(zhì)參與炎癥反應(yīng)[23]。 LPS 作為一種細胞毒素，對巨噬細胞具有一定的激活作用， 刺激巨噬細胞產(chǎn)生NO 和釋放細胞免疫因子等生物活性物質(zhì)， 適量的免疫因子具有提高機體抵抗外界刺激和修復(fù)機體損傷的作用， 而過量持續(xù)的刺激產(chǎn)生的免疫活性物質(zhì)則會引起細胞的炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致細胞的損傷和凋亡[24]。結(jié)果表明，2 μg/mL LPS 可顯著抑制巨噬細胞增殖，同時能增強其吞噬能力，這與劉想等[25]、徐智敏[26]、李芬芬[27]的研究結(jié)果一致；而綠豆寡肽顯著增強巨噬細胞增殖， 并降低其吞噬能力， 緩解了LPS 對巨噬細胞的過度刺激，這表明MBPs 通過改善巨噬細胞趨化捕捉及其吞噬能力發(fā)揮抗炎作用。

MPO 和LDH 是巨噬細胞發(fā)揮生物學(xué)作用的兩種重要酶。 MPO 在外界刺激下隨著炎性細胞聚集而釋放，主要功能是在吞噬細胞內(nèi)殺滅微生物，利用過氧化氫和氯離子產(chǎn)生次氯酸鹽， 并形成具有氧化能力的自由基，構(gòu)成MPO-H2O2-鹵素系統(tǒng)，進而在機體天然免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用[28-29]。當(dāng)細胞受到外界刺激時， 細胞膜的通透性改變，LDH 從巨噬細胞胞內(nèi)釋放至胞外并激活其它免疫細胞，起到相應(yīng)的生物學(xué)作用[20]。 過量的LPS 可顯著提高巨噬細胞內(nèi)的LDH 和MPO 活性，MBPs 可以顯著降低LPS 對巨噬細胞內(nèi)LDH 和MPO 的活性升高作用， 緩解LPS 對巨噬細胞的胞內(nèi)消化酶的過度刺激， 這表明MBPs 可以通過改善巨噬細胞酶解消化能力發(fā)揮抗炎作用。

還原型谷胱甘肽（GSH）是谷胱甘肽的主要活性成分。 研究表明，GSH 具有促進組織修復(fù)、減輕細胞損傷、抗炎、清除自由基、促進細胞生長發(fā)育及細胞免疫等多種重要生理功能[30]。 過量的LPS可顯著降低巨噬細胞內(nèi)GSH 水平，MBPs 可以顯著緩解LPS 導(dǎo)致的巨噬細胞胞內(nèi)GSH 水平的下降，這表明綠豆肽通過上調(diào)巨噬細胞內(nèi)GSH 的水平發(fā)揮抗炎作用。

細胞因子是由免疫細胞和非免疫細胞在受到刺激后所產(chǎn)生的小分子生物活性物質(zhì)， 通過刺激或抑制多種細胞的活性、增殖和分化，調(diào)節(jié)其它細胞因子或抗體的分泌， 誘導(dǎo)靶細胞程序性死亡等途徑實現(xiàn)調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答及參與炎癥反應(yīng)[31-32]。巨噬細胞經(jīng)LPS 誘導(dǎo)刺激， 分泌TNF-α、IL-1α、IL-6等炎性細胞因子。 TNF-α 是炎癥反應(yīng)過程中最重要的炎癥介質(zhì)。 IL-1α 是IL-1 在機體中存在形式之一， 在參與機體各種急慢性炎癥的過程中，IL-1α 刺激細胞的表面呈炎性表型，大量的基因（細胞因子、細胞因子受體、生長因子等）開始表達，大部分基因表達的蛋白質(zhì)直接參與炎癥與免疫反應(yīng)[33]。IL-6 由淋巴細胞和某些非淋巴細胞（如成纖維細胞、內(nèi)皮細胞等）產(chǎn)生，是一種參與機體應(yīng)激反應(yīng)和免疫調(diào)節(jié)的重要細胞因子。 IL-6 具有多種生物學(xué)活性，除了具有免疫增強和促進造血外，還可參與炎癥反應(yīng)， 主要體現(xiàn)在誘導(dǎo)B 細胞和T 細胞的增殖分化，誘導(dǎo)肝細胞產(chǎn)生急性期蛋白，刺激巨噬細胞增殖分化。 IL-6 水平可以作為反映機體炎癥與組織損傷嚴(yán)重程度的重要指標(biāo)[34-35]。過度的LPS 刺激可使巨噬細胞內(nèi)的促炎性細胞因子顯著升高，這和舒曠怡[36]、張海[37]、喻鵬久[38]的研究結(jié)果一致。MBPs 可顯著緩解LPS 所誘導(dǎo)巨噬細胞的促炎性細胞因子IL-1α 和IL-6 過度分泌，表明其通過調(diào)節(jié)巨噬細胞促炎性細胞因子的水平發(fā)揮抗炎作用。

綜上所述，綠豆寡肽具有抗炎的效果，通過調(diào)控巨噬細胞增殖、吞噬、胞內(nèi)酶解消化及抑制促炎性細胞因子分泌發(fā)揮其抗炎作用。 這與利用色譜分析法結(jié)合超濾手段從大豆、牛乳、禽蛋中制備小分子抗炎肽（3～10 ku），研究其抗炎活性結(jié)果一致[39-41]。 目前研究發(fā)現(xiàn)，食源性生物活性肽的抗炎作用、免疫調(diào)節(jié)能力與其氨基酸的組成、序列、長度、電荷、疏水性及肽分子的結(jié)構(gòu)密切相關(guān)[42-43]。大量研究已證實谷氨酰胺、谷氨酸、酪氨酸、色氨酸以及疏水性氨基酸能促進食源性生物活性肽的免疫調(diào)節(jié)活性。 本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)綠豆寡肽的氨基酸組成中富含疏水性氨基酸，如甘氨酸（Gly）、纈氨酸（Val）、亮氨酸（Leu）、脯氨酸（Pro）、苯丙氨酸（Phe），且總量高達28.37%，推測綠豆寡肽具有抗炎活性與其特殊的氨基酸組成及低分子質(zhì)量有關(guān)，然而，關(guān)于綠豆寡肽如何發(fā)揮其抗炎的作用機制及其構(gòu)效關(guān)系尚不清楚，有待于進一步的研究。