不同年齡人群來(lái)源長(zhǎng)雙歧桿菌體外生物學(xué)特性研究

閆 爽 楊 波 趙建新 張 灝 陳 衛(wèi)

（江南大學(xué)食品學(xué)院 江蘇無(wú)錫214122）

雙歧桿菌（Bifidobacteria）是人體腸道菌群中一類(lèi)重要的優(yōu)勢(shì)微生物， 與其宿主之間存在復(fù)雜的相互作用關(guān)系[1]。某些特定的雙歧桿菌菌株被證明具有拮抗腸侵襲性致病菌，抑制結(jié)直腸癌，抑制炎癥性腸病以及緩解便秘等功能[2-5]。

盡管有大量關(guān)于人體腸道微生物組成的研究， 然而關(guān)于腸道共生菌和宿主相互作用的分子機(jī)制還不十分明確[6]。 有研究提出，共生菌的細(xì)胞被膜成分，包括蛋白質(zhì)和碳水化合物，是微生物與其宿主之間發(fā)生相互作用的重要物質(zhì)基礎(chǔ)[7-9]。 胞外多糖是由一些特定菌株產(chǎn)生的一類(lèi)碳水化合物聚合物，可附著于菌體表面形成一層被膜（莢膜多糖）或者釋放到周?chē)h(huán)境中[10]。 雙歧桿菌的莢膜多糖可通過(guò)改變菌體表面的物理性質(zhì)維持菌體與宿主的共生關(guān)系。此外，某些雙歧桿菌產(chǎn)生的胞外多糖（Exopolysaccharides，EPS）可提高菌體對(duì)胃腸道環(huán)境的耐受性， 保護(hù)菌體免受宿主免疫系統(tǒng)的影響，同時(shí)可對(duì)宿主產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)等多種作用[11-12]。雙歧桿菌所產(chǎn)的EPS 可能是其發(fā)揮益生功能的物質(zhì)基礎(chǔ)之一[13]。

短鏈脂肪酸（Short-chain fatty acid，SCFA）是人體腸道菌群的重要代謝產(chǎn)物， 具有為腸上皮細(xì)胞提供能量，促進(jìn)腸上皮細(xì)胞增殖和礦物質(zhì)吸收，緩解腹瀉與便秘，抑制致病菌等多重生理活性[14]。近年來(lái)大量研究表明， 短鏈脂肪酸具有免疫調(diào)節(jié)功能，對(duì)維持免疫穩(wěn)態(tài)起關(guān)鍵作用[9]。 雙歧桿菌所產(chǎn)的短鏈脂肪酸主要為乙酸， 它可保護(hù)宿主免受腸道致病菌感染， 同時(shí)可被腸道中產(chǎn)丁酸菌利用產(chǎn)生丁酸，發(fā)揮抗炎等生理活性[2，15]。

本研究從嬰幼兒、 成年人和老年人的糞便中篩選長(zhǎng)雙歧桿菌（B. longum），分析不同菌株的體外特性，包括生長(zhǎng)特性、糖發(fā)酵特性、產(chǎn)短鏈脂肪酸和胞外多糖的能力， 并比較菌株胞外多糖合成關(guān)鍵基因——引導(dǎo)型糖基轉(zhuǎn)移酶（Priming glycosyltransferase，pGT）基因的序列及其進(jìn)化關(guān)系，為雙歧桿菌特定菌株的篩選以及胞外多糖相關(guān)研究提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

共采集38 份不同年齡段健康志愿者的糞便樣品。 其中男性20 名，女性18 名；小于3 歲的嬰幼兒14 名，30～50 歲的中年人11 名， 大于60 歲的老年人13 名。將采集的糞便樣品置于50 mL 無(wú)菌離心管中，添加30 mL 滅菌的30%甘油溶液（含0.05%半胱氨酸鹽酸鹽）混勻，在4 ℃下暫時(shí)保存，并于48 h 內(nèi)運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室，-80 ℃條件下保藏。

1.2 主要試劑和設(shè)備

MRS 培養(yǎng)基，青島海博生物技術(shù)有限公司；半胱氨酸鹽酸鹽、硫酸、苯酚，國(guó)藥集團(tuán)；莫匹羅星、細(xì)菌基因組DNA 快速抽提試劑盒，上海生工生物工程有限公司；2×Taq MasterMix，北京康為世紀(jì)生物科技有限公司； 細(xì)菌16S rRNA 基因通用引物27F （5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′）和1492R （5′-ACG GCT ACC TTG TTA CGA CTT-3′），上海桑尼生物科技有限公司；阿拉伯樹(shù)膠、阿拉伯糖、纖維二糖、D-葡萄糖胺、D-葡萄糖醛酸酯、D-甘露糖、 松三糖、D-木糖， 美國(guó)sigma公司；低聚果糖、低聚半乳糖、低聚異麥芽糖，上海源葉生物科技有限公司。本試驗(yàn)所用MRS 培養(yǎng)基在配制時(shí)均添加0.05%的半胱氨酸鹽酸鹽。

超低溫冰箱， 美國(guó)Thermo scientific 公司；超凈工作臺(tái)， 江蘇蘇凈集團(tuán)有限公司；Whitley DG250 厭氧工作站， 英國(guó)Don Whitley Scientific公司；PCR 熱循環(huán)儀， 美國(guó)Biorad 公司；JY92-IIDN 超聲波細(xì)胞破碎儀， 寧波新芝生物科技股份有限公司，UV1800 紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，日本島津公司。

1.3 雙歧桿菌的分離純化

凍存的糞便樣品在室溫下融化，混勻。將糞便懸液用無(wú)菌生理鹽水以10-1梯度稀釋。 選取適當(dāng)稀釋度的稀釋液涂布MRS 平板（添加0.05%半胱氨酸鹽酸鹽和100 mg/L 莫匹羅星）， 置于37 ℃厭氧工作站中培養(yǎng)72 h。長(zhǎng)出單菌落后，挑取不同形態(tài)的菌落繼續(xù)劃線純化，最終得到純培養(yǎng)物，擴(kuò)增16s rDNA，將擴(kuò)增產(chǎn)物送至華大基因測(cè)序以確定物種，并保藏菌種。

1.4 生長(zhǎng)曲線的繪制

待測(cè)菌株在液體培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)3 代后，以2%的接種量接種至MRS 液體培養(yǎng)基 （添加0.05%半胱氨酸鹽酸鹽）中，于37 ℃厭氧工作站中培養(yǎng)。 培養(yǎng)過(guò)程中每2 h 取樣1 次，測(cè)定發(fā)酵液的pH 值和波長(zhǎng)600 nm 處的OD 值， 直至進(jìn)入穩(wěn)定期。

1.5 對(duì)數(shù)末期菌落數(shù)的測(cè)定

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期的發(fā)酵液， 用無(wú)菌生理鹽水以10-1梯度稀釋?zhuān)?選取適當(dāng)稀釋度的稀釋液涂布MRS 平板，置于37 ℃厭氧工作站中培養(yǎng)72 h。 長(zhǎng)出單菌落后，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。發(fā)酵液中的菌落數(shù)以CFU/mL 表示。

1.6 糖發(fā)酵特性分析

將不同種類(lèi)的糖配制成溶液， 用0.22 μm 的微孔濾膜過(guò)濾除菌，以1 g/L 的質(zhì)量濃度添加到不含糖的MRS 液體培養(yǎng)基中，另添加少量溴甲酚紫溶液， 作為酸堿指示劑。 待測(cè)菌株培養(yǎng)至對(duì)數(shù)末期， 離心收集菌體， 用無(wú)菌生理鹽水吹洗菌體2次，用等體積的生理鹽水重懸菌體，以2%的接種量將菌懸液接種到上述含不同碳源的MRS 培養(yǎng)基中，在37 ℃的厭氧工作站中培養(yǎng)24～48 h，記錄培養(yǎng)基的變色情況。 雙歧桿菌能生長(zhǎng)的培養(yǎng)基變?yōu)辄S色，雙歧桿菌不能生長(zhǎng)的培養(yǎng)基仍未紫色，由此判斷菌株能否利用相應(yīng)的糖。 以含葡萄糖的MRS 培養(yǎng)基和不含糖的MRS 培養(yǎng)基分別作為陽(yáng)性和陰性對(duì)照。

1.7 發(fā)酵上清液中短鏈脂肪酸的測(cè)定

將菌株在MRS 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)末期，6 000×g 離心10 min， 上清液用于測(cè)定短鏈脂肪酸（乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸和異戊酸）的含量。短鏈脂肪酸的提取和GC-MS 測(cè)定參考Mao等[16]的方法。 采用外標(biāo)法計(jì)算各短鏈脂肪酸的質(zhì)量摩爾濃度， 最終結(jié)果以單位生物量產(chǎn)生的短鏈脂肪酸表示（μmol/g 生物量）。

1.8 胞外多糖的測(cè)定

胞外多糖的測(cè)定分為細(xì)胞表面多糖（EPS-b）測(cè)定和游離胞外多糖（EPS-r）測(cè)定。將雙歧桿菌菌株在MRS 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)末期， 取10 mL 發(fā)酵液，6 000×g 離心15 min，收集菌泥和上清液分別用于測(cè)定EPS-b 和EPS-r。 胞外多糖的提取和測(cè)定參考Tallon 等[10]的方法。 測(cè)定結(jié)果以單位生物量產(chǎn)生的EPS 毫克數(shù)表示（mg/g 生物量）

1.9 引導(dǎo)型糖基轉(zhuǎn)移酶 （pGT）基因的PCR 擴(kuò)增、測(cè)序和生物信息學(xué)分析

根據(jù)NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)， 長(zhǎng)雙歧桿菌的pGT 基因分為cpsD 基因和rfbP 基因。 根據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列， 設(shè)計(jì)pGT 基因特異性引物如下：cpsD-F （5'-TTCTCYGTGCGCATGGAATC-3′）和cpsD-R（5'-CCCATAATSGACCAGTTCTGCAC-3′）；rfbP-F（5'-GATTCYGAGACCATGCGTAC-3′）和rfbP-R（5'-GCATARTCCGACTGTTCCTGAG -3′）。 待測(cè)菌株培養(yǎng)至對(duì)數(shù)末期，離心收集菌體，采用細(xì)菌基因組DNA 快速抽提試劑盒提取細(xì)菌總DNA。以細(xì)菌基因組DNA 為模板， 采用pGT 基因特異性引物PCR 擴(kuò)增，將PCR 產(chǎn)物送至華大基因測(cè)序，所得序列用Clustal X2 軟件比對(duì)，用MEGA5.1 軟件的neighbor-joining 方法建立系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。 選取標(biāo)準(zhǔn)菌株長(zhǎng)雙歧桿菌NCC2705 的pGT 序列作為參考序列。

1.10 數(shù)據(jù)分析

所有指標(biāo)均做3 次重復(fù)試驗(yàn)， 所得數(shù)據(jù)用SPSS 20.0 軟件統(tǒng)計(jì)分析，獨(dú)立樣本t-檢驗(yàn)用于分析組間顯著性差異，P＜0.05 被認(rèn)為具有顯著性差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同長(zhǎng)雙歧桿菌菌株的生長(zhǎng)特性

根據(jù)16s rDNA 序列比對(duì)結(jié)果，選取38 株分離自不同糞便樣品的長(zhǎng)雙歧桿菌（表1）做后續(xù)分析。

表1 篩選出的長(zhǎng)雙歧桿菌菌株及其宿主信息Table 1 Isolated strains and the information of their corresponded hosts

由于不同菌株對(duì)代謝底物的利用能力不同，其生長(zhǎng)速率存在差異， 因此首先測(cè)定各菌株在MRS 培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況。 由圖1a 可知，不同菌株在MRS 培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)特性具有顯著差異。 整體來(lái)看，嬰幼兒源菌株的生長(zhǎng)速率相對(duì)較慢，延遲期為6～8 h； 而老年人源的菌株生長(zhǎng)速率相對(duì)較快，延遲期為4～6 h，其中HUB6-1 的延遲期只有2 h，10 h 后進(jìn)入穩(wěn)定期， 而其它多數(shù)菌株在20 h左右進(jìn)入穩(wěn)定期。 另外，進(jìn)入穩(wěn)定期后，各菌株發(fā)酵液的OD 值也有顯著差異，嬰幼兒源菌株的OD值整體低于老年人源菌株的OD 值， 對(duì)各菌株對(duì)數(shù)末期活菌數(shù)的計(jì)數(shù)結(jié)果也顯示， 嬰幼兒源菌株的CFU 值顯著低于老年人源的菌株（圖1b）。 然而， 不同性別人群來(lái)源的菌株之間沒(méi)有類(lèi)似的差異性。 該結(jié)果可能是由于不同年齡宿主來(lái)源的菌株在體外培養(yǎng)條件下對(duì)培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)成分利用能力存在差異所致。

2.2 不同長(zhǎng)雙歧桿菌菌株對(duì)碳源的利用特性

根據(jù)伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)所述， 長(zhǎng)雙歧桿菌又分為長(zhǎng)亞種（B. longum subsp. longum）、嬰兒亞種 （B. longum subsp. infantis）和豬亞種（（B.longum subsp. suis）， 不同亞種間通過(guò)16s rDNA序列很難區(qū)分。 由于不同亞種在糖發(fā)酵特性上存在差異， 因此菌株的發(fā)酵特性可以作為區(qū)分亞種的方法。圖2 列出38 株長(zhǎng)雙歧桿菌對(duì)不同碳水化合物的利用情況。 由圖2 可知，只有FHeNJZ44M8不能利用阿拉伯糖而可以利用D-葡萄糖醛酸酯。根據(jù)伯杰氏手冊(cè)， 作者認(rèn)為該菌株為長(zhǎng)雙歧桿菌嬰兒亞種。有研究提出，長(zhǎng)雙歧桿菌長(zhǎng)亞種可分為2 種亞型（biovar），其中亞型A 可以發(fā)酵甘露糖，而亞型B 不能發(fā)酵甘露糖[17]。 本研究發(fā)現(xiàn)，嬰幼兒來(lái)源的菌株多數(shù)可以利用甘露糖，14 株菌株中只有2 株不能利用甘露糖；而成年人來(lái)源的24 個(gè)菌株中，只有6 株可以利用甘露糖。多數(shù)菌株可以發(fā)酵本試驗(yàn)中的3 種低聚糖， 只有C1-A13、FJSNT70M6、RG2-33 菌株對(duì)低聚糖的利用能力較差。多數(shù)菌株不能利用阿拉伯樹(shù)膠、纖維二糖和D-葡萄糖胺。

圖1 不同長(zhǎng)雙歧桿菌菌株的生長(zhǎng)曲線Fig.1 Growth curve of different strains in MRS broth

2.3 不同長(zhǎng)雙歧桿菌發(fā)酵上清液中SCFA 的組成

各菌株發(fā)酵上清液中短鏈脂肪酸的組成如圖3a 所示。 長(zhǎng)雙歧桿菌發(fā)酵上清液中主要的短鏈脂肪酸為乙酸，另有極少量的丙酸、丁酸和戊酸，后幾種短鏈脂肪酸的含量與新鮮MRS 培養(yǎng)基中的含量基本一致，因此可認(rèn)為雙歧桿菌在MRS 培養(yǎng)基中產(chǎn)生的短鏈脂肪酸只有乙酸， 扣除培養(yǎng)基中本身存在的乙酸， 即得各菌株產(chǎn)乙酸的能力（圖3b）。 雙歧桿菌對(duì)六碳糖的代謝途徑為“雙歧桿菌途徑”（Bifidus pathway）， 代謝產(chǎn)物主要為乙酸和乳酸，二者比例為3∶2[17]。 乙酸是雙歧桿菌的主要代謝產(chǎn)物之一， 它在保護(hù)腸道免受侵襲性治病感染方面起到重要作用[2]。不同菌株之間產(chǎn)乙酸的能力有一定的差異， 其中HUB37-A12、C1-A13、HAN4-25 短鏈脂肪酸的產(chǎn)量明顯高于其它菌株，而不同年齡以及性別人群來(lái)源的菌株間并沒(méi)有呈現(xiàn)規(guī)律性差異。

圖2 各菌株對(duì)不同碳水化合物的利用情況Fig.2 Carbohydrates fermentation test of different strains

圖3 不同菌株發(fā)酵上清液中短鏈脂肪酸（SCFA）的組成Fig.3 Composition of SCFA in culture supernatant of different strains

2.4 不同長(zhǎng)雙歧桿菌菌株的胞外多糖產(chǎn)量

胞外多糖作為腸道微生物與宿主腸道之間相互作用的重要介質(zhì)， 對(duì)于宿主具有一定的免疫調(diào)節(jié)作用。 本研究測(cè)定了不同菌株的菌體表面多糖（EPS-b）和游離胞外多糖（EPS-r）的產(chǎn)量。 由表2可知， 不同菌株之間胞外多糖的產(chǎn)量具有明顯差異。 其中CCFM760、HUB37-A12、HAN4-25 幾乎不產(chǎn)胞外多糖， 而HUB2-1 和HUB6-1 被檢測(cè)到表面胞外多糖（EPS-b）。 另外，將菌株按照宿主年齡分組后發(fā)現(xiàn)， 嬰幼兒來(lái)源菌株的細(xì)胞表面多糖（EPS-b）產(chǎn)量低于中年人和老年人來(lái)源菌株，3 組的平均值分別為9.93，21.13，22.58 mg/g，其中嬰幼兒源和老年人源菌株的細(xì)胞表面多糖（EPS-b）產(chǎn)量存在統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性（P＜0.05）（圖4）。這些特性的差異可能與不同來(lái)源的菌株適應(yīng)其宿主腸道環(huán)境有關(guān)[18-19]。而不同性別人群來(lái)源的菌株之間沒(méi)有規(guī)律性差異。

圖4 不同年齡段宿主來(lái)源菌株的胞外多糖產(chǎn)量Fig.4 EPS production of strains from hosts with different ages

表2 不同長(zhǎng)雙歧桿菌菌株胞外多糖的產(chǎn)量Table 2 EPS productions of different strains

2.5 不同長(zhǎng)雙歧桿菌菌株pGT 基因測(cè)序及進(jìn)化分析

引導(dǎo)型糖基轉(zhuǎn)移酶是參與胞外多糖合成過(guò)程第1 步反應(yīng)的酶。 不同菌株pGT 基因的C 端具有較高的保守性， 且在胞外多糖合成過(guò)程中參與脂質(zhì)載體和糖基的識(shí)別[20]，因此根據(jù)該基因C 端序列設(shè)計(jì)引物，對(duì)C 端的核酸序列測(cè)序，并對(duì)相應(yīng)的氨基酸序列比對(duì)分析[20-21]。 除CCFM688 和M2-CF01-142 株菌外，其它36 株菌均通過(guò)該引物被檢測(cè)到pGT 基因。 這可能是由于這2 株菌的pGT 基因序列與其它pGT 基因序列的相似性較低， 無(wú)法利用本試驗(yàn)設(shè)計(jì)的引物擴(kuò)增所致[22]。 由圖5 可知，擴(kuò)增得到的長(zhǎng)雙歧桿菌pGT 的C 端具有較高的保守性。 根據(jù)系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的分析結(jié)果（圖5），這些序列可以分為3 組： 第1 組中主要為中年人和老年人源菌株的序列， 第2 組中主要為嬰幼兒源菌株的序列， 而第3 組中主要為老年人源的菌株的序列。不同性別人群來(lái)源的菌株沒(méi)有呈現(xiàn)聚類(lèi)現(xiàn)象。

圖5 不同菌株引導(dǎo)型糖基轉(zhuǎn)移酶（pGT）C 端氨基酸序列的比對(duì)結(jié)果和進(jìn)化樹(shù)Fig.5 Alignment and phylogenetic tree of amino acid sequence of the carboxy terminus of priming glycosyltransferase of different strains

3 結(jié)論

從不同年齡志愿者的糞便樣品中分離38 株長(zhǎng)雙歧桿菌，并分析各菌株的部分體外特性，包括生長(zhǎng)曲線、碳水化合物利用試驗(yàn)、發(fā)酵上清液中短鏈脂肪酸組成、 胞外多糖產(chǎn)量和胞外多糖合成關(guān)鍵酶——pGT 酶的序列比對(duì)以及進(jìn)化分析。 結(jié)果顯示，在MRS 培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，嬰幼兒源長(zhǎng)雙歧桿菌的生長(zhǎng)速率相對(duì)較慢， 在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期所能達(dá)到的活菌數(shù)也相對(duì)較低。 嬰幼兒源菌株多數(shù)可利用甘露糖， 而中年人和老年人來(lái)源的菌株多數(shù)不能利用甘露糖。除了3 株老年人源的菌株，其它菌株都可利用低聚果糖、 低聚半乳糖和低聚異麥芽糖。 嬰幼兒源菌株表面胞外多糖產(chǎn)量低于中年人和老年人來(lái)源的菌株， 與老年人源菌株具有顯著性差異。系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果表明，嬰幼兒源菌株的pGT 酶C 端氨基酸序列和老人源菌株的pGT酶C 端氨基酸序列呈現(xiàn)部分聚類(lèi)的趨勢(shì)。