抗菌肽JH-3 對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的抑菌和抗炎作用研究

趙婭婭，劉欣欣，趙雪芹，劉雙雙，朱春玲，王 恒，夏小靜，張慧輝，王 青，徐彥召，杭柏林，孫亞偉，陳仕鈞，胡建和，王 磊

（河南科技學院 動物科技學院，河南 新鄉(xiāng) 453003）

金黃色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus）是人畜共患的重要病原菌之一，可以引起皮膚潰瘍、傷口感染、心內膜炎、骨髓炎、肺炎和中毒性休克綜合癥等各種感染性疾病[1]。自1961 年首次發(fā)現(xiàn)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（Methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA）以來[2]，MRSA 分離率逐年增加，已成為醫(yī)院感染重要的革蘭陽性細菌，多重耐藥現(xiàn)象日益嚴重[3-4]。周順等對分離自雞、豬、家兔及小鼠的75 株金黃色葡萄球菌進行檢測，檢出MRSA 株占57.3%[5]，2017 年1 月～2018 年12 月某醫(yī)院接收的453 例金黃色葡萄球菌陽性住院患者中檢測出95 例多重耐藥菌，其中有62 例耐甲氧西林金黃色葡萄球菌[6]。萬古霉素是治療MRSA 感染最有效的藥物，但是有些MRSA 菌株已經表現(xiàn)出了對萬古霉素的抗性（Vancomycin-resistant Staphylococcus aureus， VRSA），這引起了醫(yī)學界的廣泛關注[7-8]。因此，開發(fā)不易產生耐藥性、活性高、安全可靠的新型抗菌類藥物十分必要。

抗菌肽（Antimicrobial Peptides，AMPs）是機體先天性免疫系統(tǒng)的重要組成部分，構成機體的第一道防線，具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤和免疫調節(jié)等活性[9]。與抗生素相比，抗菌肽的抗菌機制獨特、不易誘發(fā)耐藥性、安全性較高，因此，抗菌肽是抗生素的理想替代品之一[10]。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)牛紅細胞源抗菌肽P3 細胞毒性較小，殺菌活性強，具有很好的臨床開發(fā)前景[11]，通過對其氨基酸序列進行改造獲得JH-3，其氨基酸序列更短（20aa），殺菌和抑菌活性更強[12-13]，其類似物JH-1 能夠顯著抑制豬胸膜肺炎放線桿菌生物被膜的形成[14]。本研究以MRSA（ATCC 25923）為研究對象，體外評價了JH-3對MRSA 的抑菌和抗炎作用，并且發(fā)現(xiàn)JH-3 對多種MRSA（W3275、R89、R5886、YB57、B6994、R196、R238、R6040）均具有迅速有效的殺菌作用，本研究可為后期新型抗MRSA 菌藥物的研發(fā)奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料抗菌肽JH-3（RRFKLLSHSLLVTLASHL，分子量2091.51 ku，脂溶性指數(shù)151.67，電荷數(shù)12），由上海吉爾生化有限公司合成，經反相高效液相色譜純化和質譜鑒定純度＞98%。MRSA ATCC25923 購 自American type culture collection， 其 它MRSA（W3275、R89、R5886、YB57、B6994、R196、R238、R6040）為本實驗分離保存菌株，采用LB 培養(yǎng)基培養(yǎng)。

BCA 蛋白試劑盒為碧云天科技公司產品；LDH 細胞毒性試劑購自Roche公司；PBS、TaKaRa gDNA熒光定量用反轉錄試劑盒（貨號：DRR047A）、75%酒精、胎牛血清FBS、0.25%不含EDTA 胰蛋白酶均購自新鄉(xiāng)智寶生物科技有限公司。

A549 細胞購自美國標準生物品收藏中心（ATCC）。

1.2 抗菌肽JH-3 對金黃色葡萄球菌ATCC25923抑菌效果的檢測取過夜培養(yǎng)的金黃色葡萄球菌100 μL（1×108cfu）與高壓滅菌后的100 mL LB 瓊脂培養(yǎng)基（50 ℃左右）混勻，制備凝固培養(yǎng)基，之后在凝固培養(yǎng)基上打孔，加入100 μg/mL 的JH-3（10 μL/孔）。以ddH2O、DMSO 為陰性對照，以慶大霉素（Gentamicin，100 μg/mL，10 μL/孔）、氨芐青霉素（Ampicillin，100 μg/mL，10 μL/孔）為陽性對照。37 ℃培養(yǎng)12 h～16 h，采用瓊脂擴散法檢測JH-3 對ATCC25923的抑菌活性。同時，在96 孔聚丙乙烯微孔板中加入JH-3 并以LB 液體培養(yǎng)基稀釋，使其濃度分別為100 μg/mL、50 μg/mL、25 μg/mL、12.5 μg/mL、6.3 μg/mL、3.1 μg/mL，總體積為50 μL，以ddH2O為陰性對照，每孔接種1×106cfu/mL 的金黃色葡萄球菌ATCC25923 50 μL，37 ℃培養(yǎng)12 h～16 h，觀察抑菌效果，參照文獻[15]進行最小抑菌濃度測定（Minimum inhibitory concentration ，MIC）。

1.3 抗菌肽JH-3 對金黃色葡萄球菌ATCC25923體外抑菌作用的檢測將金黃色葡萄球菌培養(yǎng)至對數(shù)生長期（OD600nm約1.0），分別加入JH-3至終濃度為1 MIC和4 MIC，ddH2O 為陰性對照，37 ℃180 r/min 繼續(xù)培養(yǎng)，觀察菌液的生長情況，1 h 之內每隔10 min 吸取100 μL 菌液，測定其OD600nm值，參照文獻[16]繪制JH-3 對ATCC25923 的抑菌曲線。同時，采用BCA 蛋白濃度測定試劑盒每隔1 h 測定細菌上清液中總蛋白含量，分析JH-3 對細菌破壞作用。

另外，為檢測不同pH 條件下的JH-3 抑菌效果，配制pH 值分別為3、4、5、6、8、9、10 的LB固體培養(yǎng)基，高壓滅菌后于42 ℃下分別加入ATCC25923菌懸液（終濃度為106cfu/mL）混勻，倒入無菌培養(yǎng)皿中待其冷卻凝固后，進行打孔（直徑3 mm），然后每孔加入相同體積的JH-3（終濃度為1 MIC）于不同pH 培養(yǎng)基中，無菌水孔作為陰性對照。37 ℃培養(yǎng)3 h后倒入覆蓋瓊脂，倒置，37 ℃培養(yǎng)24 h。觀察抑菌圈大小，測量抑菌圈直徑，根據(jù)公式繪制pH-抑菌直徑。抑菌圈直徑=處理抑菌圈直徑-對照抑菌圈直徑。

1.4 檢測抗菌肽JH-3對金黃色葡萄球菌ATCC25923生物被膜的影響

1.4.1 生物被膜形成能力檢測 在96 孔聚苯乙烯微孔板上，將過夜培養(yǎng)的金黃色葡萄球菌ATCC25923接入到LB 液體培養(yǎng)基中，每孔按照1%的比例接種，定容至100 μL；分別加入終濃度為1.0 MIC、0.5 MIC 、0.25 MIC 的JH-3，以ddH2O 為陰性對照，37 ℃培養(yǎng)12 h；吸出培養(yǎng)物上清，用200 μL 無菌PBS 清洗微孔板3 次，用70%甲醇固定30 min，吸出固定液，37 ℃干燥30 min；用1%的Hucker 結晶紫染色液室溫染色5 min，吸出染色液，用水沖洗至無顏色殘留，37 ℃干燥后拍照記錄實驗結果，然后每孔加入100 μL 的70%乙醇溶液溶解，使用酶標儀測定OD570nm的吸光值[17]。

1.4.2 掃描電子顯微鏡觀察細菌生物膜 在6 孔細胞培養(yǎng)板上放置無菌蓋玻片并使其與底面充分貼合，按1∶100體積比加入培養(yǎng)過夜的菌液與新鮮培養(yǎng)液，加入終濃度為0.5 MIC 的JH-3，37 ℃培養(yǎng)24 h，用無菌NaCl 溶液2 mL沖洗蓋玻片3次，利用2.5%戊二醛溶液室溫固定30 min，以pH 7.2 的磷酸緩沖液沖洗3 次，每次10 min，再分別以30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%的乙醇梯度脫水，CO2臨界點干燥，離子噴金鍍膜，通過掃描電鏡（SEM）進行細菌生物被膜觀察。

1.5 抗菌肽JH-3 對金黃色葡萄球菌ATCC25923 介導的A549 細胞LDH 和細胞因子影響的檢測

1.5.1 乳酸脫氫酶（LDH）細胞毒性試驗 將A549細胞（1×105個/mL）接種于96孔板，孵育12 h，然后再加入不同濃度的JH-3（10 μmol/L、20 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L、200 μmol/L），使JH-3 最終濃度分別為1 MIC、2 MIC、4 MIC、8 MIC、16 MIC，分別于37 ℃，5%CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)6 h 后利用細胞毒性檢測試劑盒檢測LDH 的釋放，評價JH-3 單獨作用對A549 細胞的影響；同時，將A549 細胞（1×105個/mL）接種于96 孔板，孵育12 h 后，采用ATCC25923（MOI 10 或MOI 100）感染1 h 后加入終濃度為2 MIC的JH-3，繼續(xù)培養(yǎng)6 h 后利用細胞毒性檢測試劑盒檢測JH-3 對ATCC25923 介導的LDH 釋放的影響。其中PBS 作為陰性對照，用1%Triton X-100 裂解后細胞液作為100%細胞毒性陽性對照，測定OD490nm值。

1.5.2 RT-PCR 檢測細胞因子mRNA 的轉錄 將A549 細胞（1×106個/mL）接種于6 孔板，孵育12 h 后感染ATCC25923（MOI 10），37 ℃，5%CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)1 h 后，分別加入終濃度為1 MIC、2 MIC、4 MIC 的JH-3，采用TaKaRa gDNA 熒光定量用反轉錄試劑盒提取處理組和對照組A549 細胞總RNA 并進行反轉錄，利用熒光定量RT-PCR方法檢測IL-1β、IL-2、IL-6等細胞因子轉錄情況（引物見表1），熒光定量RT-PCR 擴增條件為：95 ℃5 min；95 ℃30 s、55 ℃30 s、72 ℃20 s，共40 個循環(huán)，循環(huán)結束后從60 ℃，每10 s 升高0.5 ℃，至95 ℃停止。

表1 引物表Table 1 primers

1.6 抗菌肽JH-3 對MRSA 廣譜性的檢測為測定JH-3 的抑菌廣譜性，分別將W3275、R89、R5886、YB57、B6994、R196、R238、R6040 菌 株 接 種LB 液體培養(yǎng)基，每株接種兩管，37 ℃過夜培養(yǎng)，使細菌生長至濃度約為1×108cfu/mL，一管加入終濃度為1 MIC 的JH-3，另一管加入同體積ddH2O 為陰性對照，37 ℃培養(yǎng)20 min，取少量菌液10 倍倍比稀釋涂板計數(shù)。

1.7 統(tǒng)計學分析使用GraphPad Prism 5 數(shù)據(jù)處理軟件對實驗結果進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計及差異性分析（One-Way ANOVA 或Two-Way ANOVA），p≤0.05 為差異顯著（文中標注*：p＜0.05；**：p＜0.01；***：p＜0.001）。

2 結 果

2.1 抗菌肽JH-3 對金黃色葡萄球菌ATCC25923抑菌效果的檢測結果通過瓊脂擴散法測定JH-3 對金黃色葡萄球菌ATCC25923 的抑菌活性，結果顯示100 μg/mL JH-3 的孔抑菌環(huán)直徑為8.1±0.2 mm，抑制作用強于100 μg/mL 的慶大霉素（抑菌環(huán)直徑為7.0±0.1 mm），弱于100 μg/mL 的氨芐青霉素（抑菌環(huán)直徑為12.2±0.3 mm）。而陰性對照組的DMSO 與ddH2O不能抑制金黃色葡萄球菌的生長。MIC 測定結果顯示，JH-3 對金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度為25 μg/mL。表明抗菌肽JH-3 對ATCC25923 具有較好的抑菌作用。

2.2 抗菌肽JH-3 對金黃色葡萄球菌ATCC25923體外抑菌作用的檢測結果對JH-3 作用6 h 內MRSA ATCC25923 菌液中活菌數(shù)量和菌液OD600nm進行測定，結果顯示，1 MIC JH-3 即可在360 min 內消除細菌，可對MRSA ATCC25923 起到明顯抑制和殺菌 作 用（圖1A，p＜0.01；圖1B，p＜0.001）；4 MIC JH-3 可在30 min 內快速殺滅細菌，使細菌濃度降低至104cfu/mL，120 min 內清除活菌，殺菌效果更為顯著（圖1B，p＜0.001）。

細菌總蛋白的釋放檢測結果顯示，1 MIC 和4 MIC 的JH-3 作用ATCC25923 5 h 和2 h 后，細菌培養(yǎng)液上清中總蛋白量顯著增加（OD595nm1.75±0.02、1.37±0.01 vs 0.65±0.03，圖1C，p＜0.05），表明JH-3能夠顯著破壞細菌細胞壁和細胞膜，導致細菌內容物的釋放，從而介導菌體死亡。通過對不同pH 條件下的殺菌作用進行檢測，結果顯示，不同pH 值沒有對JH-3 的殺菌作用產生影響，抑菌半徑在均8 mm 左右（圖1D，p＞0.05），表明JH-3 在酸堿環(huán)境下的抑菌效果穩(wěn)定性較好。

圖1 JH-3 對MRSA ATCC25923 的體外殺菌結果Fig.1 In vitro killing curve of JH-3 for MRSA ATCC25923

2.3 抗菌肽JH-3 對金黃色葡萄球菌ATCC25923生物被膜影響的檢測結果通過不同濃度JH-3 的添加，靜態(tài)培養(yǎng)MRSA ATCC25923 24 h 后結晶紫染色，觀察可見0.5 MIC、0.25 MIC 的JH-3 均對MRSA ATCC25923 的生物被膜形成能力有抑制作用，1MIC的JH-3 即可完全消除MRSA ATCC25923 的生物被膜（圖2A）。70%乙醇溶解結晶紫后，OD570nm測定結果顯示， 0.5 MIC 的JH-3 能夠顯著降低ATCC25923生物被形成（圖2B，p＜0.05），1 MIC的JH-3能夠極顯著降低ATCC25923 生 物 被 膜 形 成（圖2B，p＜0.01），表 明JH-3 對生物被膜形成的影響具有明顯的劑量依賴性。掃描電子顯微鏡觀察細菌發(fā)現(xiàn)未處理組細菌大量聚集成團，呈多層結構，生物被膜牢固；0.5 MIC JH-3 處理組粘附到蓋玻片上的細菌數(shù)明顯降低，呈單層結構，生物被膜形成降低（圖2C）。綜上，表明抗菌肽JH-3 能夠降低ATCC25923 生物被膜形成。

圖2 抗菌肽JH-3 對ATCC25923 生物被膜的影響Fig.2 Inhibition of biofilm formation in MRSA ATCC25923 by JH-3

2.4 抗菌肽JH-3 對金黃色葡萄球菌ATCC25923介導的A549 細胞LDH 和細胞因子轉錄的影響檢測結果在A549 細胞上評價JH-3 對LDH 的釋放，結果顯示，不同濃度JH-3 對LDH 的釋放均較小，LDH 釋放率為15%，組間包括與陰性對照相比差異不顯著（圖3A，p＞0.05），表明JH-3 對A549 細胞毒性較小，不影響正常細胞LDH 的釋放；然而當A549 細胞加入ATCC25923 時，能夠顯著增加A549 LDH 的釋放，LDH 的陽性率升至46±2%和73±2%（圖3B，p＜0.05），2 MIC JH-3（50 μg/mL）能夠顯著抑制不同濃度ATCC25923 誘導的LDH 釋放（LDH陽性率46±2%vs 20±1%，73±2%vs 37±2%，圖3B，p＜0.05）。ATCC25923 感染A549 細胞能夠顯著增加炎性相關細胞因子IL-1β、IL-2、IL-6 的轉錄，JH-3 能夠不同濃度抑制ATCC25923 誘導的炎性因子轉錄，且呈劑量依賴性：2 MIC JH-3 能夠顯著降低IL-1β 和IL-6 的 轉 錄（IL-1β：2.1±0.1 vs 7.8±0.2；IL-6：2.0±0.4 vs 7.2±0.2；圖3C 和3E，p＜0.05），1MIC JH-3 能夠顯著降低IL-2 的轉錄（IL-2：7.5±0.2 vs 14.6±0.1，圖3D，p＜0.05）。綜上，表明抗菌肽JH-3 在200 μmol/L 內對A549 細胞無毒性作用，且可降低ATCC25923 介導的細胞LDH 釋放和炎癥相關因子（IL-1β、IL-2 和IL-6）的轉錄水平。

圖3 JH-3 作用后，ATCC25923 誘導A549 細胞LDH 和細胞因子釋放的檢測結果Fig.3 Release of LDH and cytokine in A549 cells after JH-3 treatment

2.5 抗菌肽JH-3 對MRSA 廣譜性的檢測結果對不同MRSA 菌株進行JH-3 殺菌廣譜性評價，結果顯示JH-3 對W3275、R89、R5886、YB57、B6994、R196、R238、R6040 菌株20 min 內均可使活菌數(shù)極顯著降低至103cfu/mL～107cfu/mL（圖4，p＜0.001）。表明JH-3 具有較強的抑菌和殺菌活性，且能對多種MRSA 具有良好的殺菌作用。

圖4 JH-3 對多種MRSA 的殺菌作用測定結果Fig.4 Bactericidal activity of JH-3 against MRSA

3 討 論

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）是目前臨床感染控制的重大挑戰(zhàn)，在侵襲性感染中MRSA 患者的死亡率顯著高于MSSA 患者[18]。糖肽類仍是目前MRSA 感染治療的主流藥物之一[19]，在治療MRSA 感染中萬古霉素常作為系統(tǒng)性MRSA 感染的經驗性和目標治療藥物[20]，但是萬古霉素治療失敗的病例已經不斷出現(xiàn)[21-22]。因此，尋找一種能夠替代現(xiàn)有抗生素的抗菌藥物十分必要。賴崇發(fā)等研究發(fā)現(xiàn)ZTW-41 對革蘭氏陽性菌具有較強的抗菌作用，其中包括對MRSA，抗菌活性比萬古霉素強2～64 倍[23]。邱敏等研究發(fā)現(xiàn)丁香油對MRSA 具有一定的抗菌活性，同β-內酰胺類抗生素聯(lián)用能協(xié)同增加β-內酰胺類抗生素抗MRSA 活性[24]。本研究首次發(fā)現(xiàn)JH-3 對多種MRSA 均具有較強殺菌作用，1 MIC的JH-3 可在20 min 內使耐甲氧西林金黃色葡萄球菌ATCC25923 活 菌 數(shù) 降 低1 000 倍，360 min 內 消 除 細菌，4 MIC 殺菌效果更為顯著。此外，本研究發(fā)現(xiàn)JH-3 能夠降低MRSA 感染造成的細胞炎癥和LDH 的釋放，對MRSA 的生物被膜形成也能起到良好的抑制作用，本實驗可為新型抗MRSA 藥物的開發(fā)提供參考。

目前，針對抗菌肽的殺菌機制尚未定論，但多數(shù)學者一致認為抗菌肽的殺菌機制主要是在細菌表面打孔，形成孔道，致使細胞膜結構破壞，造成胞內水溶性物質大量滲出，而最終導致細菌死亡[25]。Cathelicidin PMAP-36 衍生物G124 能夠破壞E.coli 細胞膜，增強其通透性，內容物外泄，從而導致菌體死亡[26]?？咕腍JH-3 能夠使細菌細胞膜迅速去極化，破壞膜的完整性，導致細菌變形、破裂、黏連，從而起到殺菌作用[27]。HBV 核心蛋白（HBc）富含精氨酸結構域（ARD），能夠結合到銅綠假單胞菌和大腸桿菌表面，結合位點為細菌脂多糖，改變細菌膜通透性，進而起到殺菌作用[28]?？咕膒apiliocin C 端疏水性芳香族氨基酸殘基能夠起到快速破壞大腸桿菌內膜和外膜通透性的作用，為抗菌肽選擇性抗菌機制的研究提供參考[29]。本研究發(fā)現(xiàn)抗菌肽JH-3 能夠在1 h 內快速破壞金黃色葡萄球菌ATCC25923 膜結構，導致內容物（菌體蛋白）外泄，從而起到殺菌的作用。

抗菌肽抗炎功能成為近年來研究熱點。HanR等發(fā)現(xiàn)添加不同濃度抗菌肽CEN1HC-Br，能夠顯著降低痤瘡丙酸桿菌刺激HaCaT 細胞和人單核細胞IL-6、IL-1β、TNF-α和TLR2 的高表達，減輕大鼠耳腫脹，并降低促炎性細胞因子IL-8 的高表達，且抗菌肽CEN1HC-Br 的抗炎效果優(yōu)于克林霉素，該結果與本研究中JH-3 能夠顯著降低金葡菌感染后IL-6的轉錄相一致[30]。KR-12-a5 是12-聚體α-螺旋抗菌肽，其功能與LL-37 類似，研究發(fā)現(xiàn)KR-12-a5 及其類似物能夠顯著抑制LPS 刺激RAW264.7 后TNF-α、NO、IL-6 和MCP-1 分泌，從而降低細胞炎癥反應[31]。Fusco A 等發(fā)現(xiàn)抗菌肽hBD-2 和hBD-3 能夠降低沙門氏菌感染Caco-2 細胞后TNF-α、IL-6、IL-8和IL-1β 的表達，增加抗炎細胞因子TGF-β 的表達，表明抗菌肽能夠顯著降低鼠傷寒沙門氏菌感染Caco-2 細胞引起的炎癥反應，從而調控免疫應答，該結果與本研究中JH-3 能夠顯著降低金葡菌感染后IL-6 和IL-1β的轉錄相一致[32]。血管活性腸肽VIP類似物rVIPa 能夠顯著降低TNBS 誘導的兔結腸中TNF-α 表達水平，并顯著增加結腸中抑炎因子IL-10 含量，從而緩解兔結腸炎癥反應[33]。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)抗菌肽JH-3 通過抑制p38 MAPK 信號通路活化降低炎性細胞因子IL-2、IL-6 和TNF-α分泌，通過抑制caspase-8 和caspase-9 活化，進而抑制caspase-3 活化，從而起到降低RAW264.7 細胞凋亡的作用[34]。A549 細胞是研究金黃色葡萄球菌與宿主細胞相互作用的模式細胞[35]，因此，選擇在A549細胞上進行抗菌肽JH-3 對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的抑菌和抗炎作用研究，發(fā)現(xiàn)JH-3 能夠抑制ATCC25923 誘導的炎性因子釋放，且呈劑量依賴性，表明抗菌肽JH-3 具有良好的抗炎效果，在抗炎作用方面具有良好的應用前景。

本研究系統(tǒng)評價了抗菌肽JH-3 對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的的殺菌作用，初步闡明了JH-3的殺菌機制，主要通過改變ATCC25923 細胞通透性，導致細菌內容物釋放，從而介導菌體死亡，并能夠顯著抑制本菌生物背膜的產生，進一步發(fā)現(xiàn)JH-3 能夠降低MRSA 感染造成的細胞炎癥和LDH 的釋放。本研究還發(fā)現(xiàn)抗菌肽JH-3 對多種MRSA 均具有較強殺菌作用，可為新型抗MRSA 藥物的研發(fā)提供參考。