浙江省地方雞種禽白血病毒抗原檢測(cè)與部分分離株GP85基因序列分析

倪 征，陳 柳，華炯鋼，葉偉成，云 濤，朱寅初，張 存

(浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所，浙江 杭州 310021)

禽白血病(avian leukosis，AL)是由禽白血病亞群病毒(avian leukosis virus，ALV)引起的，以造血細(xì)胞惡性增生為主的一類傳染病總稱。根據(jù)ALV致腫瘤細(xì)胞的類型，可將該類傳染病分為淋巴細(xì)胞性白血病、禽骨髓細(xì)胞性白血病、成髓細(xì)胞性白血病和成紅細(xì)胞性白血病等多種[1]。ALV在分類上屬于反轉(zhuǎn)錄病毒科，α-反轉(zhuǎn)錄病毒屬[2]。根據(jù)病毒的宿主范圍、囊膜特性、抗原差異性等特征，可將ALV分為A-J共10個(gè)亞群。其中，A-D亞群ALV為外源性病毒；E亞群ALV包括極普遍存在的低致病性或無(wú)致病性的內(nèi)源性白血病病毒，其他亞群為內(nèi)源性病毒。J亞群ALV是一種首次發(fā)現(xiàn)于英國(guó)的、新的外源性ALV[3]，其主要囊膜糖蛋白(env)的基因序列明顯不同于A-I亞群，具有明顯的亞群特異性。在所有ALV亞群中，J亞群的致病力最強(qiáng)，對(duì)禽類的威脅最大。

ALV-J在流行初期主要感染肉用型種雞，引起以骨髓樣細(xì)胞瘤為主的白血病。后來(lái)發(fā)現(xiàn)，蛋用型雞也可感染ALV-J，但很少引起腫瘤[4]。值得注意的是，J亞群和B亞群的ALV發(fā)生重組時(shí)，被感染的蛋雞可產(chǎn)生典型的髓細(xì)胞瘤[5]。隨著我國(guó)養(yǎng)雞業(yè)規(guī)模的日益擴(kuò)大，我國(guó)蛋雞群感染ALV-J的病例也在日益增加[6-7]，甚至造成地區(qū)性流行。更令人擔(dān)憂的是，近年來(lái)我國(guó)特有的一些地方雞種屢屢發(fā)生ALV-J感染疫情[7-9]。這警示我們ALV-J在我國(guó)正在從商品肉雞、蛋雞向地方雞群中傳播，宿主范圍不斷擴(kuò)大。為了防止以ALV-J亞群為代表的禽白血病在我國(guó)地方雞中繼續(xù)擴(kuò)散和蔓延，同時(shí)也為了保護(hù)地方雞品種資源，有必要在地方雞的規(guī)模養(yǎng)殖場(chǎng)中實(shí)施禽白血病毒檢測(cè)，并采取必要的凈化措施。鑒于此，本研究對(duì)浙江省地方級(jí)規(guī)模養(yǎng)殖廠中的不同品種雞進(jìn)行了抽樣檢測(cè)，并選擇從感染率較高的地方雞樣本中進(jìn)行分離和基因測(cè)序，分析它與國(guó)內(nèi)其他ALV分離株，以及HPRS103原型毒株的親緣關(guān)系，為進(jìn)一步實(shí)施浙江省地方雞群中ALV的凈化提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 地方雞樣品

本研究從浙江GDZQ公司飼養(yǎng)的20個(gè)品系的地方雞群中進(jìn)行采樣，共計(jì)采集公雞血清樣本1 939份，母雞蛋清樣本5 980份，雛雞胎糞5 384份，備檢。

1.1.2 試劑

本研究使用的禽白血病p27抗原檢測(cè)試劑盒為美國(guó)IDEXX公司產(chǎn)品。胎牛血清(FBS)、胰酶(0.25%)DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液均購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司。DF1細(xì)胞由本研究室保存。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集及處理

血清樣本處理：所有血清樣本均使用肝素鈉真空采血管無(wú)菌采集，顛倒混勻3次后，在冷藏條件下送至實(shí)驗(yàn)室，2 000 r·min-1離心5 min，4 ℃保存，備檢。

蛋清樣本處理：蛋清用樣品稀釋液經(jīng)500倍稀釋后，4 ℃保存，備檢。

胎糞樣本處理：棉拭子加入1 mL樣品稀釋液經(jīng)-70 ℃反復(fù)凍融3次后，備檢。

1.2.2 p27抗原的測(cè)定

根據(jù)試劑盒使用說(shuō)明書，對(duì)所有樣本進(jìn)行ALV p27抗原檢測(cè)。

1.2.3 病毒分離和鑒定

取檢測(cè)陽(yáng)性的樣品上清底部的白細(xì)胞200 μL接種到長(zhǎng)滿單層DF1細(xì)胞的6孔板中，37 ℃ CO2培養(yǎng)箱中吸附2 h，用含2%胎牛血清的細(xì)胞維持液換液，然后繼續(xù)培養(yǎng)7 d。連續(xù)傳3代。使用p27抗原檢測(cè)試劑盒進(jìn)行病毒檢測(cè)。

1.2.4GP85基因擴(kuò)增與測(cè)序

根據(jù)已發(fā)表的GP85基因序列(GenBank登錄號(hào)No.Z46390)，設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物用于GP85基因的擴(kuò)增。GP85+：5＇-GGAGTTCATCTGTTGCGA-3＇；GP85-：5＇-CGCGGATCCGCGCCTGCTACGGCGGT-3＇。預(yù)期產(chǎn)物長(zhǎng)約928 bp。擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃ 變性50 s，55 ℃ 退火1 min，72 ℃ 延伸2 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物使用1%瓊脂糖凝膠電泳觀察。并通過(guò)瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收后與pMD19-T載體連接，然后轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，涂布氨芐抗性的LB平板。37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜后挑取單菌落，通過(guò)菌液PCR篩選陽(yáng)性克隆。最后，將特異性PCR產(chǎn)物送至測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.5 測(cè)序結(jié)果與參考株的序列比對(duì)和分析

將獲得的基因序列進(jìn)行BLAST檢索，使用DNASTAR 軟件將分離毒株的GP85基因序列與已發(fā)表的 ALV 不同亞群代表株進(jìn)行核苷酸同源性比較(表1)。同時(shí)，我們還運(yùn)用生物信息學(xué)軟件繪制了ALV-JGP85基因的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，對(duì)本文ALV-J分離株的遺傳進(jìn)化情況進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 p27抗原檢測(cè)結(jié)果

本研究對(duì)浙江GDZQ公司20個(gè)品系的地方雞群中采集的公雞血清樣本1 939份，母雞蛋清樣本5 980份，以及雛雞胎糞5 384份進(jìn)行了p27抗原檢測(cè)。結(jié)果顯示，所有被檢測(cè)地方雞群都有p27抗原存在，提示在浙江的地方雞群中有不同程度的ALV感染。其中，101系的抗體陽(yáng)性率最高，母雞陽(yáng)性率為40.48%，公雞陽(yáng)性率為16.54%；126系次之，母雞陽(yáng)性率為28.87%，公雞陽(yáng)性率為3.30%；171系抗體陽(yáng)性率最低，其母雞陽(yáng)性率僅為4.08%， 公雞的感染率為0。具體檢測(cè)結(jié)果參見(jiàn)表2。

表1 本文使用的部分參考毒株及其序列號(hào)

表2 浙江省地方雞禽白血病檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)

續(xù)表2 Continued Table 2

2.2 GP85基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

對(duì)感染率比較高的101系、118系、126系、127系和208系的樣品進(jìn)行細(xì)胞接種，盲傳3代以后，對(duì)細(xì)胞上清進(jìn)行PCR檢測(cè)，結(jié)果均擴(kuò)增出924 bp的特異性PCR產(chǎn)物，與預(yù)期一致(圖1)。

M，DNA Marker；1，101系；2，118系；3， 126系; 4，127 系；5，208系；6，陰性對(duì)照。M， DNA Marker; 1， Line 101; 2， Line 118; 3， Line 126; 4， Line 127; 5， Line 208; 6， Negative control.圖1 ALV-J GP85基因擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.1 PCR amplification of ALV-J GP85 gene

2.3 與參考株序列的同源性比較

擴(kuò)增的5個(gè)品系樣品的GP85基因長(zhǎng)度均為924 bp。利用DNASTAR軟件將分離株的序列與參考序列進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果表明，本研究測(cè)的樣品序列之間的核苷酸同源性為90.8%～98.5%，與原型毒株HPRS103核苷酸相似性為90.3%～97.0%，與國(guó)內(nèi)其他分離株的同源性為86.5%～99.0%。分離株與福建(FJ201308株)和廣東(WF13株)分離株的同源性最高(圖2)。

圖2 本文分離株GP85基因與國(guó)內(nèi)ALV參考株的同源性比較Fig.2 Sequence comparison of GP85 gene among isolated strains and reference strains of ALV

2.4 本文ALV-J分離株的遺傳進(jìn)化分析

根據(jù)測(cè)定的5株ALV-J分離株的GP85基因序列以及部分國(guó)內(nèi)參考株的GP85基因序列，利用DNASTAR軟件構(gòu)建了遺傳進(jìn)化樹(shù)(圖3)。分析表明，本文分離株之間的親緣關(guān)系，以及與國(guó)內(nèi)其他分離株之間均具有很近的親緣關(guān)系，并處于同一大的進(jìn)化分支；相比之下，它們與ALV-J原型株HPRS103的遺傳距離都較遠(yuǎn)。但是，從進(jìn)化角度來(lái)看，它們?nèi)蕴幱谕淮蟮倪M(jìn)化分支。

圖3 根據(jù)GP85基因構(gòu)建的本文分離株與其他ALV-J參考株的進(jìn)化樹(shù)Fig.3 Sequence comparison of GP85 gene among isolated strains and reference strains of ALV

3 討論

禽白血病是一類對(duì)養(yǎng)禽業(yè)具有嚴(yán)重威脅的免疫抑制性傳染病，迄今已經(jīng)報(bào)道的ALV至少有10個(gè)亞群，按分離鑒定的先后分別定名為A-J，其中A-E和J都是從雞中分離到的，其他亞型是從鳥(niǎo)類分離而來(lái)。大部分亞群的ALV對(duì)雞的感染性和致病力并不是很強(qiáng)，很少有死亡現(xiàn)象。但是ALV-J例外，它對(duì)肉雞、蛋雞及其他品種的雞均具有很強(qiáng)的傳染性和致病性。近年來(lái)，我國(guó)學(xué)者又不斷發(fā)現(xiàn)在地方雞群中也存在感染現(xiàn)象[10-13]，提示我們要盡快實(shí)施禽白血病的凈化工作，以保障我國(guó)養(yǎng)禽業(yè)的健康發(fā)展以及我國(guó)特有的地方雞資源。

本研究對(duì)浙江省部分地方品種雞體內(nèi)的ALV的p27抗原進(jìn)行了檢測(cè)，從疑似感染雞群中檢測(cè)中分離到5株ALV-J，并對(duì)其GP85基因進(jìn)行PCR分子克隆和序列分析。研究結(jié)果顯示，在檢測(cè)的19個(gè)地方雞品系中，所有品系的雞樣本都呈現(xiàn)抗原陽(yáng)性，其中101系的抗體陽(yáng)性率最高，母雞陽(yáng)性率為40.48%，公雞陽(yáng)性率為16.54%；126系次之，母雞陽(yáng)性率為28.87%，公雞陽(yáng)性率為3.30%；171系抗體陽(yáng)性率最低，其母雞陽(yáng)性率僅為4.08%，公雞的感染率為0。為了解地方雞群中ALV-J的遺傳變異，本研究對(duì)分離到的5株ALV-J的GP85基因進(jìn)行了分子克隆和序列分析。結(jié)果表明，5個(gè)分離毒株的GP85基因大小均為924 bp，與預(yù)期一致；本研究測(cè)的樣品序列之間的核苷酸同源性為90.8%～98.5%，與原型毒株HPRS103核苷酸相似性為90.3%～97.0%，與國(guó)內(nèi)其他分離株的同源性為86.5%～99.0%。分離株與福建(FJ201308株)和廣東(WF13株)分離株的同源性最高。結(jié)果表明，浙江省大部分地方品種雞都不同程度感染ALV-J，而且分離毒株已經(jīng)發(fā)生了不同程度的變異，提示我們應(yīng)加強(qiáng)浙江省地方品種雞ALV的凈化工作。