乙型/丙型肝炎肝硬化患者外周血清鞘脂表達(dá)譜特征分析

王 揚(yáng)， 鐵 偲， 劉 霜， 陳 煜， 段鐘平， 鄭素軍， 張金蘭

1 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院 疑難肝病與人工肝中心， 北京 100069 2 協(xié)和醫(yī)科大學(xué)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 藥物研究所， 北京 100050

病毒性肝炎是全球性的公共衛(wèi)生問題，其中HBV和HCV在亞洲地區(qū)是肝硬化和肝癌的重要病因[1]。越來越多的證據(jù)[2-5]表明，鞘脂代謝物在病毒性肝炎、肝硬化及肝細(xì)胞癌等諸多肝臟相關(guān)疾病中有獨(dú)特的代謝物表達(dá)譜，并參與疾病的病理生理過程，其中可能蘊(yùn)含著此類疾病的新型治療策略。在本研究中，擬探索病毒性肝炎肝硬化與非病毒性肝硬化患者外周血清鞘脂表達(dá)譜的不同。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取2014年7月-2015年5月首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院疑難肝病及人工肝中心收治的104例肝硬化患者為研究對象，其中病毒性肝炎肝硬化66例，非病毒性肝硬化患者31例，另病因未明肝硬化患者7例未納入本研究。

入選標(biāo)準(zhǔn)：影像學(xué)、生化或血液學(xué)檢查有肝細(xì)胞合成功能障礙或門靜脈高壓癥(如脾功能亢進(jìn)及食管胃底靜脈曲張)證據(jù)，或組織學(xué)符合肝硬化診斷(例如Metavir評分=4或Ishak纖維化評分≥5)，或FibroScan檢測結(jié)果>17.5 kPa。排除標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)影像學(xué)或肝穿刺病理檢查診斷為肝癌患者；合并嚴(yán)重的其他疾病，包括未被控制的原發(fā)性腎臟、心臟、肺臟、血管性、神經(jīng)性、消化性、代謝性疾病(明顯甲狀腺功能亢進(jìn)、嚴(yán)重糖尿病和腎上腺疾病)；脂質(zhì)代謝異常，如嚴(yán)重高脂血癥、脂質(zhì)貯積病、肥胖癥(BMI≥30 kg/m2)、免疫缺陷病或合并其他系統(tǒng)腫瘤等；妊娠或哺乳期。

1.2 血液生化指標(biāo)及血清鞘脂檢測 肝功能、生化等檢測由首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院檢驗(yàn)中心完成，使用自動生化檢測器(AU640生化分析儀，OLYMPUS，日本)進(jìn)行ALT和AST等生化指標(biāo)的測定。血清AFP檢測使用自動電化學(xué)發(fā)光免疫分析法(羅氏診斷,上海)。血清鞘脂的檢測由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所完成，采用高效液相色譜與串聯(lián)質(zhì)譜法，Agilent 6410B Triple Quad質(zhì)譜儀購自安捷倫科技有限公司，其中包含了配備Agilent 1200 RRLC系統(tǒng)的三級四級質(zhì)譜儀(Agilent Technologies Inc., Santa Clara, 美國)。共檢測57種鞘脂的表達(dá)，包括12種神經(jīng)酰胺(Ceramide)、5種二氫神經(jīng)酰胺(dihydroCeramide)、16種神經(jīng)酰胺-1-磷酸(Ceramide-1-phosphate)、14種糖化神經(jīng)酰胺(Hexosylceramide)、1種二氫鞘氨醇(dihydroSphingosine)、1種二氫鞘氨醇-1-磷酸(dihydroSphingosine-1-phosphate)、5種二氫神經(jīng)酰胺-1-磷酸(dihydroCeramide-1-phosphate)、1種鞘氨醇(Sphingosine)、1種鞘氨醇-1-磷酸(Sphingosine-1-phosphate)及1種糖化鞘氨醇(HexSphingosine)。

1.3 倫理學(xué)審查 本研究獲得首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理審查委員會批準(zhǔn)(批號：京佑科倫字[2017]14號)。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者一般資料比較 納入此項(xiàng)分析的97例患者中，男71例，女26例，平均(54.44±11.48)歲。66例病毒性肝炎肝硬化患者中，乙型肝炎肝硬化49例，丙型肝炎肝硬化15例，HBV重疊HCV所致肝硬化患者2例；31例非病毒性肝硬化患者中，酒精性肝硬化患者17例，原發(fā)性膽汁性肝硬化8例，藥物性肝硬化6例。

病毒性肝炎肝硬化患者與非病毒性肝硬化患者的年齡、男性比例、TBil、DBil及GGT等臨床指標(biāo)之間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)(表1)。

表1 兩組患者的臨床特征比較

2.2 兩組患者外周血清鞘脂表達(dá)水平 57種鞘脂中，3種鞘脂表達(dá)水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)，分別為Cer(d18∶1/12∶0)、HexCer(d18∶1/14∶1)和dhCer(d18∶0/2∶1)-1-P；其余鞘脂表達(dá)水平在兩組中差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)(表2)。

表2 兩組患者的外周血清鞘脂表達(dá)水平比較

2.3 logistic多因素回歸分析 將兩組表達(dá)水平有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的結(jié)果納入logistic多因素回歸分析，結(jié)果表明，dhCer(d18∶0/24∶1)-1-P水平高表達(dá)與病毒性肝炎肝硬化獨(dú)立相關(guān)(比值比=1.11, 95%可信區(qū)間：1.004～1.225,P=0.042)。

2.4 57種鞘脂在病毒性肝炎肝硬化中的亞組分析 對66例病毒性肝炎肝硬化患者進(jìn)一步進(jìn)行亞組分析，結(jié)果表明，Cer(d18∶1/12∶0)、HexCer (d18∶1/14∶1)和dhCer(d18∶0/24∶1)-1-P在乙型肝炎肝硬化和丙型肝炎肝硬化患者之間的表達(dá)水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[Cer(d18∶1/12∶0)：(168.85±0.67) pmol/0.1 ml vs (168.88±0.69) pmol/0.1 ml,Z=-0.563,P=0.574；HexCer (d18∶1/14∶1)：(217.42±10.71) pmol/0.1 ml vs (213.65±3.20) pmol/0.1 ml,Z=-0.610,P=0.542；dhCer(d18∶0/24∶1)-1-P：(60.71±2.28) pmol/0.1 ml vs (60.67±2.07) pmol/0.1 ml,Z=-0.579,P=0.563]。其余54種鞘脂表達(dá)中，Cer(d18∶1/18∶0)、dhCer(d18∶0/18∶0)、dhCer (d18∶0/18∶1)和dhCer(d18∶0/16∶1)-1-P在乙型肝炎肝硬化和丙型肝炎肝硬化患者之間的表達(dá)水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[140.69(77.19～215.90) pmol/0.1 ml vs 81.03(47.88～155.51) pmol/0.1 ml，Z=-2.084，P=0.037；60.62(59.89～61.44) pmol/0.1 ml vs 59.64(59.44～60.71) pmol/0.1 ml ，Z=-2.354，P=0.019；62.43(60.31～67.22) pmol/0.1 ml vs 60.77(59.84～62.12) pmol/0.1 ml ，Z=-2.171，P=0.030；131.06(107.76～184.42) pmol/0.1 ml vs 110.48(90.19～117.59) pmol/0.1 ml，Z=-2.829，P=0.005]。

3 討論

在亞太地區(qū)，病毒性肝炎是導(dǎo)致肝硬化、肝癌最重要的原因。雖然有部分研究報(bào)道了三類人群具有獨(dú)特的鞘脂代謝產(chǎn)物表達(dá)譜，可以作為輔助診斷的分子標(biāo)志物[6-7]，但是病毒性肝炎肝硬化患者與非病毒性肝硬化患者的鞘脂代謝產(chǎn)物表達(dá)譜有何不同，目前尚未有研究報(bào)道，加強(qiáng)該方面研究有助于從鞘脂代謝角度闡明其發(fā)病機(jī)制、尋找新的治療靶標(biāo)。本研究采用高效液相色譜-質(zhì)譜分析方法，檢測病毒性肝炎肝硬化患者血清中57種鞘脂表達(dá)水平，首次發(fā)現(xiàn)dhCer(d18∶0/24∶1)-1-P與病毒性肝炎肝硬化密切相關(guān)。

雖然臨床實(shí)踐中用同樣的實(shí)驗(yàn)室及生化檢查評估肝臟的損傷程度，但是病毒性肝炎肝硬化患者有自己獨(dú)特的臨床及病理特征。有研究[8]表明，與酒精性肝硬化患者容易發(fā)生凝血功能障礙和心肌病相比，病毒性肝炎肝硬化患者更易發(fā)生肝性腦病和心血管。同時有研究[9-11]表明，HBV或HCV感染者中，固有免疫細(xì)胞Toll樣受體可能參與機(jī)體抗病毒的過程，其表達(dá)下調(diào)，并伴隨病毒發(fā)生免疫逃逸。

二氫神經(jīng)酰胺及糖化神經(jīng)酰胺是神經(jīng)酰胺從頭合成的中間產(chǎn)物，廣泛參與機(jī)體凋亡、誘導(dǎo)自噬及引起細(xì)胞周期阻滯等。本團(tuán)隊(duì)[12-13]既往研究結(jié)果提示，二氫神經(jīng)酰胺可能參與了肝臟疾病慢性化的過程，高表達(dá)的二氫神經(jīng)酰胺(d18∶0/24∶0)可能與HBV相關(guān)慢加急性肝衰竭相關(guān)，而高表達(dá)的糖化神經(jīng)酰胺可能與病毒復(fù)制相關(guān)，并且可能成為潛在的診斷生物學(xué)標(biāo)志物。本研究結(jié)果與既往結(jié)果類似，檢測結(jié)果中大部分鞘脂表達(dá)水平在病毒性肝炎肝硬化中高于非病毒性肝硬化患者。磷酸化的二氫神經(jīng)酰胺(PDHC)衍生于二氫神經(jīng)酰胺，廣泛存在于血液循環(huán)、神經(jīng)系統(tǒng)及臟器組織中，可能與機(jī)體固有免疫應(yīng)答相關(guān)[14]。Nichols等[15-17]研究表明，PDHC能夠增強(qiáng)自身免疫應(yīng)答，增加樹突狀細(xì)胞IL-6的釋放，并且與脂多糖表達(dá)無關(guān)，進(jìn)一步推測PDHC可能通過作用于Toll樣受體2的配體而發(fā)揮作用。本研究的結(jié)果可能與此類似，dhCer(d18∶0/24∶1)-1-P高表達(dá)與病毒性肝炎肝硬化密切相關(guān)，但在HBV、HCV等不同病因肝炎肝硬化亞組分析中差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明其參與了病毒性肝炎的共同發(fā)病過程，可能病毒感染后誘發(fā)了機(jī)體固有免疫反應(yīng)，但其具體的調(diào)節(jié)機(jī)制尚有待于進(jìn)一步的研究。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)血清dhCer(d18∶0/24∶1)-1-P水平上調(diào)與病毒性肝硬化密切相關(guān)，可能有助于從鞘脂角度深入理解病毒性肝硬化的疾病特征。