缺氧微環(huán)境與肝病發(fā)生發(fā)展的關(guān)系

李志國， 楊先照， 李小科， 馬 潯， 王 姍， 張 梅， 葉永安

1 北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院 a.消化科； b.檢驗科， 北京 100700； 2 北京中醫(yī)藥大學(xué) 肝病研究所， 北京 100700； 3 北京杏園金方國醫(yī)醫(yī)院， 北京 101300

1 肝臟分區(qū)與氧氣的關(guān)系

氧氣對所有活細胞至關(guān)重要，其在體內(nèi)的運輸受到組織或器官代謝需求和功能狀態(tài)的調(diào)節(jié)[1]。肝臟獨特的解剖結(jié)構(gòu)，影響其生理功能和氧氣穩(wěn)態(tài)[2]：肝臟分別通過肝動脈和肝門靜脈接受高氧血液和乏氧血液。在肝臟中，從門靜脈和肝動脈到中心靜脈的單向血流(即門靜脈區(qū)60～65 mm Hg，中央靜脈周圍區(qū)域30～35 mm Hg)在肝臟實質(zhì)內(nèi)形成氧梯度[3]。

肝臟的基本結(jié)構(gòu)單位是肝腺泡。依據(jù)氧張力的不同形成3個不同代謝能力和酶含量的區(qū)域(門靜脈周圍區(qū)域糖異生能力更強，而中央靜脈周圍區(qū)域糖酵解能力更強)[4]，從而將肝腺泡分為3個功能帶：近匯管區(qū)為Ⅰ帶，此區(qū)域肝細胞最先獲得新鮮血源，代謝活躍，再生能力強；近中央靜脈周圍區(qū)域為Ⅲ帶，此區(qū)域肝細胞營養(yǎng)較差，對有害物質(zhì)的抵抗力低，再生能力弱；位于二者之間的為Ⅱ帶，此區(qū)域肝細胞的營養(yǎng)、代謝及再生能力均介于前兩者之間。不同肝腺泡區(qū)域的結(jié)構(gòu)、功能不同，中央靜脈周圍區(qū)域比門靜脈周圍區(qū)域(匯管區(qū))更易受到極度缺氧的影響[3]。

肝細胞在不同氧張力下的生理暴露影響其對缺氧應(yīng)激的能力。在接近門靜脈周圍氧張力條件下培養(yǎng)的原代大鼠肝細胞較在接近中央靜脈周圍氧張力條件下存活時間長[5]。表明在缺氧的情況下(如肝代謝需求增加、組織缺血等)，當(dāng)氧張力低于閾值時，中央靜脈周圍的肝細胞可能會受到更大的損傷[6]。

2 肝病的缺氧微環(huán)境

缺氧微環(huán)境是在致病因素作用下，組織細胞局部因炎癥損傷等引起缺氧而形成。肝損傷引起的血管紊亂和微環(huán)境缺氧，在發(fā)病早期已經(jīng)開始。缺氧是急慢性肝病重要的微環(huán)境特征，也是導(dǎo)致肝損傷及炎癥發(fā)生的重要因素[4]。低氧不僅是細胞損傷和炎癥的促進因素[7]，亦是肝再生的抑制劑、血管生成和纖維生成的主要刺激物以及肝癌的啟動因素。目前發(fā)現(xiàn)最重要的缺氧應(yīng)激因子是缺氧誘導(dǎo)因子(hypoxia-inducible factor，HIF)，缺氧的許多效應(yīng)均由HIF-1α介導(dǎo)[4]。

2.1 肝損傷與缺氧微環(huán)境 “常氧”和“缺氧”取決于器官適應(yīng)的正常氧張力，盡管在健康肝臟中存在氧張力的變化，但未觀察到缺氧反應(yīng)[8]。然而，肝臟的特殊結(jié)構(gòu)和肝細胞的高代謝需求使其易受缺氧影響，在病毒性肝炎、脂肪性肝炎、肝纖維化(肝硬化)和肝癌等肝臟受損及繼發(fā)炎癥時，均伴有缺氧現(xiàn)象[6,9-10]。例如肝病時出現(xiàn)的肝細胞腫脹、肝血管收縮、肝竇狹窄，肝竇毛細血管化，肝竇間隙膠原纖維沉積，乃至肝細胞再生結(jié)節(jié)和纖維間隔形成，肝內(nèi)血管網(wǎng)異常，以及由于肝功能受損、腸源性內(nèi)毒素促使內(nèi)皮素增多等均可導(dǎo)致或加重肝內(nèi)缺氧，形成肝臟缺氧微環(huán)境，而使微環(huán)境缺氧貫穿于肝病發(fā)生發(fā)展的始終。

2.2 肝纖維化/肝硬化與缺氧微環(huán)境 慢性肝損傷引起缺氧和肝纖維化。肝星狀細胞(HSC)在纖維化的發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用[11]。在由酒精、肝炎病毒、遺傳性疾病等引起的慢性肝損傷期間，細胞因子刺激HSC活化為肌成纖維細胞，并刺激其增殖和產(chǎn)生膠原，這是導(dǎo)致肝纖維化發(fā)生的關(guān)鍵步驟[12]。慢性肝損傷期間的缺氧微環(huán)境可能是HSC活化的重要刺激因素[13]。缺氧刺激HSC釋放多種介質(zhì)，這些介質(zhì)影響纖維化的進展，例如HSC在缺氧條件下合成并釋放血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)和血管生成素-1[14-15]。血管生成促進肝纖維化，而HSC促進血管生成介質(zhì)的產(chǎn)生，因此血管生成和肝纖維化是相互促進的[16]。

在肝纖維化過程中伴隨的肝臟缺氧通過HIF-1上調(diào)HSC與肝竇內(nèi)皮細胞中的VEGF和血管生成素等基因表達，誘導(dǎo)肝竇內(nèi)皮細胞向毛細血管內(nèi)皮轉(zhuǎn)化[17]，導(dǎo)致肝竇表面的篩孔數(shù)量明顯減少甚至消失，這種肝內(nèi)結(jié)構(gòu)的異常改變將促進肝纖維化進展，導(dǎo)致肝內(nèi)血管阻力增加、門靜脈高壓形成[4]。

肝硬化時肝細胞缺氧除由肝內(nèi)動靜脈分流、肝竇減少和肝竇毛細血管化[18]所致外，還受HSC在肝血竇管腔密度增大和覆蓋增多、血管收縮因子過多[19-20]等影響。HSC具有收縮特性，其可引起肝竇血管收縮，入肝血流減少而加重缺氧。此外，缺氧及HIF-1上調(diào)內(nèi)皮素-1、內(nèi)皮素-1受體及內(nèi)皮素-B受體引起的血管收縮進一步加劇微環(huán)境缺氧[4]。

2.3 肝細胞癌(HCC)的缺氧微環(huán)境 HCC組織細胞生長所處的氧分壓較正常肝組織低[21]，這種缺氧環(huán)境不僅對HCC的發(fā)生發(fā)展十分重要，而且在誘導(dǎo)HCC細胞耐藥、血管形成等多個方面發(fā)揮重要作用。HCC與其他實體腫瘤類似，都具有缺氧的特征，特別是在血管生成不能滿足腫瘤快速生長的代謝需求時[22]。一方面，缺氧誘導(dǎo)腫瘤壞死，限制HCC細胞增殖；另一方面，缺氧導(dǎo)致HCC細胞開啟缺氧反應(yīng)，誘導(dǎo)血管生成以及腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移。肝硬化基礎(chǔ)上發(fā)生的HCC同時具有肝硬化的缺氧微環(huán)境特征。

為了適應(yīng)缺氧微環(huán)境，腫瘤的新陳代謝方式會發(fā)生相應(yīng)改變，正常組織主要通過有氧呼吸獲得能量，而腫瘤細胞的能量主要來自無氧糖酵解，即使氧含量正常，腫瘤細胞也主要依賴無氧糖酵解獲取能量，這一現(xiàn)象稱為Warburg效應(yīng)。在缺氧狀態(tài)下，HCC細胞可以選擇糖酵解等機制獲取能量并繼續(xù)增殖[23]。從氧化磷酸化向無氧糖酵解的轉(zhuǎn)變是腫瘤細胞能夠在缺氧微環(huán)境中存活的重要前提，在此過程中HIF-1α起到至關(guān)重要的作用。HIF-1α能夠直接激活乳酸脫氫酶A(LDHA)、丙酮酸脫氫酶激酶1(PDK-1)、M2型丙酮酸激酶(PKM2)和葡萄糖載體蛋白1(GLUT-1)等基因，這些基因編碼的葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白和糖酵解酶是腫瘤細胞無氧糖酵解所需。目前研究已證明PKM2[24]、GLUT-1[25]是腫瘤細胞Warburg效應(yīng)的重要調(diào)控因子。

3 HIF的結(jié)構(gòu)及調(diào)節(jié)

3.1 HIF的結(jié)構(gòu)及分類 為了適應(yīng)環(huán)境中不同氧氣水平，生物體開發(fā)出氧氣傳感系統(tǒng)，觸發(fā)適應(yīng)性轉(zhuǎn)錄以維持穩(wěn)態(tài)。在缺氧條件下，HIF轉(zhuǎn)錄活性增強導(dǎo)致參與細胞功能的各種基因表達增強，從而促進體內(nèi)細胞代謝、增殖和遷移。目前有3種已知的HIF轉(zhuǎn)錄因子：HIF-1、HIF-2和HIF-3，它們是由HIF-1α、HIF-2α、HIF-3α與HIF-1β亞單位組成的3種異二聚體復(fù)合物[8,26]。HIF-1β又被稱為芳香烴受體核轉(zhuǎn)運蛋白，在細胞核內(nèi)表達不受氧濃度影響，其主要作用是維持HIF的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定[27]。α亞單位通過氧誘導(dǎo)的蛋白降解進行調(diào)節(jié)，HIF-1α與HIF-2α亞基均受氧氣濃度影響，缺氧可誘導(dǎo)其高表達。

HIF中最重要的轉(zhuǎn)錄因子是由HIF-1α及HIF-1β組成的HIF-1，其廣泛表達于機體各組織及細胞，參與哺乳動物細胞中氧平衡調(diào)節(jié)[28]。HIF-1適應(yīng)細胞和組織中的低氧會導(dǎo)致一系列與血管生成(主要是VEGF)、紅細胞生成、葡萄糖攝取及代謝、細胞增殖和生存有關(guān)的基因的轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)[26,29]。

3.2 HIF的氧依賴性調(diào)節(jié) 細胞通過協(xié)調(diào)轉(zhuǎn)錄反應(yīng)來適應(yīng)低氧，這一反應(yīng)由HIF調(diào)節(jié)[30]。HIF通過結(jié)合靶基因中被稱為低氧反應(yīng)元件的特異性DNA序列來調(diào)節(jié)信號傳導(dǎo)事件，導(dǎo)致其轉(zhuǎn)錄增加或減少[27]。盡管HIF轉(zhuǎn)錄因子在缺氧條件下穩(wěn)定，但在“正?！毖醴謮合?，靶向脯氨酰殘基被脯氨酰羥化酶結(jié)構(gòu)域包含蛋白(PHD)羥基化后，羥基化的HIF-α與von Hippel-Lindau(VHL)相互作用，激活泛素酶系統(tǒng)，導(dǎo)致HIF-1α亞單位迅速降解，故正常氧濃度情況下HIF-1α表達較低[31-32]。在缺氧條件下，PHD活性降低，導(dǎo)致HIF-1α亞單位穩(wěn)定表達，并通過N末端和C末端激活域與其調(diào)節(jié)元件[31]結(jié)合，進而形成轉(zhuǎn)錄激活復(fù)合物。

另一種氧敏感性羥化酶，即缺氧誘導(dǎo)因子抑制因子(factor inhibiting HIF，F(xiàn)IH)，亦調(diào)節(jié)HIF-1α的表達。FIH可使HIF-1α的C末端反式激活結(jié)構(gòu)域中天冬酰胺酰殘基羥基化，但不抑制異二聚體HIF-1α與其轉(zhuǎn)錄共激活因子的結(jié)合[33]。FIH限制HIF-1α的C末端反式激活結(jié)構(gòu)域的活性，但不限制N末端結(jié)構(gòu)域的活性，這對于缺氧反式激活的基因具有重要意義，因這一特征，細胞可以表現(xiàn)出雙相HIF-1α依賴性轉(zhuǎn)錄特征：在中度缺氧下為PHD失活型，在嚴重缺氧下為PHD和FIH共同失活型[34]。

3.3 HIF的非氧依賴性調(diào)節(jié) 除了缺氧之外，HIF-1α還可以通過其他介質(zhì)被激活，包括細胞因子、生長因子和氧化應(yīng)激[35]。細胞表面受體，例如G蛋白偶聯(lián)受體和受體酪氨酸激酶促進HIF-1α mRNA 翻譯和反式激活活性[8]。Luo等[36]發(fā)現(xiàn)了PKM2的新作用，該酶催化糖酵解的最后一步，并作為HIF-1α和HIF-2α的共激活因子。有研究[37]顯示在肝癌異種移植動物模型中，PI3K抑制劑可阻斷HIF-1α，表明HIF-1α的激活受PI3K/Akt通路調(diào)控。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是細胞生長和增殖的整體調(diào)節(jié)劑，其可通過細胞翻譯和轉(zhuǎn)錄的特異性激活來調(diào)節(jié)HIF表達，許多報道[38-39]顯示細胞通過PI3K/AKT/mTOR途徑進行HIF相關(guān)的調(diào)節(jié)。

4 HIF與肝病的關(guān)系

4.1 HIF與肝損傷 肝損傷引起微環(huán)境缺氧，而缺氧進一步加重肝損傷及炎癥，HIF在其中發(fā)揮重要作用。Morello等[40]證明HIF-2α通過觸發(fā)肝細胞釋放富組氨酸的糖蛋白驅(qū)動非酒精性脂肪性肝炎。細胞實驗[41]發(fā)現(xiàn)黃酮類化合物千層紙素A可通過抑制HIF-1α改善乙醇誘導(dǎo)的肝脂肪變性和炎癥。新近研究[42]表明，缺氧微環(huán)境中癌細胞和腫瘤相關(guān)巨噬細胞(腫瘤內(nèi)的主要促炎細胞)之間的HIF-1α/IL-1β信號傳導(dǎo)環(huán)，促進癌細胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)移。這些研究探討了缺氧及HIF與肝臟炎癥損傷，以及炎癥與肝癌的關(guān)系，為肝炎的治療提供了新的契機。

4.2 HIF與肝纖維化 肝纖維化是所有慢性肝病的共同途徑，肝纖維化持續(xù)進展，最終導(dǎo)致肝硬化。肝纖維化的形成伴隨著膠原和細胞外基質(zhì)(ECM)的積累。肝臟中的HSC在肝纖維化發(fā)展中起關(guān)鍵作用[11]。活化的HSC和肌成纖維細胞(myofibroblast, MF)遷移促進了肝纖維化的進展[43]。HIF-1α調(diào)節(jié)缺氧時HSC的活化，這對于膠原沉積和血管生成尤為重要[44-45]。HIF-1α在肝纖維化發(fā)展中的作用已在HIF-1α基因敲除小鼠的實驗中明確鑒定[44]，表明缺氧和HIF-1α募集先于纖維化發(fā)生，HIF-1α的肝細胞特異性沉默導(dǎo)致ECM沉積顯著減少。在從手術(shù)標本切片分離的人HSC中，通過缺氧激活HIF-1α，證明HIF-1α是刺激HSC和MF遷移的啟動因素；HIF-1α的有效沉默導(dǎo)致HSC和MF遷移顯著抑制，表明HIF-1α在人肝纖維化的發(fā)展中具有不可或缺的作用[46]。近期動物實驗[47]表明，異氯酸B通過microRNA-122/HIF-1α信號通路抑制多種促纖維化因子，對非酒精性脂肪性肝炎相關(guān)的肝纖維化具有顯著的保護作用。

4.3 HIF與肝癌前病變 HIF-1α和HIF-2α活化與肝細胞惡性轉(zhuǎn)化存在明顯聯(lián)系。由于肝硬化為HCC的高危因素，因此確定HIF是否是肝硬化進展為癌癥的驅(qū)動力具有重要意義。對肝細胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化的動態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)，在肝細胞發(fā)生變性階段，HIF-1α mRNA轉(zhuǎn)錄增加和HIF-1α過表達，在肝細胞發(fā)生變性、癌前病變和癌變的不同發(fā)展階段，HIF-1α基因及蛋白呈動態(tài)進行性表達，且血清HIF-1α表達情況與肝組織平行，整個過程中HIF-1α基因序列與GenBank源序列一致。有研究[48]表明，肝細胞惡性轉(zhuǎn)化過程中HIF-1α mRNA轉(zhuǎn)錄和HIF-1α蛋白表達在癌前病變和HCC形成階段達到高峰。

4.4 HIF與HCC 缺氧驅(qū)動的血管生成是組織再生、炎癥和腫瘤生長的突出特征，HIF-1和HIF-2對低氧誘導(dǎo)的血管生成有重要影響[29]。作為低氧反應(yīng)的主要介質(zhì)之一，HIF-1是激活缺氧反應(yīng)的基因，該基因參與腫瘤發(fā)生和癌癥進展的多個方面，包括增殖、代謝、血管生成、侵襲、轉(zhuǎn)移和耐藥[22]。HCC微環(huán)境中高水平的HIF-1導(dǎo)致HCC細胞的增殖和存活能力增強，HIF-1過表達與HCC的不良預(yù)后相關(guān)[22]。有研究[49]證實，HIF1α通過增加HCC細胞中的SNAI1轉(zhuǎn)錄促進上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化。臨床HCC組織研究[50]證實HIF-1α和賴氨酰氧化酶樣蛋白2(lysyloxidase-like 2，LOXL2)呈正相關(guān)，HIF-1α和LOXL2的高表達與血管生成擬態(tài)的形成及不良預(yù)后有關(guān)，并發(fā)現(xiàn)HIF-1α通過調(diào)節(jié)LOXL2誘導(dǎo)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，HCC細胞遷移、侵襲和血管生成擬態(tài)形成。

此外，HIF與抗腫瘤治療中出現(xiàn)的耐藥相關(guān)[51]。HIF的高表達與HCC靶向藥物索拉非尼耐藥現(xiàn)象之間存在關(guān)聯(lián)，目前索拉非尼治療與HIF抑制劑的組合已被證明是在體外和體內(nèi)克服索拉非尼耐藥的方法[52]。近期研究[53]表明，肝癌缺氧微環(huán)境中HIF-1α誘導(dǎo)的髓樣細胞-1(TREM-1)陽性腫瘤相關(guān)巨噬細胞(TAMs)啟動腫瘤免疫抑制，是造成肝癌抗程序性死亡配體-1治療抵抗的主要原因。

5 小結(jié)

缺氧微環(huán)境是肝病的一種普遍現(xiàn)象，貫穿于肝病發(fā)生發(fā)展的始終。HIF是目前發(fā)現(xiàn)的最重要的缺氧應(yīng)激因子，與肝細胞的炎癥損傷、纖維化的形成、肝細胞的惡性轉(zhuǎn)化密切相關(guān)，并在肝癌發(fā)生階段起重要作用。針對肝病各個階段亟需新藥物的開發(fā)，當(dāng)前有關(guān)HIF作用機制的研究為肝病各階段的治療提供了新策略。但需要進一步明確缺氧與肝病進展的確切機制，以及深入研究缺氧微環(huán)境與炎癥和免疫等方面的關(guān)系。以期通過干預(yù)或調(diào)節(jié)缺氧微環(huán)境或其中的某一或某些靶點來改善肝臟疾病。