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    一種用于線粒體受激輻射損耗超分辨成像的新型探針*

    2020-08-29 07:37:18張佳SamantaSoham王佳林王璐瑋楊志剛嚴偉屈軍樂
    物理學(xué)報 2020年16期
    關(guān)鍵詞:探針波長分辨率

    張佳 Samanta Soham 王佳林 王璐瑋 楊志剛 嚴偉 屈軍樂

    (深圳大學(xué)物理與光電工程學(xué)院, 光電子器件與系統(tǒng)教育部/廣東省重點實驗室, 深圳 518060)

    1 引 言

    激光掃描共聚焦顯微鏡具有實時、非侵入、斷層掃描、三維成像和分辨率高等優(yōu)點, 是生物和醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域研究的重要工具[1]. 然而, 由于光學(xué)衍射極限的存在, 導(dǎo)致其空間分辨率無法突破半個波長, 限制了對細胞內(nèi)超精細結(jié)構(gòu)的研究. 打破衍射極限, 提高光學(xué)顯微鏡的分辨率, 從而揭示細胞內(nèi)超精細結(jié)構(gòu)的特征和動態(tài)過程, 已成為生命科學(xué)發(fā)展的迫切要求, 超分辨成像技術(shù)是解決這一問題的關(guān)鍵[2]. 通過科研工作者的不斷努力, 近二十年來超分辨顯微成像技術(shù)得到飛速發(fā)展, 分辨能力提高到亞細胞器和生物大分子尺度, 達到納米量級的空間分辨率[2?15]. 雖然已報道的超分辨成像技術(shù)的種類很多, 但總體上可以將這些技術(shù)分為兩類: 一類是基于光場調(diào)控的超分辨成像技術(shù), 包括受激輻射損耗(stimulated emission depletion, STED)[9]、可逆飽和光學(xué)熒光躍遷(reversible saturable optical fluorescence transitions, RESOLET)[10]、基態(tài)光損耗(ground state depletion, GSD)[11]和結(jié)構(gòu)光照明顯微(structured illumination microscopy, SIM)[12]技術(shù)等; 第二類是基于單分子定位的超分辨成像技術(shù), 包括光激活定位顯微(photoactivated structured-illumination microcopy, PALM)[13]、隨機光學(xué)重構(gòu)顯微(stochastic optical reconstruction microscopy, STORM)[14]和點 積 累 納 米 成 像 顯 微(point accumulation for imaging in nanoscale topography, PAINT)[15]等等. 在眾多超分辨成像技術(shù)中, STED 是最早打破光學(xué)衍射極限的成像技術(shù), 具有可直接獲取圖像、快速掃描、三維超分辨以及可深層成像等特點, 具有非常廣泛的應(yīng)用前景.

    STED 技術(shù)通過純光學(xué)方法實現(xiàn)對熒光團亮態(tài)和暗態(tài)的調(diào)控[16], 利用受激輻射效應(yīng)來壓縮發(fā)光點的點擴展函數(shù)(point spread function, PSF),從而繞過光學(xué)衍射極限限制. 通常情況下, 激發(fā)光斑為高斯型, 如果在激發(fā)光斑上套疊一個用于產(chǎn)生受激輻射的環(huán)形損耗光, 在重疊區(qū)域處于激發(fā)態(tài)的熒光分子將以受激輻射的形式迅速回到基態(tài), 只剩下環(huán)形光斑中心區(qū)域的分子以自發(fā)輻射的形式發(fā)射熒光, 從而達到壓縮點擴展函數(shù)的目的. 為了能有效迫使熒光團進入暗態(tài), 激發(fā)光要先于損耗光(STED 光)約200 ps 到達樣品, 且受激輻射過程必須先于自發(fā)輻射. 自發(fā)輻射通常在樣品被激發(fā)后幾個納秒內(nèi)(熒光團的激發(fā)態(tài)壽命)發(fā)生, 因此要在這個時間段內(nèi)完成受激輻射過程. 由于時間范圍很短, 以及熒光分子的受激輻射橫截面很小, 要想完全耗盡重疊區(qū)域的熒光, 需要非常高的STED光強度. 另外, STED 系統(tǒng)的空間分辨率與STED光的強度成正比, STED 光強度越大, 系統(tǒng)的空間分辨率也就越高. 因此要達到高的空間分辨率, 一般情況下會導(dǎo)致樣品的光漂白[17]和光毒性[18], 這對活細胞成像非常不利, 阻礙了STED 技術(shù)的應(yīng)用和發(fā)展.

    針對這些問題, STED 技術(shù)的發(fā)明人Hell 教授[18]于2013 年提出了利用時間門控探測技術(shù), 在較低的能量下實現(xiàn)了分辨率的提升. 我們課題組于2018 年提出利用相圖分析技術(shù)分離出具有長熒光壽命的光子, 來提高系統(tǒng)的空間分辨率, 或者在保持空間分辨率不變的情況下降低STED 光的功率[8]. 2017 年北京大學(xué)Liu 等[19]和華南師范大學(xué)Zhan 等[20]同時提出利用上轉(zhuǎn)換納米粒子實現(xiàn)STED 超分辨成像, 大大提高了抗光漂白特性. 同時也有許多其他量子點被用于STED 超分辨成像[21,22], 在保持高空間分辨率的同時具有很好的光穩(wěn)定性, 并能承受高的激光功率和長的曝光時間.自適應(yīng)光學(xué)像差校正技術(shù)也是降低STED 光強度和提高圖像質(zhì)量的有效方法之一[4?5,23]. 其他克服這些問題的方法還包括2013 年浙江大學(xué)Kuang 等[24]提出的一種類似于STED 的超分辨成像方法, 即熒光發(fā)射差分(fluorescence emission difference, FED)顯微, 可實現(xiàn)低光功率超分辨成像. 雖然人們在STED 光學(xué)成像系統(tǒng)、方法和探針上做了很多改進, 也取得了很大進展. 但是系統(tǒng)和方法的改進畢竟有限, 量子點探針的靶向性和毒性依然是需要解決的難題. 雖然有商用的ATTO 系列STED 有機探針可以使用, 但這些探針只能用于制備固定樣品, 染色過程很繁瑣, 很難用于活細胞成像[25,26]. 因此, 非常有必要發(fā)展新型的具有較高的抗光漂白特性、低的光毒性、較好的生物靶向性和低的飽和擦除光功率, 可用于活細胞長時間成像的STED 探針.

    線粒體通常被稱為細胞的“動力工廠”, 是真核細胞最重要的細胞器之一. 線粒體最重要的作用是產(chǎn)生細胞中腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine triphosphate, ATP), 為生物體提供能量, 是細胞進行有氧呼吸的主要場所. 線粒體具有典型的結(jié)構(gòu)特征[27], 一般呈短棒狀或圓球狀, 在某些生物種類和生理狀態(tài)下, 還可呈環(huán)狀、線狀、啞鈴狀、分杈狀、扁盤狀或其他形狀. 成型蛋白介導(dǎo)線粒體以不同方式與周圍的細胞骨架接觸或在線粒體的兩層膜間形成不同的連接, 可能是線粒體在不同細胞中呈現(xiàn)出不同形態(tài)的原因. 除了合成ATP 為細胞提供能量等主要功能外, 線粒體還承擔了許多其他生理功能[28], 比如調(diào)節(jié)膜電位并控制細胞程序性死亡. 線粒體膜通透性的增加會誘導(dǎo)凋亡因子等分子釋放進入細胞質(zhì)基質(zhì), 破壞細胞結(jié)構(gòu). 線粒體在生物體中起著如此重要的作用, 生物學(xué)家們采用了多種方法來研究線粒體的精細結(jié)構(gòu)和復(fù)雜的生物功能.

    線粒體是對各種損傷最為敏感的細胞器之一.在細胞損傷時最常見的病理改變可概括為線粒體數(shù)量、大小和結(jié)構(gòu)的改變, 可以通過觀察線粒體的外形變化來判斷細胞的健康狀態(tài). 多年來, 熒光顯微鏡是研究細胞動力學(xué)的有力工具, 已被用于對單個線粒體中特定蛋白的分析[29]. 但是線粒體的內(nèi)膜尺寸小于光學(xué)衍射極限, 傳統(tǒng)的熒光顯微鏡無法觀察線粒體內(nèi)膜的微結(jié)構(gòu)以及一些相關(guān)的動態(tài)變化過程. 超分辨成像技術(shù)的出現(xiàn), 為線粒體精細結(jié)構(gòu)和功能的研究提供了非常好的工具[30].

    本文找到了一種新型的可用于線粒體STED成像的有機探針. 該探針對線粒體的靶向性好, 具有較好的抗光漂白特性和較低的擦除光飽和強度,可用于活細胞長時間STED 超分辨成像. 在實驗中, 對線粒體成像的最高分辨率可達62 nm. 該探針與STED 超分辨成像結(jié)合, 為活細胞線粒體精細結(jié)構(gòu)和功能研究提供了新的手段.

    2 基本原理

    2.1 STED 顯微鏡的原理

    1873 年德國物理學(xué)家Ernst Abbe 提出衍射極限的概念. 他指出, 由于光的衍射效應(yīng), 光學(xué)顯微鏡的遠場分辨率不可能高于半波長, 衍射極限公式為λ為激發(fā)光波長,NA為物鏡的數(shù)值孔徑. 在很長一段時間里, 光學(xué)顯微鏡的最高分辨率被認為是無法突破衍射極限. 直到1994 年德國科學(xué)家Stefan W. Hell 基于受激輻射理論提出STED 超分辨成像方法, 其基本原理是, 首先使用一束光激發(fā)樣品,然后使用另一束波長紅移的環(huán)形光, 將激發(fā)光光斑周圍的熒光損耗掉, 從而縮小激發(fā)光光斑, 以達到壓縮有效點擴展函數(shù)的目的, 從而提高成像分辨率, 如圖1 所示.

    圖1 STED 原理示意圖 (a)受激輻射損耗能級圖;(b)STED 光斑示意圖Fig. 1. Schematic diagram of STED: (a) Diagram of energy level for stimulated emission depletion; (b) schematic diagram of STED light spot.

    而且Hell[31]還通過總結(jié)大量的實驗結(jié)果, 推導(dǎo)出了STED 顯微鏡的橫向空間分辨率公式:

    式中λ為激發(fā)波長,NA為物鏡的數(shù)值孔徑,ISTED為STED 光強度,Isat為飽和擦除光強度. 從(2)式可以看出, 橫向分辨率與飽和擦除光強度Isat有關(guān),Isat越低, 分辨率越高. 而飽和光強度Isat取決于材料本身的特性, 與熒光探針的受激輻射橫截面積σ以及熒光染料的熒光壽命τ有關(guān), 具體表達式為

    2.2 探針的機理分析

    探針的化學(xué)結(jié)構(gòu)和光譜表征結(jié)果如圖2 所示.從圖2 可見, 探針(命名為探針1)的激發(fā)峰值在578 nm 附近, 但是當探針1 和人血清蛋白(human serum albumin, HSA) 1∶1 混合后(命名探針2)吸收峰會藍移到561 nm 附近(圖2(b)所示). 圖2(c)為兩種探針的發(fā)射譜圖, 可以看到兩個探針的發(fā)射峰值都在683 nm 附近, 探針2 的發(fā)射譜完全覆蓋探針1 的發(fā)射譜, 且其信號強度約為探針1 的10 倍. 由于兩個探針的發(fā)射峰值都在683 nm 附近, 而探針2 的吸收峰發(fā)生了藍移, 因此探針的斯托克斯紅移由原來的105 nm 擴大到122 nm(如圖2(d)所示). 通過加入HSA 使激發(fā)藍移, 增大了激發(fā)和發(fā)射峰之間的紅移, 斯托克斯紅移較大的染料可以避免STED 光束對樣品的二次激發(fā), 在STED 成像中具有很大的優(yōu)勢.

    HSA 是血液中最豐富的巰基化合物蛋白質(zhì),具有多種重要的生物學(xué)功能, 例如促進藥物、脂肪酸和代謝物的運輸, 同時在維持血液的滲透壓中具有重要作用, 因此將HAS 與熒光染料結(jié)合, 有著重要的研究意義[32?35]. 已有報道表明小分子熒光探針與HSA 結(jié)合, 可以形成HSA-dye 納米小顆粒[33],而且發(fā)現(xiàn)這些探針有助于提高信噪比, 主要是由于熒光探針與HSA 結(jié)合在生理條件和活細胞中會表現(xiàn)出對細胞器更高的選擇性和靈敏度, 從而表現(xiàn)出熒光信號的增強, 同時具有較高的熱穩(wěn)定性和生物相容性[34?35], 該結(jié)論為探針2 的高性能表現(xiàn)在原理上提供了有力支撐.

    圖2 目標探針的化學(xué)結(jié)構(gòu)和光譜表征 (a)探針1 的化學(xué)結(jié)構(gòu); (b)探針1(藍色)和2(紅色)的激發(fā)譜; (c)探針1 (藍色)和2 (紅色)的發(fā)射譜; (d)探針1 的激發(fā)譜(藍色)和2 的發(fā)射譜(紅色)對比Fig. 2. Chemical structure and spectra characterization of target probe: (a) Chemical structure of probe 1; (b) excitation spectra of probe1 (blue)and 2 (red); (c) emission spectra of probe1 (blue) and 2 (red); (d) excitation spectrum of probe 1 (blue) and emission spectrum of probe 2 (red).

    3 實驗結(jié)果與討論

    3.1 共聚焦成像

    本文制備的新型探針用于標記活細胞, 所使用的細胞均為HeLa 細胞. 染色方法為: 將狀態(tài)較好的HeLa 細胞在培養(yǎng)箱(37 ℃, 5%CO2)中接種在30 mm 的共聚焦皿中, 探針1 與探針2 分別與活細胞在培養(yǎng)箱中共孵育15 min, 孵育好后在室溫下用緩沖劑PBS 沖洗3 遍, 繼而使用商用共聚焦顯微鏡(A1 R MP+, Nikon, Japan)記錄圖像, 結(jié)果如圖3 所示. 相對于探針1 的共聚焦圖像, 加了HSA 的混合液探針2 的共聚焦圖像的熒光信號更強, 且定位更準確, 背景更加干凈.

    從圖3 可以看出, 探針的兩種形式都可以對線粒體進行標記, 但是相比較而言, 探針2 的定位效果更好, 圖像的信噪比更高, 這與圖2(c)的光譜結(jié)果一致, 因此選用探針2 對線粒體進行成像. 在此基礎(chǔ)上, 對標記的條件進行了多項優(yōu)化, 例如孵育時間和探針濃度等. 經(jīng)過多次反復(fù)測試發(fā)現(xiàn), 當孵育時間為15 min 時, 已有充足的探針分子進入細胞, 且具有良好的染色效果. 此外多次濃度測試結(jié)果表明, 在1 ml 培養(yǎng)基中, 使用1 μl 染料(染料原始濃度為0.2 mM)熒光圖像效果最好, 即探針的最佳濃度為0.2 μM.

    圖3 用探針1 和探針2 標記的HeLa 細胞的共聚焦顯微熒光圖像, 比例尺為10 μm (a)探針1 的熒光成像; (b)探針2 的熒光成像Fig. 3. Confocal images of HeLa cells labeled with probe 1 and probe 2. Scale bar is 10 μm: (a) Confocal image of HeLa cells labeled with probe 1; (b) confocal image of HeLa cells labeled with probe2.

    為了研究探針2 的定位效果, 使用商用的線粒體探針Mito Tracker Green FM(M7514, Thermo Fisher; 激發(fā)波長490 nm, 發(fā)射波長516 nm)和探針2 進行共定位實驗. 把探針2 和Mito Tracker Green FM 同時放置在已接種好HeLa 細胞的共聚焦皿內(nèi), 置于細胞培養(yǎng)箱孵育15 min 后, 在室溫條件下用PBS 進行洗滌, 可以減少背景干擾. 然后在商用的共聚焦顯微鏡下進行觀察, 分別用488 nm的光激發(fā)Mito Tracker Green FM 和561 nm 的光激發(fā)探針2, 結(jié)果如圖4 所示. 從圖4(a)可以看到, 雖然商用的探針Mito Tracker Green FM 能夠有效地標記線粒體, 但是線粒體周圍還有較強的背景信號, 圖像的信噪比較差. 圖4(b)為探針2 標記線粒體的圖像, 從圖像上可以看到探針2 不僅能有效地標記上線粒體而且線粒體周圍幾乎沒有背景信號, 這說明圖像的信噪比要好于商用染料. 為了進一步研究探針2 的定位效果, 將探針2 與商用探針進行共定位對比, 圖4(c)所示為兩種染料共定位重疊后的圖(綠色和紅色疊加后呈黃色), 黃色區(qū)域越多說明探針2 的定位效果越接近商用染料, 此處用皮爾遜相關(guān)系數(shù) Rr來表示探針和示蹤劑的重合度, Rr值越大熒光共定位效果越好, 計算得到皮爾遜相關(guān)系數(shù) Rr=0.769 , 該數(shù)值表明探針2 在線粒體的定位效果良好, 幾乎與示蹤劑Mito Tracker Green 重合. 而且在圖4(c)中還可以看到圖片的背景略顯綠色, 這主要是商用染料背景信號較強造成的, 進一步說明探針2 不僅有接近商用染料的線粒體靶向性, 而且具有優(yōu)于商用染料的信噪比.

    3.2 STED 成像

    首先需要確定探針2 的損耗光(STED 光)波長(本文使用的STED 系統(tǒng)中, STED 光可選擇的波長有592, 660 和775 nm). 根據(jù)STED 的原理,STED 光的波長應(yīng)盡量避開激發(fā)譜[36], 避免STED 光激發(fā)熒光. 參考圖2 的結(jié)果, 探針2 的激發(fā) 峰 在561 nm 處, 發(fā) 射 峰 在683 nm 附 近.592 nm 與激發(fā)峰太近, 因此, STED 光可選的波長為660 和775 nm. 分別用1 μW 561 nm 的激發(fā)光, 20 mW 660 nm 的STED 光和20 mW 775 nm的STED 光激發(fā)樣品, 結(jié)果如圖5 所示, 從圖5(a)可以看到, 當用561 nm 波長的激光激發(fā)樣品時,熒光信號較強; 圖5(b)是用660 nm 的光照射樣品得到的結(jié)果, 熒光信號也比較強, 用其作為STED 光會對樣品二次激發(fā), 嚴重影響超分辨成像的質(zhì)量, 因此660 nm 的光不宜作為探針2 的損耗光; 由圖5(c)可以看出, 用775 nm 的光照射樣品,幾乎沒有發(fā)射熒光, 也就是說, 775 nm 的光不會造成二次激發(fā), 可以作為探針2 的損耗光.

    圖4 用Mito Tracker Green FM 和 探 針2 共 處 理 的HeLa 細 胞 的 共 定 位 圖 像,比 例 尺 為10 μm (a) Mito Tracker Green FM 標記的 細胞 圖像; (b)探 針2 標記 的細胞圖像; (c)圖(a)和圖(b)兩者的重合Fig. 4. Co-localization images of Hela cells treated with Mito Tracker Green FM and Probe 2. Scale bar is 10 μm:(a) Image of Mito Tracker Green FM; (b) image of probe 2;(c) overlay of image (a) and (b).

    圖5 三種不同波長的光單獨照射樣品時的細胞圖像 (a) 561 nm 的光照射; (b) 660 nm 的光照射; (c) 775 nm 的光照射Fig. 5. Cell images illuminated by light of different wavelengths: (a) Illuminated by light of 561 nm; (b) illuminated by light of 660 nm; (c) illuminated by light of 775 nm.

    接下來, 對探針2 進行STED 成像研究. 本實驗所有的STED 超分辨實驗均在商用的STED顯微鏡(Leica SP8, Leica, Germany)上完成, 該系統(tǒng)使用了80 MHz 且脈沖頻率可調(diào)的超連續(xù)譜激光作為激發(fā)光. 根據(jù)探針的激發(fā)和發(fā)射譜(如圖2所示), 以及圖5 的結(jié)果, 探針2 的激發(fā)波長為561 nm, 選用波長為775 nm 的脈沖光作為STED光. 實驗中選用100 × /NA 1.4 的STED 專用物鏡 (HCX PL APO CS2 100× 1.40 oil, Leica Microsystems)進行成像, 探測器的光譜接收范圍為650—750 nm.

    將HeLa 細胞與探針2 孵育后進行STED 成像, 用功率為1 μW 的561 nm 激光激發(fā)樣品, 用不同功率的775 nm 的STED 光作為損耗光, 成像結(jié)果如圖6 所示. 結(jié)果表明, 當損耗光功率為19.75 mW 時, 圖像的分辨率可以達到90 nm(如圖6(b)和圖6(e)所示). 與共聚焦圖像(圖6(a)和圖6(d)所示)相比, 原本不能區(qū)分的線粒體內(nèi)膜可以區(qū)分開來, 并且可以看到線粒體內(nèi)部脊的細微結(jié)構(gòu). 進一步將損耗光功率增加到39.5 mW, 可以更清楚地觀察到線粒體內(nèi)部脊的結(jié)構(gòu)(圖6(c)和圖6(f)所示), 最高分辨率可達62 nm.

    在進一步的實驗中, 評估了探針在STED 成像中的性能. 測量了探針2 在不同功率下的發(fā)射強度, 研究了發(fā)射損耗效率, 如圖7(a)所示, 探針的發(fā)射強度隨著損耗光強度的增強而迅速降低. 當功率為10 mW 時, 探針的受激輻射損耗比接近85%,而后熒光強度減弱速度明顯變得緩慢; 當功率為30 mW 時, 達到95%的損耗效率, 高效的發(fā)射損耗比對提高探針的STED 納米成像的橫向分辨率非常有利, 至此功率的進一步增加并沒有進一步提高損耗比. 為了研究探針2 在775 nm STED 光下的飽和受激輻射功率, 測量了不同功率下775 nm STED 光獲得的橫向分辨率, 結(jié)果如圖7(b)所示.根據(jù)(2)式可以擬合計算得出, 探針2 在775 nm STED 光下的飽和功率為 Psat=3.5 mW (功率密度為1.1 MW·cm–2, 損耗光束的環(huán)形光斑區(qū)域面積3.18 × 10–9cm2).

    3.3 抗光漂白測試

    圖6 用探針2 標記HeLa 的共聚焦和STED 圖像, 比例尺為500 nm (a)共聚焦圖像; (b)損耗光功率為19.75 mW 時線粒體的STED 圖像; (c)損耗光功率為39.5 mW 時的線粒體STED 圖像; (d)?(f)分別為圖(a)?(c)中劃線部分對應(yīng)的信號曲線和分辨率Fig. 6. Confocal and STED images of HeLa cells labeled with probe 2. Scale bar is 500 nm: (a) Confocal image; (b) STED image of mitochondria obtained with 19.75 mW STED light; (c) STED image of mitochondria obtained with 39.5 mW STED light; (d)?(f)normalized signal intensity profiles along the lines in (a)?(c) respectively as well as the spatial resolutions.

    圖7 STED 光功率對成像能力的影響 (a)探針2 的受激輻射損耗效率; (b)增加損耗功率情況下獲得的STED 圖像的分辨率Fig. 7. Effect of STED power on imaging performance: (a) Stimulated emission depletion efficiency of Probe 2; (b) resolution of STED images obtained at increased depletion power.

    STED 成像對熒光探針的選擇比共聚焦等其他成像技術(shù)有更高的要求, 抗光漂白特性是最重要的參考因素之一. 使用功率為19.75 mW 的STED光對染色處理好的樣品進行多次掃描, 測試探針的抗光漂白特性, 結(jié)果如圖8 所示. 圖8 中的內(nèi)插圖給出了在第一次掃描后的熒光圖像, 此時的熒光信號較強. 經(jīng)過180 次掃描后, 依然可以清楚地看到完整的細胞形態(tài). 經(jīng)過長達360 次掃描后, 雖然細胞結(jié)構(gòu)開始變得模糊, 但仍然可以看到細胞的熒光信號, 其信號強度相對第一次和180 次掃描后有明顯減弱. 結(jié)果表明, 所制備的新型探針具有良好的抗光漂白特性, 適用于長時間STED 成像.

    圖8 探針的抗光漂白測試結(jié)果. 內(nèi)插圖分別為對單個細胞第1 次掃描、第180 次掃描和第360 次掃描后得到的圖像, 比例尺為10 μmFig. 8. Results of bleaching test. Inset pictures are the images of single cell obtained after the first scan, 180 th scan,and 360 th scan. Scale bar is 10 μm.

    4 結(jié) 論

    本文找到了一種新型的可用于活細胞線粒體STED 成像的有機染料. 通過與商用的線粒體示蹤劑對比研究發(fā)現(xiàn), 該染料具有很好的線粒體定位效果. 利用該探針進行STED 超分辨成像, 發(fā)現(xiàn)其具有較低的飽和擦除光功率以及較好的抗光漂白特性, 最高可實現(xiàn)62 nm 的空間分辨率. 該探針非常適合于STED 超分辨成像, 為線粒體結(jié)構(gòu)與功能的研究提供了有力工具, 在對線粒體相關(guān)疾病的研究中具有重要的意義和廣闊的應(yīng)用前景.

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