小鼠黑色素瘤胰腺轉(zhuǎn)移模型的建立及針對(duì)腫瘤的控制性實(shí)驗(yàn)

胡國(guó)章，顏游游,李金梁，宣 巍

(吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 1.急救醫(yī)學(xué)科；2.心血管內(nèi)科；3.急診與重癥醫(yī)學(xué)科；4.肝膽胰外科，吉林 長(zhǎng)春130033)

黑色素瘤是一種能產(chǎn)生黑色素的高度惡性腫瘤，占皮膚腫瘤死亡病例的絕大部分，多發(fā)生于皮膚或接近皮膚的粘膜，也見(jiàn)于軟腦膜和脈絡(luò)膜。該病以白種人的發(fā)病率最高，中國(guó)雖然不屬于高發(fā)地區(qū)，但是在進(jìn)入21世紀(jì)后呈現(xiàn)逐年上升的趨勢(shì)。手術(shù)切除是其首選治療方法，盡管術(shù)后輔以放療等輔助治療，但其遠(yuǎn)期效果欠佳。采用免疫療法等新的治療方法來(lái)處理黑色素瘤已經(jīng)成為一種必要的選擇。本實(shí)驗(yàn)使用mHSP65與B16黑色素瘤組織的裂解物(B16 melanoma tissue lysates，BTL)制備的mHSP65-BTL作為候選疫苗聯(lián)合環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide，CY)用于小鼠黑色素瘤胰腺轉(zhuǎn)移癌模型，觀察小鼠的生存期，確認(rèn)其能否產(chǎn)生抗腫瘤免疫反應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1生物材料 C57BL/6小鼠42只，雌性，6-8周齡，18-22 g，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司；C57BL/6小鼠來(lái)源的B16黑色素瘤細(xì)胞株來(lái)自于吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院分子生物教研室；結(jié)核分枝桿菌來(lái)源的熱休克蛋白65(mHSP65)由吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院分子生物教研室保存。

1.1.2實(shí)驗(yàn)試劑 RPIM 1640干粉、標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清(FBS)和胰蛋白酶購(gòu)自Gibco公司；臺(tái)盼藍(lán)粉末購(gòu)自中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司；牛血清白蛋白(BSA)購(gòu)自北京鼎國(guó)；青霉素(哈藥集團(tuán))，強(qiáng)力碘(廣東恒健公司)，水合氯醛(青島宇龍海藻有限公司)，注射用環(huán)磷酰胺(江蘇恒瑞醫(yī)藥)；實(shí)驗(yàn)所用的其它常規(guī)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.1.3實(shí)驗(yàn)器材 100 ml細(xì)胞培養(yǎng)瓶(Co Star公司)、平皿、毛玻璃片、300目濾網(wǎng)、組織研磨器、1ml注射器、眼科剪、小鑷子、文氏鉗、持針器、手術(shù)縫合慕絲線、細(xì)胞計(jì)數(shù)板。電泳儀(美國(guó)BIORAD公司)、CO2細(xì)胞培養(yǎng)孵箱(日本SANYO公司)、細(xì)胞培養(yǎng)倒置顯微鏡(日本Olympus公司)、離心機(jī)(德國(guó)Biofuge Fresco)。

1.2 方法

1.2.1B16細(xì)胞培養(yǎng) B16細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%的胎牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)液中，置于5%CO2、37℃孵箱中培養(yǎng)，隔天換液，長(zhǎng)滿傳代。待其生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí)用0.25%胰酶消化，用無(wú)血清RPIM1640培養(yǎng)液制備細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度至2×104個(gè)/ml備用。

1.2.2mHSP65-BTL的制備及鑒定 ①mHSP65-BTL的制備：將B16細(xì)胞接種于健康小鼠的四肢皮下，待小鼠四肢膨隆后取出小鼠的黑色素瘤，將腫瘤組織在組織研磨器中反復(fù)研磨后制成組織懸液，置于液氮和37℃水浴箱反復(fù)凍融5次，2000 rpm 離心10 min，去除沉淀并經(jīng)濾網(wǎng)過(guò)濾后制成BTL。將BTL與mHSP65按20 μg mHSP65+1 mg BTL/ml混合配制即為mHSP65-BTL。②mHSP65-BTL的鑒定:制備后的BTL及mHSP65-BTL用Lowry法檢測(cè)其中的蛋白含量，并用SDS-PAGE進(jìn)行鑒定。放于-70度冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3小鼠B16黑色素瘤胰腺轉(zhuǎn)移模型的建立 小鼠術(shù)前不禁食水，于手術(shù)當(dāng)日早晨8時(shí)分別稱取體質(zhì)量并記錄，取10%水合氯醛按0.006 ml/g體重計(jì)算藥量，給予腹腔注射麻醉。固定小鼠，取仰臥位，以碘伏于左季肋區(qū)及左腹部消毒；于左肋弓下尋找脾切跡(皮膚表面略呈藍(lán)紫色)，循該切跡旁線行縱行切口約1.5 cm，分層切開皮膚、腹膜；循斜行的脾臟找到脾臟的尾端，輕柔鑷夾將其牽出體外并翻轉(zhuǎn)暴露胰腺體尾部；1 ml注射器吸取制備好的B16細(xì)胞懸液后于脾門較寬大處循胰腺走向穿刺入胰腺實(shí)質(zhì)，針尖略向上挑，緩慢推注細(xì)胞懸液，待出現(xiàn)白色小泡狀隆起后停止注射，每只小鼠注射總量為50 μl，含1×103個(gè)細(xì)胞，若1個(gè)穿刺點(diǎn)注射不足50 μl而已出現(xiàn)囊性小泡時(shí)可更換穿刺點(diǎn)多點(diǎn)注射；牽拉腹膜收回胰腺、脾臟；常規(guī)關(guān)腹，注意止血。創(chuàng)口周圍涂抹少量青霉素，見(jiàn)圖1。術(shù)后常規(guī)飼養(yǎng)。

圖1 小鼠B16黑色素瘤胰腺轉(zhuǎn)移模型建立的手術(shù)過(guò)程

1.2.4小鼠體內(nèi)腫瘤控制性實(shí)驗(yàn) 共40只小鼠完成B16黑色素瘤胰腺轉(zhuǎn)移癌模型。觀察4天無(wú)差別后將小鼠隨機(jī)分為4組(PBS，mHSP65-BTL，CY，CY+mHSP65-BTL)，10只/組。在接種腫瘤后第4，12天對(duì)PBS和mHSP65-BTL組小鼠給予腹腔注射100 μl PBS；CY和CY+mHSP65-BTL組100 μl CY，其中CY：(50 mg/kg)/只。第5，13天對(duì)PBS和mHSP65-BTL組的小鼠于下肢靠近淋巴結(jié)處注射PBS，mHSP65-BTL；對(duì)CY和CY+mHSP65-BTL組的小鼠于下肢靠近淋巴結(jié)處注射PBS，mHSP65-BTL，其中mHSP65-BTL用量：(2 μg mHSP65 +100 μg BTL)/只。觀察小鼠的生存期，繪制生存曲線。

1.2.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用單因素方差分析法來(lái)進(jìn)行分析。對(duì)于小鼠生存期，采用Kaplan-Meier法進(jìn)行比較。當(dāng)P<0.05時(shí)認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析處理。

2 結(jié)果

2.1 mHSP65-BTL的鑒定(圖2)

圖2 mHSP65-BTL的鑒定

2.2 小鼠B16黑色素瘤胰腺轉(zhuǎn)移模型建立后行腫瘤控制性實(shí)驗(yàn)的生存期(圖3)

圖3 mHSP65-BTL聯(lián)合CY作用于小鼠B16黑色素瘤胰腺轉(zhuǎn)移模型的生存曲線

腫瘤接種后觀察并記錄小鼠的生存期，在進(jìn)行了30天的監(jiān)測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)B16黑色素瘤的惡性度非常高，在接種腫瘤后第15天，mHSP65-BTL組就有小鼠發(fā)生死亡，所以就只能免疫兩次。mHSP65-BTL組和CY組小鼠的生存期與PBS組相比沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而mHSP65-BTL和CY聯(lián)用組小鼠的生存期顯著延長(zhǎng)，和PBS組相比有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.036)。

3 討論

在本實(shí)驗(yàn)中，我們使用了mHSP65與BTL制備的mHSP65-BTL作為候選疫苗免疫胰腺接種B16細(xì)胞的C57BL/6小鼠。為了提高疫苗的功效，我們?cè)诿庖咭呙缜肮?jié)律性應(yīng)用低劑量的CY。評(píng)估m(xù)HSP65-TTL是否可以延長(zhǎng)荷瘤小鼠的存活和低劑量CY是否可提高mHSP65-TTL的功效。結(jié)果表明，mHSP65-BTL聯(lián)合使用小劑量CY可以延長(zhǎng)荷有B16細(xì)胞小鼠的生存期。

黑色素瘤作為一種高度惡性的腫瘤，除了手術(shù)治療及放化療外，亟需發(fā)現(xiàn)并應(yīng)用一些新的治療方法。免疫療法可作為新的選擇之一。腫瘤免疫療法是基于抗腫瘤免疫系統(tǒng)的人工激活，其激活方式包括免疫接種和免疫調(diào)節(jié)等[1]。

鑒于用腫瘤裂解物(tumor lysate，TL)作為腫瘤相關(guān)抗原(tumor-associated antigen，TAA)的接種方法顧及T細(xì)胞對(duì)多種TAAs的敏感性及抗腫瘤應(yīng)答的持續(xù)性，它對(duì)產(chǎn)生治療性抗腫瘤應(yīng)答具有很大潛力[2]。其中，攜帶TL的熱休克蛋白(hot shock protein，HSP)是一種有前途的方法。因?yàn)镠SP可以攜帶肽段，激活特異性抗原提呈細(xì)胞，并且交叉提呈伴行肽段給MHC I類分子以產(chǎn)生特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)[3-6]。然而，這種在小鼠上接種HSP-肽段復(fù)合物的方法在臨床試驗(yàn)的轉(zhuǎn)換中并未獲得成功[7]。其中一部分原因可能是未能突破腫瘤介導(dǎo)的免疫抑制。免疫抑制在腫瘤進(jìn)展中至關(guān)重要，而調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)在抑制性環(huán)境中的作用是非常突出的，在許多腫瘤中均發(fā)現(xiàn)的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)量升高，它的出現(xiàn)預(yù)示著較低的生存幾率，故需要免疫調(diào)節(jié)來(lái)抑制其發(fā)展[8]。

最近臨床研究表明低劑量環(huán)磷酰胺可以誘導(dǎo)在主動(dòng)或被動(dòng)免疫療法環(huán)境中的良性免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)，抑制調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的生長(zhǎng)及功能[9]，誘導(dǎo)Th17細(xì)胞[10]。環(huán)磷酰胺可以選擇性誘導(dǎo)體內(nèi)或體外的FoxP3表達(dá)的T細(xì)胞死亡，因?yàn)镕oxP3是一種對(duì)低劑量環(huán)磷酰胺有更高的敏感性免疫抑制效應(yīng)相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子[11]。在小鼠模型中，可以識(shí)別表達(dá)在正常黑色素細(xì)胞及B16黑色素瘤的一種抗原的腫瘤特異性Th17極化細(xì)胞可以破壞已建立的黑色素瘤并提高生存率[12]。在黑色素瘤模型中，IL-17缺陷小鼠可以加速腫瘤進(jìn)程，NK細(xì)胞及腫瘤特異性T細(xì)胞減少導(dǎo)致的IFN-α釋放或肺轉(zhuǎn)移的出現(xiàn)[13]。因此，HSP-TL和節(jié)律性使用的環(huán)磷酰胺可能是抗黑色素瘤免疫療法的好策略，本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果也支持這一觀點(diǎn)。

在本實(shí)驗(yàn)中，我們將mHSP65-BTL聯(lián)合環(huán)磷酰胺用于小鼠黑色素瘤胰腺轉(zhuǎn)移癌模型中并產(chǎn)生了一定的抗腫瘤免疫反應(yīng)。這對(duì)于臨床工作極為重要，在不久的將來(lái)，我們可以通過(guò)外科手術(shù)將腫瘤予以切除，然后將切除的腫瘤制備成腫瘤組織裂解物，并輔以一定量的mHSP65成為腫瘤疫苗，術(shù)后配合環(huán)磷酰胺予以治療，這一免疫治療的組合有可能成為治愈黑色素瘤的新方法。