支氣管肺泡灌洗液中miR-17和VEGF表達(dá)與低出生體重兒支氣管肺發(fā)育不良的關(guān)系

張珍竹,李曉輝,張寶鳳,孫樹(shù)萍,許 海

(1.日照市中醫(yī)醫(yī)院 兒科,山東 日照276800;2.中醫(yī)藥大學(xué)黃家湖醫(yī)院 婦科,湖北430000)

支氣管肺發(fā)育不良(bronchopulmonary dysplasia，BPD)是接受機(jī)械通氣治療早產(chǎn)兒常見(jiàn)的慢性肺部疾病。近年來(lái)，隨著新生兒科的快速發(fā)展，低出生體重兒存活率越來(lái)越高，BPD發(fā)生率也漸漸升高。低出生體重兒BPD輔助用氧時(shí)間長(zhǎng)，病死率高，存活患兒易發(fā)生下呼吸道感染，若并發(fā)肺部感染，在短期內(nèi)即可導(dǎo)致肺功能失代償，嚴(yán)重影響患兒正常生長(zhǎng)發(fā)育。因此，臨床應(yīng)早期診斷BPD，以便及時(shí)采取干預(yù)措施，從而改善患兒生存質(zhì)量。微小RNA-17(microRNA-17，miR-17)在呼吸系統(tǒng)、心臟等發(fā)育過(guò)程中起重要作用。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是一種功能性糖蛋白，具有修復(fù)肺組織損傷和調(diào)節(jié)肺血管發(fā)育作用[1]。Huang等[2]研究報(bào)道，miR-17與非小細(xì)胞肺癌病情程度有關(guān)；常明等[3]研究發(fā)現(xiàn)，VEGF參與急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征新生兒病情進(jìn)展，而miR-17、VEGF與低出生體重兒BPD關(guān)系尚不十分清楚。且有研究報(bào)道[4]，VEGF 165通過(guò)抑制miR-17表達(dá)可提高內(nèi)皮祖細(xì)胞存活率。鑒于此，本研究通過(guò)測(cè)定支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)中miR-17、VEGF表達(dá)水平，分析其與低出生體重兒BPD關(guān)系。

1 資料和方法

1.1 一般資料

選取2016年1月-2019年7月醫(yī)院新生兒科收治的95例低出生體重兒作為受試對(duì)象，根據(jù)是否進(jìn)行機(jī)械通氣及機(jī)械通氣是否發(fā)生BPD將95例低出生體重兒分為對(duì)照組(單純低出生體重兒)30例、機(jī)械通氣非BPD組33例、機(jī)械通氣BPD組32例。對(duì)照組有男嬰17例，女?huà)?3例；機(jī)械通氣非BPD組有男嬰19例，女?huà)?4例；機(jī)械通氣BPD組有男嬰18例，女?huà)?4例。本研究符合醫(yī)院倫理委員會(huì)標(biāo)準(zhǔn)。入選標(biāo)準(zhǔn)：(1)BPD患兒符合美國(guó)多家國(guó)立衛(wèi)生研究機(jī)構(gòu)(NICHD/NHLBI/ORD)聯(lián)合BPD研究組2001年發(fā)布的BPD診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]；(2)臨床資料完整；(3)患兒家屬均知情同意；(4)配合研究。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)患兒未存活；(2)有先天性心臟病、胸腔積液等疾??；(3)中途轉(zhuǎn)院及影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果患兒。三組患兒性別組間比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2 方法

1.2.1BALF采集與處理 對(duì)照組未進(jìn)行機(jī)械通氣和吸氧治療，機(jī)械通氣非BPD組、機(jī)械通氣BPD組均給予機(jī)械通氣和吸氧治療。對(duì)照組于入院72 h內(nèi)采集BALF，機(jī)械通氣非BPD組、機(jī)械通氣BPD組于機(jī)械通氣前及機(jī)械通氣后24、48、72 h分別采集BALF。BALF采集方法：從受試患兒氣管插管中注入37℃生理鹽水，每次1 mL/kg左右，插入吸痰管后負(fù)壓吸引(<6 kPa)，轉(zhuǎn)動(dòng)吸痰管邊吸邊退，重復(fù)此操作3次，收集灌洗液，并1 000 r/min離心15 min，留取上清液保存于-80℃冰箱待測(cè)。

1.2.2miR-17水平測(cè)定 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)檢測(cè)BALF中miR-17水平，qRT-PCR購(gòu)自南京貝登醫(yī)療股份有限公司。按照miRcute miRNA提取分離試劑盒(購(gòu)自天根生化科技有限公司)操作步驟提取BALF中小RNA，并反轉(zhuǎn)錄得cDNA。miR-17擴(kuò)增以U6為內(nèi)參基因，擴(kuò)增引物序列詳見(jiàn)表1。設(shè)定反應(yīng)條件為：95℃，5 min變性；95℃，10 s；60℃，30 s；72℃，20 s；40個(gè)循環(huán)。每次反應(yīng)均設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，以保證結(jié)果準(zhǔn)確性，反應(yīng)完成后用2-ΔΔCt計(jì)算BALF中miR-17相對(duì)表達(dá)量。

表1 擴(kuò)增引物序列

1.2.3VEGF水平測(cè)定 采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)檢測(cè)BALF中VEGF水平，具體操作步驟按照人VEGF試劑盒(購(gòu)自上海廣銳生物科技有限公司)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.4BPD臨床分度標(biāo)準(zhǔn)[6]根據(jù)胎齡<32周(校正胎齡36周)或胎齡≥32周出院時(shí)是否用氧分為：(1)輕度BPD：不需吸氧；(2)中度BPD：需吸氧，氧濃度<30%；(3)重度BPD：需吸氧，氧濃度≥30%或持續(xù)氣道正壓通氣、機(jī)械通氣。機(jī)械通氣BPD組患兒輕度BPD 10例，胎齡(31.05±3.11)周，出生體重(1623.59±291.60)g；中度BPD 12例，胎齡(30.98±3.07)周，出生體重(1587.03±282.14)g；重度BPD 10例，胎齡(30.22±3.25)周，出生體重(1491.28±266.75)g；三組患兒胎齡、出生體重差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。均于機(jī)械通氣72 h后檢測(cè)BALF中miR-17、VEGF水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 18.0處理三組患兒數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)資料用%描述，行檢驗(yàn)；計(jì)量資料用描述，兩組比較行t檢驗(yàn)，三組比較行單因素方差分析；利用Pearson分析機(jī)械通氣BPD組患兒BALF中miR-17、VEGF水平相關(guān)性；P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組患兒一般資料比較

三組患兒胎齡、出生體重差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；對(duì)照組胎齡最長(zhǎng)、出生體重最重，其次為機(jī)械通氣非BPD組患兒，機(jī)械通氣BPD組患兒胎齡最短、出生體重最輕，組間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；機(jī)械通氣BPD組患兒機(jī)械通氣時(shí)間、吸氧時(shí)間均顯著長(zhǎng)于機(jī)械通氣非BPD組患兒(P<0.05),見(jiàn)表2。

表2 三組患兒一般資料比較

2.2 三組患兒BALF中miR-17、VEGF水平比較

三組患兒BALF中miR-17、VEGF水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；機(jī)械通氣BPD組、機(jī)械通氣非BPD組患兒BALF中miR-17水平顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，機(jī)械通氣BPD組患兒BALF中miR-17水平明顯低于機(jī)械通氣非BPD組患兒(P<0.05)；機(jī)械通氣BPD組、機(jī)械通氣非BPD組患兒BALF中VEGF水平明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，機(jī)械通氣BPD組患兒BALF中VEGF水平顯著高于機(jī)械通氣非BPD組(P<0.05)，見(jiàn)表3。

表3 三組患兒BALF中miR-17、VEGF水平比較

2.3 機(jī)械通氣患兒不同通氣時(shí)段BALF中miR-17、VEGF水平變化

隨著機(jī)械通氣時(shí)間延長(zhǎng)，機(jī)械通氣非BPD組、機(jī)械通氣BPD組患兒BALF中miR-17水平逐漸降低、VEGF水平逐漸提高，且同組不同通氣時(shí)段兩兩比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；不同通氣時(shí)段機(jī)械通氣BPD組患兒BALF中miR-17水平明顯低于機(jī)械通氣非BPD組患兒(P<0.05)，VEGF水平顯著高于機(jī)械通氣非BPD組患兒(P<0.05)，見(jiàn)表4。

表4 機(jī)械通氣患兒不同通氣時(shí)段BALF中miR-17、VEGF水平變化

2.4 機(jī)械通氣BPD組患兒不同程度BALF中miR-17、VEGF水平比較

機(jī)械通氣BPD組患兒不同程度BALF中miR-17、VEGF水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；重度、中度BPD患兒BALF中miR-17水平顯著低于輕度BPD患兒(P<0.05)、VEGF水平明顯高于輕度BPD患兒(P<0.05)，重度BPD患兒BALF中miR-17水平明顯低于中度BPD患兒、VEGF水平顯著高于中度BPD患兒(P<0.05)，見(jiàn)表5。

表5 機(jī)械通氣BPD組患兒不同程度BALF中miR-17、VEGF水平比較

2.5 機(jī)械通氣BPD組患兒BALF中miR-17、VEGF水平相關(guān)性

機(jī)械通氣BPD組患兒BALF中miR-17水平與VEGF水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.699，P<0.05)，見(jiàn)圖1。

圖1 機(jī)械通氣BPD組患兒BALF中miR-17、VEGF水平相關(guān)性

3 討論

BPD發(fā)生發(fā)展與早產(chǎn)、長(zhǎng)時(shí)間機(jī)械通氣及感染等有關(guān)，其病死率和再住院率均較高，目前尚缺乏有效預(yù)防和干預(yù)措施。由于BPD發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，臨床應(yīng)繼續(xù)尋找與BPD病因相關(guān)指標(biāo)，以達(dá)到對(duì)BPD早期預(yù)防和干預(yù)治療。BALF是利用肺泡表面有效液體檢測(cè)細(xì)胞成分的有效方法，有利于肺部疾病的鑒別診斷。已有研究證實(shí)[7,8]，miRNA、VEGF與BPD發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切，因此深入研究BALF中miR-17、VEGF水平及二者在BPD中作用對(duì)該病的早期干預(yù)有重要意義。

miR-17-92簇是一類具有代表性的miRNA家族，位于人染色體13q31.3，參與多種疾病發(fā)展進(jìn)程。miR-17-92簇是一種高度保守且含有多順?lè)醋訂?dòng)子的典型基因簇，可產(chǎn)生6個(gè)成熟的miRNA，均參與血管生成及免疫系統(tǒng)發(fā)育等過(guò)程[9]。miR-17是miR-17-92簇中重要成員，具有miR-17-92簇作用，其水平變化與肺動(dòng)脈高壓患者病情嚴(yán)重程度有關(guān)[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，三組患兒BALF中miR-17水平高低依次為：對(duì)照組、機(jī)械通氣非BPD組患兒、機(jī)械通氣BPD組患兒，提示低出生體重兒BALF中miR-17水平降低可能與長(zhǎng)時(shí)間機(jī)械通氣及BPD發(fā)生有關(guān)。機(jī)械通氣時(shí)間越長(zhǎng)，患兒BALF中miR-17水平越低，且不同通氣時(shí)段機(jī)械通氣BPD組患兒BALF中miR-17水平明顯低于機(jī)械通氣非BPD組，提示BPD低出生體重兒隨機(jī)械通氣時(shí)間延長(zhǎng)，肺損傷逐漸加重，動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)機(jī)械通氣低出生體重兒BALF中miR-17水平變化，有利于早期診斷BPD。此外，本研究中重度BPD患兒BALF中miR-17水平最低、其次為中度BPD患兒、輕度BPD患兒BALF中miR-17水平最高，提示BPD程度越嚴(yán)重，BALF中miR-17水平越低，可能與機(jī)械通氣時(shí)間長(zhǎng)有關(guān)。

VEGF定位于人染色體6p21.3，由7個(gè)內(nèi)含子和8個(gè)外顯子組成，是Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞分泌的一種有絲分裂原，在肺泡發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用[11]。VEGF又稱為血管通透性因子，可明顯促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂增生，并可增加血管通透性[12]。在缺氧條件下，機(jī)體VEGF含量明顯上升，并可通過(guò)誘導(dǎo)VEGF轉(zhuǎn)錄，間接提高VEGF生理活性[13]。常麗等[14]研究發(fā)現(xiàn)，閉塞性細(xì)支氣管炎患兒血清VEGF水平明顯高于對(duì)照組患兒，并與患兒病程有關(guān)。曹悅鞍等[15]研究報(bào)道，阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征患者血清VEGF水平顯著高于對(duì)照組，血清VEGF水平升高可能是影響患者夜間血壓上升的獨(dú)立危險(xiǎn)因子。Robak等[16]研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者血清VEGF水平顯著高于健康對(duì)照者。本研究中機(jī)械通氣BPD組患兒VEGF水平最高、其次為機(jī)械通氣非BPD組患兒、對(duì)照組VEGF水平最低，與常麗等[14]、曹悅鞍等[15]、Robak等[16]研究相似，提示VEGF可能參與低出生體重兒BPD發(fā)生。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，機(jī)械通氣72 h VEGF水平最高、其次為機(jī)械通氣48 h、機(jī)械通氣24 h VEGF水平最低，提示機(jī)械通氣時(shí)間長(zhǎng)短可能與VEGF水平變化有關(guān)；且不同通氣時(shí)段機(jī)械通氣BPD組患兒VEGF水平均遠(yuǎn)高于機(jī)械通氣非BPD組，提示機(jī)械通氣時(shí)間及VEGF水平可能與BPD病情進(jìn)展有關(guān)。本研究還發(fā)現(xiàn)，VEGF水平高低依次為重度BPD、中度BPD、輕度BPD，提示VEGF水平可能與低出生體重兒BPD程度有關(guān)。此外，Chamorrojorganes等[17]報(bào)道m(xù)iR-17-92簇可通過(guò)抑制ERK/ELK1，增強(qiáng)VEGF信號(hào)通路作用，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞血管生成，提示miR-17-92與VEGF可能相互作用參與疾病發(fā)展。本研究相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，機(jī)械通氣BPD組患兒BALF中miR-17、VEGF水平呈負(fù)相關(guān)，提示miR-17、VEGF可能共同參與低出生體重兒BPD發(fā)展。

綜上所述，BPD低出生體重兒BALF中miR-17水平降低、VEGF水平升高，二者可能共同參與BPD發(fā)生、發(fā)展，動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)BALF中miR-17、VEGF水平，對(duì)準(zhǔn)確判斷低出生體重兒BPD程度具有參考意義。本研究?jī)H短期內(nèi)觀察BALF中miR-17、VEGF水平變化，接下來(lái)應(yīng)加大樣本觀察BPD患兒住院期間及出院后BALF中miR-17、VEGF水平，以期為預(yù)后提供依據(jù)。