豬胰臟中胰脂肪酶的提取及其穩(wěn)定性研究

龍嬌妍，王娟，岳曉禹

（河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，河南鄭州450046）

胰脂肪酶的應(yīng)用范圍比較寬泛，如食品、化妝品、皮革、醫(yī)藥、洗滌劑等相關(guān)領(lǐng)域，尤其在油脂化工及有機(jī)合成工業(yè)中。胰酶包括胰蛋白酶、胰脂肪酶和胰淀粉酶[1]，而動物胰腺中胰淀粉酶、胰脂肪酶、核糖核酸酶為活性酶[2]。目前國內(nèi)外制得的脂肪酶主要來自于微生物，很少以動物為原材料生產(chǎn)脂肪酶[3]。

胰脂肪酶可以將骨粉中殘留的脂質(zhì)水解為脂肪酸，從而有利于人體對骨鈣的吸收[4]。醫(yī)用胰酶制劑能夠很好地與胃酸結(jié)合并提高其酶活力，改善其消化功能，有助于用來治療消化性潰瘍和小兒腹瀉[5]。

國內(nèi)外把胰脂肪酶作為單獨研究對象的文獻(xiàn)屈指可數(shù)，大多數(shù)是對胰蛋白酶的研究，或是同時研究3種酶的制備工藝，制備的是含有胰蛋白酶、胰脂肪酶和胰淀粉酶的混合物[6]。目前胰酶的提取方法有很多種，例如有機(jī)溶劑（丙酮、乙醇、異丙醇等）提取法、鹽溶液提取法、水洗提取法等，其中有機(jī)溶劑提取法，需要使用大量的有機(jī)溶劑，不僅會增加生產(chǎn)成本，而且會造成嚴(yán)重污染環(huán)境，甚至?xí)嬖诒ê鸵l(fā)火災(zāi)等安全隱患[7]。相對有機(jī)溶劑提取法而言，殼聚糖絮凝沉淀法[8-9]具有用量少、無毒無害、使用安全、對環(huán)境無污染等優(yōu)點，但是使用此種方法制備的胰酶酶活力比較低。

萬峰[3]、吳曉英[10]、魏文毅等[11]使用有機(jī)溶液進(jìn)行提取，余武英等[12]用聚乙二醇沉淀豬胰蛋白酶，唐愛星[8]、張廷紅等[9]用殼聚糖絮凝法獲得產(chǎn)品酶、許浩鴻等[13]通過胰臟自溶水提取制備胰酶、郭兆斌等[14]通過單因素試驗和正交試驗得出胰酶制備的最佳工藝條件。

液體酶制劑穩(wěn)定性比較差，很多研究者對液體酶穩(wěn)定性進(jìn)行探究，如蔣安生[15]、曹磊等[16]均對液體酶的保存進(jìn)行研究，在液體酶中加入穩(wěn)定劑可以提高其保存穩(wěn)定性。白凈等[17]論述了酶制劑濃縮方法的研究進(jìn)展。

本研究以冷凍豬胰臟為原材料，通過單因素試驗與正交試驗得出胰脂肪酶最佳提取條件，同時用透析對其進(jìn)行濃縮，并探究復(fù)合穩(wěn)定劑以及保存溫度對液體酶穩(wěn)定性的影響。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 主要試劑

冷凍豬胰臟：河南省鄭州市雙匯食品有限公司。

橄欖油：羅恩試劑；聚乙烯醇（分析純）：天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；氫氧化鈉、磷酸氫二鈉、丙三醇、吐溫80、酚酞（分析純）：天津市永大化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

漢佳歐斯PY-790絞肉機(jī)、IKA T25高速分散均質(zhì)機(jī)、IS120-3C型pH計：上海儀邁儀器科技有限公司；DNP-9272電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司；H·S-420BS電熱恒溫水浴鍋：上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；SPX-250L-B-1生化培養(yǎng)箱：上海?，攲嶒炘O(shè)備有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗流程及操作要點

將解凍后的豬胰臟進(jìn)行前處理，除去結(jié)締組織與脂肪后用絞肉機(jī)將其絞碎制得胰漿，準(zhǔn)確稱量5 g或10 g后加入提取液進(jìn)行提取以及其他相關(guān)操作。胰脂肪酶提取工藝參考Hans Schultze[17]、吳曉英等[7]的方法，并做出一定的改變。

1.2.1.1 試驗流程

冷凍豬胰臟→解凍→去脂肪→制胰漿→稱量→提取→過濾→梯度稀釋→酶活測定

1.2.1.2 操作要點

1）提取：向稱量過的胰漿中加入提取劑（體積為胰漿的2倍），放在某一溫度下攪拌提取若干小時。

2）過濾：將提取后的胰脂肪酶酶液用雙層紗布進(jìn)行過濾。

3）稀釋：用蒸餾水作為稀釋液，稀釋時應(yīng)控制酶液的濃度，使樣品與空白間的堿量消耗之差控制在1 mL至2 mL范圍內(nèi)。

4）酶活測定：使用指示劑滴定法進(jìn)行測定，酶活測定中所使用的溶液按照GB/T 601-2016《化學(xué)試劑標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的制備》配制，底物溶液注意要現(xiàn)配現(xiàn)用。脂肪酶活力以脂肪酶活力單位表示，1 mL液體酶（或1 g固體酶粉），在一定溫度和pH值條件下，1 min水解底物產(chǎn)生1 mol的可滴定的脂肪酸，即為1個酶活力單位，以 U/mL（U/g）表示。

1.2.2 單因素試驗

1.2.2.1 提取劑的種類

將一定量冷凍豬胰臟絞碎成胰漿，準(zhǔn)確稱取3份10 g胰漿，分別以2倍體積加入蒸餾水、磷酸鹽緩沖溶液、0.15 mol/L氯化鈉溶液進(jìn)行提取，提取溫度為25℃，提取時間為2 h。將提取后的酶液用雙層紗布進(jìn)行過濾，吸取1 mL過濾后的酶液進(jìn)行稀釋，隨即進(jìn)行酶活力的測定。

1.2.2.2 提取時間

由前期試驗得出較優(yōu)提取劑為磷酸鹽緩沖溶液，因此確定磷酸鹽緩沖溶液作為提取劑，探究時間對提取過程中胰脂肪酶酶活力的影響。將提取時間定為1、2、3、4、5、6 h 6個梯度，提取溫度為室溫（25 ℃），進(jìn)行酶活力的測定。

1.2.2.3 提取溫度

以磷酸鹽緩沖溶液作為胰脂肪酶的提取劑，將提取溫度定為 4、15、25、35、45 ℃ 5 個梯度，提取時間為2 h，進(jìn)行酶活力的測定。

1.2.2.4 提取pH值

以磷酸鹽緩沖溶液作為胰脂肪酶的提取劑，將提取 pH 值定為 6.5、7.0、7.5、8.0、8.5 五個梯度，提取時間為2 h，進(jìn)行酶活力的測定。

1.2.2.5 復(fù)合穩(wěn)定劑

本試驗所使用的穩(wěn)定劑有阿拉伯樹膠、山梨醇、丙三醇、氯化鈉、可溶性淀粉、麥芽糖、吐溫80、葡萄糖酸鈣。將以上單個穩(wěn)定劑進(jìn)行組合，得到2個復(fù)合穩(wěn)定劑，分別為復(fù)合穩(wěn)定劑1與復(fù)合穩(wěn)定劑2，其中復(fù)合穩(wěn)定劑1為1.2%阿拉伯樹膠、1.2%山梨醇、1.0%丙三醇、1.2%氯化鈉，復(fù)合穩(wěn)定劑2為1.0%丙三醇、1.2%氯化鈉、2.2%葡萄糖酸鈣、1.2%麥芽糖、1.2%可溶性淀粉。當(dāng)液體酶的存放時間較長時，容易散發(fā)出異味，加入丙三醇可以在一定程度上減少這種現(xiàn)象的發(fā)生。將經(jīng)過磷酸鹽緩沖溶液提取后的胰脂肪酶酶液分成兩等份，取一份加入復(fù)合穩(wěn)定劑1，另一份加入復(fù)合穩(wěn)定劑2，隨即將兩者放在同樣的條件下進(jìn)行保存。經(jīng)提取的酶液要進(jìn)行酶活測定，記為原始酶活，追蹤8 d內(nèi)胰脂肪酶的保存率，以天為單位記錄胰脂肪酶的酶活力并以百分比的形式表示酶的保存率。

1.2.2.6 保存溫度

由試驗結(jié)果得出較優(yōu)胰脂肪酶液保存的復(fù)合穩(wěn)定劑，并使用此復(fù)合穩(wěn)定劑來探究保存溫度對胰脂肪酶穩(wěn)定性的影響。將保存溫度定為25、30、35℃3個梯度，其他條件均相同，以天為單位測量8 d內(nèi)各個溫度下胰脂肪酶的酶活力并以百分比的形式表示液體酶的保存率。

1.2.2.7 透析試驗

液體酶中含有的其他物質(zhì)比較多，可能存在影響胰脂肪酶酶活力的物質(zhì)，因此使用透析袋（20 000 D）進(jìn)行透析處理。將裝有10 mL酶液的透析袋浸沒在用蒸餾水制成的聚乙二醇-20 000溶液中，將其放在4℃條件下進(jìn)行透析，透析2 h～3 h內(nèi)換一次透析液，然后在5 h～6 h內(nèi)換一次透析液，接著過夜透析，透析總時間為24 h，最后測定并分析透析對胰脂肪酶酶活力的影響。注意透析液的使用量務(wù)必保證能夠浸沒透析袋。

1.2.3 正交試驗

根據(jù)前期的試驗結(jié)果，對提取劑、提取溫度、提取時間、提取pH值4個因素設(shè)定3個水平，使用正交表L9（34）進(jìn)行優(yōu)化試驗，從而可以選出最優(yōu)水平組合，胰脂肪酶提取正交試驗因素水平設(shè)定見表1。

表1 胰脂肪酶提取正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment for extraction of pancreatic lipase

1.2.4 胰脂肪酶酶活力的測定

按照GB/T 23535-2009《脂肪酶制劑》中的指示劑滴定法進(jìn)行酶活力測定與計算。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本文中每組試驗平行測定3次，數(shù)據(jù)表示為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，用SPSS 24.0版本軟件進(jìn)行方差分析和多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 提取劑

雖然酶的提取劑種類很多，但是有機(jī)溶劑的大量使用對生活環(huán)境有一定程度的影響，并且會增加提取成本。本試驗在探究過程中使用的提取劑為磷酸鹽緩沖溶液（pH 7.5）、0.15 mol/L氯化鈉溶液、蒸餾水，這類提取劑的成本相對比較低廉，有利于提升生產(chǎn)者的經(jīng)濟(jì)效益。通過探究3種提取劑對胰脂肪酶酶活力的影響，得出的試驗結(jié)果如表2所示。

由表2可知，3種提取劑對胰脂肪酶酶活力有不同程度的影響（P＜0.05），其中以磷酸鹽緩沖溶液（pH 7.5）為提取劑得到的脂肪酶酶活力比較高，因此可以確定其為最佳提取劑。

表2 提取劑對胰脂肪酶酶活力的影響Table 2 Effect of extractant on activity of pancreatic lipase

2.1.2 提取時間

不同種類酶的提取時間有一定的差異，同時對于同一種酶而言，使用不同的提取劑其最佳的提取時間也不盡相同。通過探究提取劑對胰脂肪酶酶活力的影響，得出相對最佳提取劑為磷酸鹽緩沖溶液（pH 7.5）。后續(xù)試驗均以磷酸鹽緩沖溶液為提取劑進(jìn)行探究，通過探究時間對胰脂肪酶酶活力的影響，得出的試驗結(jié)果如表3所示。

表3 時間對胰脂肪酶酶活力的影響Table 3 Effect of time on activity of pancreatic lipase

由表3可知，提取時間為1 h～2 h時，胰脂肪酶酶活力呈上升趨勢（P＜0.05），當(dāng)提取時間為 2 h～6 h 時，胰脂肪酶酶活力呈下降趨勢，在3 h～4 h時胰脂肪酶酶活力下降更加明顯。綜上可以得出結(jié)論，以磷酸鹽緩沖溶液（pH 7.5）為胰脂肪酶的提取劑時，其較優(yōu)提取時間為2 h。提取時間過短就會造成提取不完全，提取時間過長會導(dǎo)致部分酶失活，所以適當(dāng)?shù)奶崛r間有利于保持較高酶活力。

2.1.3 提取溫度

溫度是酶活力的影響因素之一，溫度過低會使酶活力降低，溫度過高會使酶變性失活，因此提取溫度是提取酶時需要注意的方面之一。以磷酸鹽緩沖溶液（pH 7.5）為提取劑，提取時間為2 h，探究提取溫度對胰脂肪酶酶活力的影響，結(jié)果如表4所示。

由表4可以得出，隨著溫度的升高，胰脂肪酶酶活力呈下降趨勢，當(dāng)提取溫度為4℃和15℃時，胰脂肪酶酶活力差異較為顯著。綜上所述，以磷酸鹽緩沖溶液（pH 7.5）為提取劑，提取時間為2 h時，可以確定其較優(yōu)提取溫度為4℃。

表4 溫度對胰脂肪酶酶活力的影響Table 4 Effect of temperature on activity of pancreatic lipase

2.1.4 提取pH值

過酸過堿都會使酶喪失活性，適宜的提取pH值會使酶的提取得到比較理想的效果。以磷酸鹽緩沖溶液為提取劑，探究pH值對胰脂肪酶酶活力的影響，結(jié)果如表5所示。

表5 pH值對胰脂肪酶酶活力的影響Table 5 Effect of pH on activity of pancreatic lipase

由表5可以得出，在25℃條件下，以磷酸鹽緩沖溶液為提取劑，提取時間為2 h時，當(dāng)pH值為6.5～7.5時，胰脂肪酶酶活力呈上升趨勢，其中pH值為6.5～7.0時，pH值對胰脂肪酶酶活力影響較為顯著（P＜0.05）；當(dāng)pH值為7.5～8.5時，胰脂肪酶酶活力呈下降趨勢，其中pH值為7.5～8.0時，pH值對胰脂肪酶酶活力影響較為顯著（P＜0.05）。綜上所述，在25℃條件下，以磷酸鹽緩沖溶液為提取劑，提取時間為2 h時，其適宜提取pH值為7.50。

2.1.5 復(fù)合穩(wěn)定劑

不同的復(fù)合穩(wěn)定劑配方對胰脂肪酶的保存率的影響程度不同，通過探究復(fù)合穩(wěn)定劑1與復(fù)合穩(wěn)定劑2對胰脂肪酶的保存率的影響，得出的試驗結(jié)果如表6所示。

由表6可知復(fù)合穩(wěn)定劑1與復(fù)合穩(wěn)定劑2均可以使胰脂肪酶酶液至少保存1周，其中復(fù)合穩(wěn)定劑2的保存效果比較理想，保存時間也比較長，為兩種復(fù)合穩(wěn)定劑中較優(yōu)配方。當(dāng)加入復(fù)合穩(wěn)定劑的液體酶保存至第8天時，使用復(fù)合穩(wěn)定劑1中的胰脂肪酶保存率為（89.37±0.96）%，使用復(fù)合穩(wěn)定劑2中的胰脂肪酶保存率為（135.86±4.50）%，由此可以確定復(fù)合穩(wěn)定劑2的配方對液體酶的保存有良好的效果。

表6 復(fù)合穩(wěn)定劑對胰脂肪酶保存率的影響Table 6 Effect of compound stabilizer on the retention rate of pancreatic lipase

2.1.6 保存溫度

溫度會影響酶的穩(wěn)定性，因此使用復(fù)合穩(wěn)定劑2來探究胰脂肪酶的適宜存放溫度。將復(fù)合穩(wěn)定劑加入經(jīng)提取的胰脂肪酶液中，分別放在不同的溫度下存放一定時間，及時取出并測定胰脂肪酶酶活力，并通過比較其相應(yīng)酶活力的大小，說明不同保存溫度對胰脂肪酶穩(wěn)定性的影響。本試驗取25、30、35℃作為酶的存放溫度，結(jié)果如表7所示。

表7 保存溫度對胰脂肪酶穩(wěn)定性的影響Table 7 Effect of preservation temperature on stability of pancreatic lipase

由表7可以得出，在沒有使用復(fù)合穩(wěn)定劑的情況下，胰脂肪酶酶活力呈直線型下降，且在第6天時胰脂肪酶酶活力已經(jīng)完全失活。在25℃與30℃下，胰脂肪酶的保存趨勢基本一致，但在25℃下胰脂肪酶的保存率較好，在35℃下胰脂肪酶保存率較差，第8天時已經(jīng)下降至（41.60±6.58）%，因此25℃是較為適宜的胰脂肪酶液存放溫度。

2.1.7 透析

透析袋透析法是酶濃縮的一種方法，通過探究反滲透透析對胰脂肪酶酶活力的影響，得出的試驗結(jié)果如表8所示。

表8 透析對胰脂肪酶酶活力的影響Table 8 Effect of dialysis on activity of pancreatic lipase

用磷酸鹽緩沖溶液提取后的胰脂肪酶液經(jīng)過24 h的透析可以得到少量固體，經(jīng)過準(zhǔn)確稱量、梯度稀釋后測得的胰脂肪酶酶活力相對比較高，因此可通過透析袋透析法制得酶活力比較高的酶制劑。

2.2 正交試驗

正交試驗結(jié)果見表9，正交試驗方差分析見表10。

表9 正交試驗結(jié)果Table 9 Results of orthogonal test

由表9可以得出影響胰脂肪酶提取的因素主次順序為pH值>提取劑>溫度>時間，最優(yōu)組合為A1B1C2D2，即當(dāng)提取劑為0.15 mol/L氯化鈉溶液，提取溫度為25℃，提取時間為1 h，提取pH值為7.5時，得到的胰脂肪酶液的酶活力相對比較高。由于正交試驗中沒有A1B1C2D2組試驗，因此以最優(yōu)提取條件進(jìn)行驗證，得到胰脂肪酶酶活力782.65 U/mL。由表10的方差分析結(jié)果可知，提取溫度、提取pH值、提取劑3個因素對胰脂肪酶的酶活力都具有極顯著的影響，提取時間對試驗結(jié)果有顯著影響，與極差分析的結(jié)果一致。

表10 正交試驗方差分析Table 10 Variance analysis of orthogonal experiment

3 結(jié)論

通過探究影響豬胰臟中胰脂肪酶提取的因素，最終確定較優(yōu)方案為以0.15 mol/L氯化鈉溶液為提取劑，提取時間為2 h，提取pH 7.5，提取溫度為25℃，在此條件下提取得到的胰脂肪酶酶活力為782.65 U/mL。將復(fù)合穩(wěn)定劑2（1.0%丙三醇、1.0%吐溫80、1.2%氯化鈉、2.2%葡萄糖酸鈣、1.2%麥芽糖、1.2%可溶性淀粉）添加到提取后的胰脂肪酶酶液中，可使酶液的保存時間至少延長至1周。當(dāng)使用復(fù)合穩(wěn)定劑2作為穩(wěn)定劑配方時，其適宜保存溫度為25℃。本試驗探究得出的提取工藝具有提取周期短、提取成本低廉、提取方法簡便、提取條件容易滿足、安全性比較高等特點，具有一定的實踐價值。