復(fù)合蛋白酶水解核桃粕制備血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽工藝優(yōu)化

祝素瑩，朱瑜，張銀志，孫秀蘭，寧德魯，耿樹香，*

（1.江南大學(xué)食品學(xué)院食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，食品安全與營養(yǎng)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇無錫214122；2.漢中市質(zhì)量技術(shù)檢驗檢測中心，陜西漢中723000；3.云南省林業(yè)科學(xué)院，云南昆明650201）

我國核桃產(chǎn)量居世界首位，但在核桃產(chǎn)品的開發(fā)和核桃資源的充分利用上仍有很大的發(fā)展空間[1-3]。核桃經(jīng)榨油后的副產(chǎn)物核桃餅粕中含有高達(dá)50%左右的蛋白質(zhì)，而目前核桃餅粕大部分經(jīng)簡單加工后作為飼料或肥料，產(chǎn)品價值和利用率較低[4]。血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（angiotensin converting enzyme，ACE）是一種含鋅二羧肽酶，在血壓調(diào)節(jié)過程中具有重要作用。ACE抑制肽，又稱降血壓肽，能夠顯著降低血管緊張素轉(zhuǎn)化酶活性，具有降低血壓的作用。近年來，植物蛋白源ACE抑制肽的制備及活性分析成為了生物活性肽研究的熱點[5-8]。

核桃粕蛋白質(zhì)含有人體8種必需氨基酸，是制備生物活性多肽的優(yōu)良原料[9]。本課題以壓榨脫油后的核桃餅粕為原料，利用堿溶酸沉法提取核桃蛋白，通過復(fù)合酶酶解制備降血壓核桃多肽，優(yōu)化酶解工藝條件并分析了降血壓核桃多肽的常溫儲存穩(wěn)定性和體外消化穩(wěn)定性，為進(jìn)一步提高核桃的附加價值和資源利用率，同時為核桃降血壓肽的開發(fā)與應(yīng)用提供思路，為其工業(yè)化生產(chǎn)奠定技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

榨油后核桃餅粕：云南省林業(yè)科學(xué)院；風(fēng)味蛋白酶（1.5×104U/g）、中性蛋白酶（5×104U/g）、菠蘿蛋白酶（5×104U/g）、木瓜蛋白酶（1×105U/g）、堿性蛋白酶（2×105U/g）、胰蛋白酶（2 000 U/g）：南寧龐博生物工程有限公司；ACE、馬尿酰-組氨酰-亮氨酸（N-hippuryl-L-histidyl-L-leucine hydrate，HHL）、胃蛋白酶（酶活力≥1 200 U/g）：美國Sigma公司；四硼酸鈉、硼酸、石油醚（30℃～60℃）等：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。以上化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

ZNCL-GS型恒溫磁力攪拌器：河南愛博特科技發(fā)展有限公司；DHG-9140型電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；UV-1800型紫外可見分光光度計：日本島津公司；ST 40R型臺式離心機(jī)：賽默飛世爾科技（中國）有限公司；RV 8型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：艾卡（廣州）儀器設(shè)備有限公司；SCIENTZ-10N型冷凍干燥機(jī)：寧波新芝生物科技股份有限公司；Waters 1525型高效液相色譜儀：沃特世科技（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 核桃蛋白提取

基于堿溶酸沉原理，參考姜莉等[10]的方法提取核桃蛋白。將脫油后的核桃餅粕粉碎過40目篩，得核桃粕粉。稱取適量的核桃粕粉，按料液比1∶20（g/mL）配成核桃粕粉溶液，用1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至9.0，超聲輔助提取1 h后，4 000 r/min下離心20 min，棄去沉淀。上清液用1 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH值至4.5，25℃室溫下靜置 2 h，4 000 r/min離心 20 min，取沉淀，水洗至中性后真空冷凍干燥，粉碎過40目篩，得到核桃蛋白粉。

1.3.2 核桃多肽制備

稱取適量核桃蛋白粉，配制成一定質(zhì)量濃度的核桃蛋白液，調(diào)節(jié)所需的酶解條件（酶解溫度、pH值、底物濃度、酶制劑種類與添加量）。恒溫磁力加熱攪拌器中400 r/min酶解1 h，沸水浴滅酶10 min，冷卻至室溫（25℃）后10 000 r/min離心15 min，上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后真空冷凍干燥，得到核桃多肽粉，4℃密封冷藏備用。

1.3.3 復(fù)合蛋白酶選擇

選擇堿性蛋白酶、中性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶共6種酶，分別在各自最佳作用條件下對核桃蛋白進(jìn)行酶解。以酶解液的體外ACE抑制活性為指標(biāo)，篩選出ACE抑制活性較高的兩種蛋白酶作為制備核桃蛋白來源ACE抑制肽的復(fù)合酶制劑。6種酶的最佳酶解條件見表1。

表1 6種蛋白酶的最佳作用條件Table 1 Optimum conditions for six proteases

1.3.4 單因素試驗

以核桃多肽的體外ACE抑制活性為指標(biāo)，在確定復(fù)合酶種類的基礎(chǔ)上，進(jìn)行單因素試驗。分別考察復(fù)合蛋白酶比例（堿性蛋白酶與中性蛋白酶質(zhì)量比1∶3、1 ∶2、1 ∶1、2 ∶1、3 ∶1）、復(fù)合蛋白酶添加量（4 000、6 000、8 000、10 000、12 000 U/g）、酶解時間（0.5、1、1.5、2、2.5 h）、酶解溫度（40、45、50、55、60℃）、酶解 pH 值（6.5、7.0、7.5、8.0、8.5）、底物濃度（1%、2%、3%、4%、5%）等因素對制備核桃蛋白源ACE抑制肽活性的影響，確定適宜的酶解條件。

1.3.5 正交試驗

在單因素試驗基礎(chǔ)上，對4個影響顯著的因素進(jìn)行正交試驗優(yōu)化，建立L9（34）正交表，以ACE抑制活性為指標(biāo)，進(jìn)行四因素三水平的正交試驗優(yōu)化，試驗因素水平表見表2。

表2 正交試驗數(shù)據(jù)表Table 2 Design of orthogonal test

1.3.6 核桃多肽體外ACE抑制活性的測定

體外ACE抑制活性測定方法見表3。

表3 體外ACE抑制活性測定方法Table 3 Method for the determination of ACE inhibition rate in vitro

采用改進(jìn)的Cushman等[11]的方法對ACE抑制活性進(jìn)行測定：依次加入表3中的試劑，然后向各試管加入1.8 mL乙酸乙酯，振蕩15 s，4 000 r/min離心15 min，吸取1 mL的乙酸乙酯層，于120℃的恒溫干燥箱內(nèi)干燥約45 min，直至乙酸乙酯完全揮干。取出冷卻并加入3 mL去離子水復(fù)溶。于波長228 nm處測定吸光值，ACE抑制活性計算公式如下，并計算IC50值（當(dāng)ACE的活性被抑制到50%時所需的肽濃度）：

式中：Aa表示反應(yīng)中核桃多肽液與ACE同時存在的吸光值；Ab表示反應(yīng)中不加樣品液的吸光值；Ac表示ACE與HHL空白反應(yīng)的吸光值。

1.3.7 多肽相對分子質(zhì)量測定

液相色譜法測定酶解得到的核桃多肽相對分子量分布。色譜條件：TSK Gel 2000 SWXL（300 mm×7.8 mm）色譜柱；流動相：乙腈/水/三氟乙酸（體積比為45 ∶55 ∶0.1）；紫外波長：220 nm；流速：0.5 mL/min；柱溫 30℃，進(jìn)樣體積 20 μL。Empower工作站 gel permeation chromatography軟件處理數(shù)據(jù)。

1.3.8 核桃ACE抑制肽的儲存穩(wěn)定性

考察核桃ACE抑制肽在室溫（25℃）儲存條件下的吸濕性能及ACE抑制活性的變化情況，評估核桃多肽產(chǎn)品的性狀穩(wěn)定性。稱取5 g干燥的多肽樣品，平鋪于潔凈培養(yǎng)皿中，室溫25℃放置，半敞口，每小時稱重并記錄，至恒重，同時測定每小時吸濕后的核桃多肽樣品ACE抑制活性。根據(jù)質(zhì)量變化計算吸濕性，根據(jù)吸濕前后ACE抑制活性變化計算相對ACE抑制活性。計算公式如下：

1.3.9 核桃ACE抑制肽體外消化穩(wěn)定性

參考李瑩等[12]的方法利用胃蛋白酶和胰蛋白酶進(jìn)行胃和十二指腸的體外模擬消化，測定消化后的IC50值。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗均重復(fù)3次，試驗數(shù)據(jù)以Means±SD表示。采用Origin 9.0、SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析及繪圖處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)合酶種類篩選

在底物濃度為3%，酶添加量為8 000 U/g的條件下，分別在6種蛋白酶最適酶解溫度和pH值條件下酶解反應(yīng)1 h，測得體外ACE抑制活性見圖1。

由圖1可知，在一定酶解條件下，中性蛋白酶的酶解產(chǎn)物表現(xiàn)出了最高的體外ACE抑制活性，高達(dá)（48.7±0.70）%，與其它5種蛋白酶ACE抑制活性相比差異均顯著（p<0.05）；其次為堿性蛋白酶（46.56±0.47）%，而胰蛋白酶酶解產(chǎn)物表現(xiàn)出最低的體外ACE抑制活性，僅為（29.97±1.34）%。由于不同種類蛋白酶的作用位點不同，酶解獲得的多肽片段也不相同，表現(xiàn)出的體外ACE抑制活性存在差異。綜合考慮，選擇中性蛋白酶和堿性蛋白酶作為復(fù)合酶，進(jìn)行核桃蛋白制備ACE抑制肽酶解工藝條件的優(yōu)化。

圖1 6種蛋白酶酶解產(chǎn)物的體外ACE抑制活性Fig.1 ACE inhibitory activity of six kinds of enzymatic hydrolysates

2.2 單因素試驗結(jié)果

2.2.1 復(fù)合酶添加比例對核桃多肽ACE抑制活性的影響

調(diào)整復(fù)合酶添加量8 000 U/g，底物濃度3%，酶解溫度50℃，酶解pH 7.5，酶解時間1 h，以酶解液的體外ACE抑制活性為指標(biāo)，優(yōu)選堿性蛋白酶和中性蛋白酶復(fù)合添加質(zhì)量比，結(jié)果如圖2所示。

圖2 復(fù)合酶添加比例對核桃多肽ACE抑制活性的影響Fig.2 Effect of compound enzyme ratio on ACE inhibitory activity of walnut polypeptides

復(fù)合酶酶解得到的核桃多肽的體外ACE抑制活性高于單一酶酶解得到的核桃多肽的體外ACE抑制活性，說明復(fù)合酶在一定復(fù)配比例時，酶解獲得的產(chǎn)品活性均優(yōu)于單一酶。當(dāng)堿性蛋白酶與中性蛋白酶的添加質(zhì)量比為1∶2時，制備得到的核桃多肽的體外ACE抑制活性最高，達(dá)（52.51±1.21）%；當(dāng)堿性蛋白酶與中性蛋白酶的添加質(zhì)量比為2∶1時，制備得到的核桃多肽的體外ACE抑制活性最低，僅為（38.05±1.66）%。由于堿性蛋白酶和中性蛋白酶具有不同的作用位點，利用復(fù)合酶酶解得到的多肽相較于單一酶酶解多肽更復(fù)雜，酶解獲得的多肽分子量大小和生物活性存在差異。綜上，選取最適堿性蛋白酶與中性蛋白酶的添加質(zhì)量比為1∶2進(jìn)一步優(yōu)化酶解條件。

2.2.2 復(fù)合酶添加量對核桃多肽ACE抑制活性的影響

調(diào)整堿性蛋白酶和中性蛋白酶添加質(zhì)量比為1：2，底物濃度3%，酶解溫度50℃，酶解pH 7.5，酶解時間1 h，酶解液體外ACE抑制活性為指標(biāo)，優(yōu)化制備核桃ACE抑制肽的復(fù)合酶添加量，結(jié)果見圖3。

圖3 復(fù)合酶添加量對核桃多肽的ACE抑制活性的影響Fig.3 Effect of compound enzyme addition on ACE inhibitory activity of walnut polypeptides

如圖3所示，復(fù)合酶添加量從4 000 U/g增至12 000 U/g時，酶解得到的核桃多肽的ACE抑制活性呈先增強(qiáng)后減弱的趨勢，并在8 000 U/g時達(dá)到最高值，達(dá)（52.49±1.05）%。蛋白酶添加量低于8000 U/g時，隨添加量的增加，酶與底物反應(yīng)充分，生成較多的ACE抑制肽；當(dāng)酶添加量超過8 000 U/g時，ACE抑制活性下降，可能是過量的蛋白酶將具有活性的多肽繼續(xù)降解為更小的肽或者氨基酸[13]。因此，選取最適酶添加量為8 000 U/g，進(jìn)一步優(yōu)化酶解條件。

2.2.3 底物濃度對核桃多肽ACE抑制活性的影響

調(diào)整堿性蛋白酶和中性蛋白酶添加質(zhì)量比為1∶2，復(fù)合酶添加量8 000 U/g，酶解溫度50℃，酶解pH 7.5，酶解時間1 h，控制底物濃度分別為1%、2%、3%、4%、5%，探討底物濃度對制備核桃ACE抑制肽的影響，結(jié)果如圖4所示。

在考察底物濃度范圍內(nèi)，酶解產(chǎn)物ACE抑制活性呈先上升后下降的趨勢。當(dāng)酶解底物濃度為4%時，酶解得到的核桃多肽產(chǎn)物具有最高的ACE抑制活性，為（59.50±0.59）%。當(dāng)?shù)孜餄舛冗^低時，酶與底物反應(yīng)不完全，得到的產(chǎn)物ACE抑制活性不高。當(dāng)?shù)孜餄舛冗^高時，酶解體系黏度變大，不利于酶的擴(kuò)散，從而抑制酶解反應(yīng)[14]。最終選取底物濃度4%為最佳反應(yīng)條件。

圖4 底物濃度對核桃多肽ACE抑制活性的影響Fig.4 Effect of substrate concentrations on ACE inhibitory activity of walnut polypeptides

2.2.4 pH值對核桃多肽ACE抑制活性的影響

調(diào)整堿性蛋白酶和中性蛋白酶添加質(zhì)量比為1∶2，復(fù)合酶添加量為8 000 U/g，酶解溫度50℃，底物濃度4%，酶解時間 1 h，探討 pH 值分別為 6.5、7.0、7.5、8.0、8.5時對核桃ACE抑制效果的影響，結(jié)果如圖5所示。

圖5 酶解pH值對核桃多肽的ACE抑制活性的影響Fig.5 Effect of pH on ACE inhibitory activity of walnut polypeptides

pH值對核桃多肽的ACE抑制活性的影響呈先升高后下降的趨勢。當(dāng)pH值為8.0時制備得到的核桃多肽ACE抑制活性達(dá)到最高值（61.56±0.65）%。當(dāng)酶解pH值過高或過低時，酶解產(chǎn)物的ACE抑制活性下降，可能原因是蛋白酶部分失活進(jìn)而影響酶解作用。因此，最佳酶解pH值為8.0。

2.2.5 溫度對核桃多肽ACE抑制活性的影響

調(diào)整堿性蛋白酶和中性蛋白酶添加質(zhì)量比為1∶2，復(fù)合酶添加量8 000 U/g，酶解pH 8.0，底物濃度4%，酶解時間 1 h，考察酶解溫度分別為 40、45、50、55、60℃時對核桃多肽體外ACE抑制活性的影響，結(jié)果如圖6所示。

圖6 酶解溫度對核桃多肽的ACE抑制活性的影響Fig.6 Effect of temperature on ACE inhibitory activity of walnut polypeptides

當(dāng)酶解溫度為45℃時，酶解獲得核桃多肽的ACE抑制活性高達(dá)（63.33±0.48）%。隨著酶解溫度的升高，蛋白酶受熱結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，酶活力降低，從而造成ACE抑制活性顯著下降。因此，優(yōu)化試驗最佳酶解溫度為45℃。

2.2.6 酶解時間對核桃多肽的ACE抑制活性的影響

調(diào)整堿性蛋白酶和中性蛋白酶添加質(zhì)量比為1∶2，復(fù)合酶添加量8 000 U/g，酶解溫度45℃，酶解pH 8.0，底物濃度 4%，考察酶解時間分別為 0.5、1、1.5、2、2.5 h時對核桃多肽體外ACE抑制活性的影響，結(jié)果如圖7所示。

圖7 酶解時間對核桃多肽的ACE抑制活性的影響Fig.7 Effect of treatment time on ACE inhibitory activity of walnut polypeptides

當(dāng)酶解時間低于1 h時，核桃多肽的ACE抑制活性隨酶解時間的增加迅速升高，ACE抑制活性達(dá)到（63.21±0.55）%；當(dāng)酶解時間大于1 h時，核桃多肽的ACE抑制活性增長減緩，延長酶解時間也不能顯著提高ACE抑制活性。可能由于酶解反應(yīng)剛開始時，酶解產(chǎn)物主要是ACE抑制活性不高的大分子蛋白質(zhì)，隨著酶解時間的延長，大分子蛋白質(zhì)繼續(xù)被酶解成具有較高的ACE抑制活性的小分子短肽，當(dāng)酶解時間達(dá)到一定值時，底物被分解完全，產(chǎn)物ACE抑制活性的增幅就變小。因此選擇1 h作為制備核桃ACE抑制肽的最佳酶解時間。

2.3 正交試驗結(jié)果

在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，按照表2進(jìn)行正交試驗，試驗結(jié)果見表4。

表4 正交試驗結(jié)果表Table 4 Results of orthogonal test

由表4中極差R值可知，復(fù)合酶解核桃蛋白制備ACE抑制肽工藝中各因素影響大小順序為復(fù)合酶添加質(zhì)量比>底物濃度>酶解溫度>酶添加量，且確定最佳工藝條件為復(fù)合酶添加質(zhì)量比1∶2、底物濃度4%、酶解溫度45℃、酶添加量8 000U/g。通過軟件分析得到預(yù)測最佳工藝條件下產(chǎn)品ACE抑制活性結(jié)果為62.60%。驗證性試驗得到3次平行結(jié)果為（63.42±0.70）%，與預(yù)測結(jié)果基本一致，即本正交試驗結(jié)果可靠。

2.4 核桃降血壓肽的性質(zhì)分析

2.4.1 核桃多肽ACE抑制活性的比較

將最優(yōu)工藝條件下制備得到的ACE抑制肽與由4種不同工藝參數(shù)酶解得到的核桃多肽樣品進(jìn)行比較（樣品1、2原料為核桃蛋白，樣品3、4原料為核桃乳清），結(jié)果見表5。

表5 核桃多肽產(chǎn)品ACE抑制活性的比較Table 5 Comparison of ACE inhibitory activity of five walnut polypeptides

本試驗優(yōu)化參數(shù)得到的樣品ACE抑制活性[（63.42±0.70）%]高于其余4個樣品，但與樣品1的ACE抑制活性不存在顯著性差異（p>0.05）。與復(fù)合酶水解樣品以及樣品1、2相比，樣品3和樣品4的ACE抑制活性差異極顯著（p<0.05），說明酶解核桃蛋白制備得到的多肽相較于酶解核桃乳清制備得到的多肽具有更高的ACE抑制活性。樣品的IC50值也顯示了復(fù)合酶解制備得到的核桃多肽活性[（0.838±0.015）mg/mL]顯著高于和的樣品3[（1.189±0.052）mg/mL]、樣品4[（2.208±0.061）mg/mL]的ACE抑制活性。

2.4.2 核桃降血壓肽相對分子質(zhì)量測定結(jié)果

凝膠滲透色譜法測定核桃多肽產(chǎn)品的相對分子質(zhì)量分布，結(jié)果見表6。

表6 核桃多肽的分子量分布Table 6 Molecular weight distribution of five walnut polypeptides

多肽樣品的相對分子質(zhì)量均小于5 kDa，且主要集中在0～2 kDa范圍內(nèi)。利用SPSS軟件將表5的結(jié)果與表6的結(jié)果進(jìn)行比較可得，相對分子質(zhì)量500 Da～1 000 Da范圍的產(chǎn)品與ACE抑制活性存在極強(qiáng)正相關(guān)性，皮爾森系數(shù)為0.979；相對分子質(zhì)量0～180 Da范圍的產(chǎn)品與ACE抑制活性存在極強(qiáng)負(fù)相關(guān)性，皮爾森系數(shù)為-0.985。Oshima等[15]報道分子量小于1 500 Da的小分子肽段表現(xiàn)出高ACE抑制活性。而周慧江等[16]利用超濾膜分離不同分子量的核桃多肽，發(fā)現(xiàn)相對分子質(zhì)量在1 kDa以下的核桃多肽具有較高的降血壓活性。本試驗結(jié)果均與已有報道一致。根據(jù)結(jié)果還可推測，高活性降血壓肽的分子量在500 Da～1 000 Da范圍，而相對分子質(zhì)量在0～180 Da范圍的產(chǎn)品對降血壓活性貢獻(xiàn)作用小或無作用。

2.4.3 核桃降血壓肽常溫儲存穩(wěn)定性分析

核桃蛋白及其酶解多肽的常溫儲存吸濕性結(jié)果見圖8。

圖8 吸濕性測定結(jié)果Fig.8 Results of hygroscopicity determination

從圖8中可以看出，5個多肽樣品均具有較強(qiáng)的吸濕性，且顯著高于核桃蛋白。5種多肽產(chǎn)品的吸濕性在0～12 h間均呈先迅速上升后緩慢下降至一定值的趨勢，并在5 h～6 h達(dá)到最高值，均超過14%。除樣品1外，其余4種多肽的吸濕性差異不顯著。核桃多肽產(chǎn)品的吸濕性顯著高于核桃蛋白的吸濕性，其原因為在核桃蛋白酶解后，生成的多肽中含大量親水基團(tuán)，易與空氣中的水分結(jié)合[17]。產(chǎn)品吸濕性在超過6 h后緩慢下降達(dá)到穩(wěn)定的原因可能為多肽吸水飽和后需與大氣濕度不斷平衡。

5種核桃多肽產(chǎn)品在常溫儲存過程中體外ACE抑制活性的變化趨勢見圖9。

圖9 核桃多肽的常溫儲存穩(wěn)定性結(jié)果Fig.9 Storage stability of walnut polypeptides at room temperature

相對ACE抑制活性整體均呈先下降后保持穩(wěn)定的趨勢，基本在5 h～6 h達(dá)到平穩(wěn)狀態(tài)，與吸濕性曲線具有一定的相似性。室溫25℃儲存12h后，產(chǎn)品的ACE抑制活性均有所降低，但降幅不大，仍保留有98%以上的活性，說明產(chǎn)品活性較穩(wěn)定。其中，自制樣品的穩(wěn)定性較好，整體降幅最小，不到1%；1號樣品的穩(wěn)定性較差，整體降幅最大?？赡苁嵌嚯漠a(chǎn)品暴露在空氣中發(fā)生氧化反應(yīng)或吸水后發(fā)生水解反應(yīng)，造成核桃多肽的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而引起活性的降低。

2.4.4 核桃降血壓肽體外消化穩(wěn)定性分析

核桃ACE抑制肽產(chǎn)品經(jīng)口服或注射后進(jìn)入體內(nèi)，可能會被胃蛋白酶、胰蛋白酶等腸道消化酶降解從而結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，造成活性的改變。本試驗利用人工胃液和腸液簡單模擬體內(nèi)消化過程，研究核桃多肽經(jīng)體外消化前后其ACE抑制活性變化，結(jié)果見圖10。

各樣品消化前后的ACE抑制活性均存在顯著性差異（p<0.05），其中試驗制備樣品和樣品3、樣品4經(jīng)體外消化后ACE抑制活性有所提高，而1號樣品和2號樣品經(jīng)體外消化后ACE抑制活性有所下降。將該結(jié)果與相對分子質(zhì)量測定結(jié)果比較分析，制備樣品、樣品3、樣品4經(jīng)消化后ACE抑制活性升高，可能是相對分子質(zhì)量大于1 kDa的多肽被降解，相對分子質(zhì)量500 Da～1 000 Da范圍內(nèi)的多肽含量增加。樣品1和樣品2經(jīng)消化后ACE抑制活性降低，可能是樣品被水解后相對分子質(zhì)量小于180 Da的短肽或游離氨基酸的含量增加?？傮w上看，各樣品經(jīng)體外消化后ACE抑制活性穩(wěn)定，可能具有良好的體內(nèi)降血壓活性。

3 結(jié)論

試驗以核桃粕蛋白為原料，在考察6種單一酶水解效果的基礎(chǔ)上，選擇中性蛋白酶和堿性蛋白酶作為復(fù)合酶，通過單因素試驗和正交試驗發(fā)現(xiàn)各因素對核桃多肽ACE抑制活性的影響大小依次為復(fù)合酶添加質(zhì)量比>底物濃度>酶解溫度>酶添加量。酶解核桃蛋白最佳工藝條件為：復(fù)合酶添加質(zhì)量比1∶2（堿性蛋白酶：中性蛋白酶）、底物濃度4%、酶解溫度45℃、pH 8.0、酶添加量8000 U/g、酶解時間60 min。該條件下制備獲得的降血壓肽ACE抑制活性為（63.42±0.70）%，IC50值為（0.838±0.015）mg/mL。多肽樣品相對分子質(zhì)量主要在0～2 kDa范圍內(nèi)，相對分子質(zhì)量在500 Da～1 000 Da范圍的多肽具有高ACE抑制活性，而相對分子質(zhì)量在0～180 Da范圍的產(chǎn)品對降血壓活性貢獻(xiàn)作用小或無作用。最佳參數(shù)制備得到的核桃多肽在室溫（25℃）儲存過程中活性較穩(wěn)定，并具有良好的體外消化穩(wěn)定性，為產(chǎn)品的工業(yè)化生產(chǎn)與實際應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。