活血清解湯對急性胰腺炎大鼠的調(diào)節(jié)作用及相關(guān)機制研究

汪 揚，陳 誠，梁 超，彭品偉，陳 騰

0 引言

急性胰腺炎(Acute pancreatitis，AP)是一種發(fā)生于胰腺內(nèi)的急性炎癥，可導(dǎo)致鄰近器官或其他器官系統(tǒng)的衰竭，其發(fā)病率高，嚴(yán)重危害人們的健康和生活。膽結(jié)石和酒精是AP發(fā)生的主要原因。已有研究證明，活血清解湯能夠通過上調(diào)瘦素及瘦素受體的表達，調(diào)節(jié)細胞因子網(wǎng)絡(luò)平衡，阻斷炎癥介質(zhì)的級聯(lián)效應(yīng)，從而阻止高脂血癥性胰腺炎的發(fā)生和發(fā)展[1]。本研究采用L-精氨酸腹腔注射誘導(dǎo)急性結(jié)腸炎大鼠，探討中藥活血清解湯對AP的作用效果，及其對相關(guān)基因的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級別雄性SD大鼠(200±20) g，購自上海杰思捷實驗動物有限公司。在溫度(26±2)℃，相對濕度50%條件下適應(yīng)1周，自由飲用潔凈自來水(符合上海市飲用水標(biāo)準(zhǔn))，飼喂普通的維持飼料，墊料用輻照后的玉米芯。

1.2 活血清解湯的制備 采用生大黃15 g，蜜麩炒枳實12 g，芒硝6 g，柴胡12 g，光桃仁12 g，黃連9 g，黃芩9 g，生丹參15 g、赤芍9 g，共99 g，加水熬制，最后制成10袋活血清解湯，每袋160 ml。

1.3 其他試劑 L-精氨酸：購自上海源葉生物科技有限公司。蘇木精染液和伊紅染液：購自珠海貝索生物技術(shù)有限公司。RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScriptTMRT Master Mix)和RNAiso Plus(Trizol)購自TaKaRa。HO-1一抗和GAPDH抗體購自Proteintech公司；Anti-IL-1β一抗購自Abcam。BCA蛋白測定試劑盒購自于Thermo公司。大鼠IL-6 ELISA試劑盒和大鼠IL-1β ELISA試劑盒購自ABclonal公司。

1.4 AP動物模型的制備及分組 參照Tani等[2]和劉大晟等[3]的造模方法，制備大鼠AP模型。實驗前大鼠禁食12 h，自由飲水。大鼠消毒后，采用配制好的20%L-精氨酸溶液腹腔注射大鼠，劑量為 2.5 g/kg體重，間隔1 h注射1次，共注射2次，構(gòu)建AP模型。注射藥物24 h后，對大鼠進行病理檢查，證實胰腺組織間質(zhì)充血、水腫明顯，并有中性粒細胞、單核細胞等炎性細胞的浸潤，伴有淡血性腹水即提示造模成功。

健康SD大鼠被隨機分成3組，每組6只。①空白對照組(C組)：以相同方式腹腔注射等體積的生理鹽水，之后灌胃等劑量的生理鹽水。②模型組(M組)：腹腔注射L-精氨酸，造模成功后，大鼠灌胃等劑量的生理鹽水。③治療組(T組)：腹腔注射L-精氨酸，造模成功后，大鼠灌胃活血清解湯，每次20 ml/kg，每6 h灌胃1次。

1.5 標(biāo)本采集 于給藥后24 h和36 h，各組大鼠采用2.5%戊巴比妥鈉腹腔注射，麻醉大鼠，抽取大鼠的主動脈血，室溫靜置0.5 h，1 900 g離心10 min，分離得到血清，保存于-80 ℃。同時，收集各組大鼠的胰腺組織，用無菌PBS清洗組織，一部分用4%多聚甲醛固定，另一部分凍存于-80 ℃，用于后續(xù)分析。

1.6 觀察指標(biāo)

1.6.1 病理形態(tài)觀察 將固定24 h的胰腺組織取出，蒸餾水沖洗30 min，去除多余固定液后，進行石蠟包埋、切片，以及蘇木精-伊紅染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察胰腺組織的病理學(xué)改變。

1.6.2 熒光定量PCR(RT-PCR)檢測大鼠胰腺組織中相關(guān)基因的表達 根據(jù)Liu等[4]的方法進行RT-PCR。首先提取胰腺組織中的RNA。取50 mg胰腺組織加入1 ml Trizol。用組織勻漿器勻漿后，加入200 μl氯仿，震蕩均勻后室溫放置2 min，4 ℃、12 000 g離心15 min，取上層水相于另一離心管中。然后加入0.5 ml異丙醇，混勻，4 ℃、12 000 g離心10 min，棄上清。向沉淀中加入1 ml 75%乙醇溶液，溫和顛倒離心管，4 ℃、7 500 g離心5 min，棄上清，室溫晾干10 min，用20 μl DEPC H2O溶解沉淀，得到RNA。得到的RNA溶液于分光光度計上檢測RNA的純度和濃度。

根據(jù)RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明書，對提取的RNA進行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA。反轉(zhuǎn)錄后進行熒光定量PCR擴增，其引物序列如表1所示，反應(yīng)條件為50 ℃ 2 min，95 ℃ 2 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，40個循環(huán)，72 ℃延伸7 min，最后降至4 ℃ 結(jié)束反應(yīng)。其中，GAPDH作為內(nèi)參。

表1 各基因的引物及引物序列

1.6.3 免疫組化檢測HO-1和IL-1β的表達 過氧化物酶標(biāo)記的二步法檢測胰腺組織中HO-1和IL-1β的表達。一抗為HO-1(1∶200)和IL-1β(1∶400)，二抗為辣根酶標(biāo)記的羊抗兔IgG(1∶500)。用DAB顯色液染色1 min，自來水沖洗終止反應(yīng)后，在光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.6.4 Western blot檢測HO-1蛋白和IL-1β蛋白的表達 胰腺組織置于蛋白裂解液中，制備組織勻漿，提取胰腺組織中總蛋白質(zhì)。根據(jù)BCA蛋白測定試劑盒的制造商說明書，測定所提取樣品的蛋白質(zhì)濃度。取20 μg蛋白進行10% SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶37 ℃封閉1 h后，加入一抗HO-1(1∶1 000)、IL-1β(1∶1 000)和GAPDH(1∶2 000)4 ℃孵育過夜。洗膜后，加二抗(抗兔，1∶5 000)，37 ℃孵育2 h。洗膜后，加入ECL試劑，壓片后，拍照保存。

1.6.5 ELISA檢測血清中IL-1β和IL-6的水平 按照檢測試劑盒說明書，對大鼠炎癥因子IL-1β和IL-6水平進行測定。

2 結(jié)果

2.1 胰腺組織的病理形態(tài) 由圖1可見，空白對照組的胰腺組織結(jié)構(gòu)完整，無細胞水腫，胰管走行正常，未見小葉間間隙增寬，無出血壞死和炎性細胞的浸潤。而模型組在造模24 h后，可見胰腺結(jié)構(gòu)紊亂，彌漫性小葉間水腫，間質(zhì)充血水腫，并伴有炎性細胞的浸潤。然而，在造模36 h后，胰腺組織的損傷進一步加重，有更多的炎性細胞浸潤，腺泡結(jié)構(gòu)破壞伴有血管損傷，腺周圍組織出血壞死。

圖1 不同組別大鼠胰腺組織的HE染色結(jié)果

用活血清解湯對造模成功的大鼠治療24 h后，胰腺組織充血水腫較模型組有所減輕，并且炎性細胞浸潤減少。治療36 h后，胰腺組織壞死較少，腺泡結(jié)構(gòu)破壞及血管損傷不明顯，其胰腺炎癥得到一定的改善。

2.2 RT-PCR結(jié)果 在模型組中，HO-1的表達高于對照組(P<0.05)；灌胃活血清解湯后，其表達水平增加(P<0.05)，說明活血清解湯可能通過促進HO-1的表達緩解AP。模型組大鼠IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA表達水平升高(P<0.05)，活血清解湯給藥處理后，其mRNA表達水平均下降，IL-1β、TNF-α表達水平與空白對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖2。

GSTM3在空白對照組和模型組中的相對表達量為27.42±1.51和2.98±2.80，而在治療組中為26.66±5.21，說明在急性胰腺炎大鼠中GSTM3的mRNA表達水平顯著增加(P<0.05)?；钛褰鉁幚砗?，其表達水平下降，與模型組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。RyR的mRNA相對表達量在模型組中為0.07±0.01，而在治療組中，其相對表達量為6.74±0.52，說明活血清解湯可以促進RyR基因的表達，見圖2。

2.3 HO-1、IL-1β免疫組化和Western blot檢測結(jié)果 模型組胰腺組織中HO-1、IL-1β表達水平高于空白對照組，治療組HO-1表達水平高于空白對照組，而IL-1β表達低于模型組，見圖3。HO-1、IL-1β的Western blot蛋白檢測結(jié)果如圖4所示。結(jié)果顯示，模型組胰腺組織中HO-1、IL-1β的蛋白表達高于空白對照組，治療組HO-1蛋白表達高于模型組，IL-1β蛋白表達水平低于模型組。

2.4 ELISA檢測血清中IL-1β、IL-6表達 結(jié)果可知，與對照組相比，模型組中IL-1β[(104.67±22.48) pg/ml]、IL-6[(223.33±64.65) pg/ml]的含量明顯增加，治療組大鼠血清中IL-1β、IL-6含量分別下降至(90.92±23.83)、(190±72.01)pg/ml。見圖5。

圖2 HO-1、IL-1β、IL-6、TNF-α、GSTM3和RyR基因mRNA水平相對表達量

圖3 HO-1、IL-1β的免疫組化結(jié)果

圖4 HO-1、IL-1β的Western blot蛋白檢測結(jié)果

圖5 ELISA檢測血清中IL-1β和 IL-6的表達

3 討論

AP是一種常見的急性腹部疾病，在早期易導(dǎo)致系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)綜合征(Systemic inflammatory response syndrome，SIRS)，最終導(dǎo)致多器官功能障礙，死亡率高達15%～20%[5]。在AP炎癥反應(yīng)期間，常見的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑主要是促進促炎因子的產(chǎn)生，誘導(dǎo)氧化應(yīng)激反應(yīng)，激活 MAPK和NF-κB信號傳導(dǎo)途徑，從而導(dǎo)致炎癥級聯(lián)反應(yīng)放大[6-7]。有許多研究表明，氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的改善是緩解AP的主要機制[8-10]。

近年來，多種應(yīng)激源如缺氧、高熱、創(chuàng)傷等都能誘導(dǎo)HO-1表達，這是機體在應(yīng)激狀態(tài)下的一種適應(yīng)性保護反應(yīng)[8]。HO-1是一種普遍表達的可誘導(dǎo)酶，可將血紅蛋白降解為一氧化碳、聯(lián)肝素和Fe2+，參與維持細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)，并通過減少氧化損傷，抑制細胞凋亡和減弱炎癥反應(yīng)，在保護細胞組織中發(fā)揮重要作用[11]。越來越多的證據(jù)表明，HO-1的過表達可應(yīng)用于多種臨床情況，例如器官移植，急性腎損傷，高血壓和動脈粥樣硬化[12-14]。本研究用活血清解湯治療AP大鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，活血清解湯治療后，胰腺組織損傷較模型組顯著減輕。為了進一步探討其機制，本研究用qPCR、免疫組化和Western blot的方法，檢測HO-1在不同組別中的表達情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在模型組中，HO-1的表達水平較空白對照組增強，但是用活血清解湯處理后，HO-1的表達水平進一步增加，說明活血清解湯可以通過上調(diào)HO-1的表達來保護胰腺組織，從而緩解急性胰腺炎。

此外，炎癥反應(yīng)貫穿于AP發(fā)病的全過程，并且體循環(huán)中促炎細胞因子的水平與AP的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[15]。IL-1β和IL-6是參與炎癥和免疫反應(yīng)的非常重要的促炎因子；TNF-α是一種多效細胞因子，對急性和慢性胰腺炎的發(fā)展具有非常重要的作用[16-18]。Coelho等[19]研究表明，己酮可可堿可以通過降低促炎因子的水平(IL-6、TNF-α)和增強抗炎因子(IL-10)的表達來緩解AP。本研究檢測了IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA及IL-1β蛋白，血清中IL-1β和IL-6的表達情況，結(jié)果均顯示，不管是在胰腺組織還是體內(nèi)，這3種促炎因子的水平在模型組中均顯著增強，而經(jīng)過活血清解湯治療后，其水平均有所下降，表明在AP大鼠中，促炎因子顯著表達，而活血清解湯可以通過調(diào)節(jié)促炎因子的水平改善炎癥反應(yīng)，緩解AP。

GSTM3是GSTs超家族一種重要的同工酶。趙明理等[20]通過檢測GSTM3在重癥肌無力患者胸腺組織中的表達，發(fā)現(xiàn)在肌無力患者中，GSTM3的mRNA表達水平顯著增加。在本研究中，在模型組中GSTM3 mRNA表達高于與對照組，而用活血清解湯治療胰腺炎大鼠后，其表達水平有所下降，與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。RyR是另外一種與氧化應(yīng)激反應(yīng)通路有關(guān)的基因，本研究結(jié)果顯示，在模型組中RyR基因的表達水平顯著下降，而用活血清解湯治療后，其mRNA表達顯著增強，提示活血清解湯可以用過增加RyR基因表達來緩解氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而改善AP。

綜上，活血清解湯可以通過上調(diào)HO-1的表達，降低體內(nèi)促炎因子的含量來抑制炎癥反應(yīng)，以及上調(diào)RyR基因來調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而實現(xiàn)對胰腺的保護作用，緩解急性胰腺炎。