無(wú)菌馬尾松種子超低溫保存技術(shù)研究

張曉寧 黃寧 覃子海 姚瑞玲 楊紅 劉海龍

摘?要：該研究利用液氮將不同含水量的無(wú)菌馬尾松種子（27.4%、24.6%、22.7%、16.8%、15.8%、10.7%、7.5%、6.1%、4.8%、3.2%）進(jìn)行超低溫保存。結(jié)果表明：（1）在3.2%～6.1%含水量范圍內(nèi)，經(jīng)液氮冷凍保存后的發(fā)芽率隨著含水量升高而逐漸升高，在含水量6.1%時(shí)，發(fā)芽率達(dá)到最大值（91.33%）;當(dāng)含水量大于6.1%時(shí)，發(fā)芽率逐漸下降，尤其是當(dāng)含水量大于15.8%時(shí)，發(fā)芽率迅速下降;在3.2%～7.5%含水量范圍內(nèi)凍存后發(fā)芽率在80%以上。（2）冷凍、化凍方式影響超低溫保存效果。種子無(wú)需低溫預(yù)冷，直接投入液氮保存（快速冷凍）效果最好;室溫空氣化凍（緩慢化凍）較42?℃水浴化凍發(fā)芽率高，且后者容易發(fā)生種皮炸裂現(xiàn)象。（3）種皮對(duì)馬尾松種子超低溫保存過(guò)程起到保護(hù)作用，使其免受機(jī)械損傷，去掉外種皮的種子凍存后發(fā)芽率顯著下降，且容易出現(xiàn)形態(tài)不正常的幼苗。（4）超低溫保存對(duì)馬尾松種子萌發(fā)具有一定“刺激”作用，在最適含水量6.1%時(shí)，經(jīng)超低溫保存后種子的發(fā)芽率顯著大于對(duì)照種子?？傊?，含水量、冷凍方法、化凍方法、種皮結(jié)構(gòu)顯著影響超低溫保存效果，馬尾松種子超低溫保存的最優(yōu)方法是將種子含水量控制在6.1%，直接投入液氮快速冷凍后室溫空氣緩慢化凍，凍后發(fā)芽率可在90%以上。馬尾松種子超低溫保存技術(shù)體系的建立，為其種質(zhì)資源的長(zhǎng)期保存提供了技術(shù)支持。

關(guān)鍵詞：馬尾松種子，超低溫保存，干燥，含水量，安全含水量范圍，發(fā)芽率

中圖分類(lèi)號(hào)：Q945

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1000-3142（2020）07-0935-09

Abstract：To?explore?long?term?preservation?of?Pinus?massoniana?seeds?through?cryopreservation?technology，aseptic?seeds?of?P.?massoniana?with?different?water?contents?（WC）?（27.4%，24.6%，22.7%，16.8%，15.8%，10.7%，7.5%，6.1%，4.8%，3.2%）?were?cryopreserved?in?liquid?nitrogen.?Our?results?showed?that：（1）?The?germination?of?cryopreserved?seeds?increased?when?the?seed?WC?elevated?from?3.2%?to?6.1%，reaching?the?highest?rate?of?91.33%?at?the?optimum?WC?of?6.1%;?However，seed?germination?decreased?as?WC?further?increased?from?6.1%?to?27.4%，in?particular，?with?a?rapid?decline?in?germination?of?seeds?with?15.8%?or?higher?WC;?There?is?a?wide?range?of?safe?WC，within?3.2%-7.5%，the?average?germination?rate?reached?above?80%.?（2）?In?addition?to?WC，freezing?and?thawing?methods?also?affected?cryopreservation.?Rapid?freezing?by?directly?immersing?seeds?into?liquid?nitrogen?is?better?than?pre-freezing?at?-20?℃?prior?to?liquid?nitrogen?freezing;?a?slow?air-thawing?at?room?temperature?gave?a?better?germination?result?compared?with?a?rapid?thawing?in?a?42?℃?water?bath?that?caused?seed?episperm?cracking.?（3）?The?episperm?also?played?an?important?role，which?protected?the?seeds?from?the?mechanical?damage.?The?germination?rates?without?episperm?were?significantly?lower?than?those?with?episperm，and?the?abnormal?seedlings?were?more?observed?when?the?episperms?were?removing.?（4）?At?the?optimum?WC?of?6.1%，cryopreserved?seeds?germinated?better?than?those?non-cryopreserved?（control），indicating?that?cryopreservation?may?stimulate?seed?germination?of?P.?massoniana.?Collectively，our?results?showed?that?water?content，freezing?and?thawing?methods?as?well?as?the?episperm?structure?can?significantly?affect?cryopreservation?of?P.?massoniana?seeds;?and?the?best?method?for?cryopreservation?of?P.?massoniana?seeds?is?to?directly?freeze?seeds?with?6.1%?WC?using?liquid?nitrogen?followed?by?a?slow?air-thawing?at?room?temperature，by?which?the?germination?can?reach?above?90%.?Results?from?this?study?may?provide?a?rational?for?a?long-term?storage?of?P.?massoniana?seeds?through?cryopreservation.

Key?words：Pinus?massoniana?seeds，cryopreservation，desiccation，water?content，range?of?safe?water?content，germination?percentage

馬尾松（Pinus?massoniana）為松科松屬常綠高大喬木，是我國(guó)分布最廣的優(yōu)質(zhì)鄉(xiāng)土針葉及南方主要造林、綠化樹(shù)種，廣泛應(yīng)用于用材、產(chǎn)脂、荒山造林及制漿造紙，在森林資源建設(shè)及生態(tài)發(fā)展中發(fā)揮著極其重要的作用（秦國(guó)峰和周志春，2012;楊章旗，2012）。廣泛的地理分布和悠久的進(jìn)化起源賦予馬尾松種質(zhì)資源豐富的遺傳多樣性，由于自然環(huán)境惡化及人為破壞等因素，所以其天然林在演替過(guò)程中逐漸被常綠闊葉林和人工林替代，加上單一人工林在應(yīng)對(duì)病蟲(chóng)害及惡劣環(huán)境等自然災(zāi)害方面存在的局限性，其種質(zhì)資源多樣性正受到嚴(yán)重威脅（石娟等，2005;鄧倫秀和李茂，2009）。因此，開(kāi)展對(duì)馬尾松種質(zhì)資源保存的研究就顯得尤為迫切和必要。種子作為植物生命的載體，蘊(yùn)含著豐富的遺傳信息，是遺傳改良、品種創(chuàng)新和良種生產(chǎn)的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。種子的離體保存能在有限的空間最大限度地保存材料的遺傳多樣性，且不受病蟲(chóng)害及天氣等影響，具有成本低、效率高、交流、運(yùn)輸方便等優(yōu)點(diǎn)，是目前馬尾松種質(zhì)資源保存最主要的方式之一。

秦國(guó)峰等（2017a）研究表明馬尾松種子隨著保存期限的延長(zhǎng)，其品質(zhì)不斷下降，常溫開(kāi)放保存3～4?a幾乎全部喪失發(fā)芽力，在2～4?℃低溫密閉保存可在10?a以上。雖然低溫密閉條件延長(zhǎng)了馬尾松種子的保存期限，但相比其漫長(zhǎng)的生命周期和從發(fā)芽到產(chǎn)生可用于繁殖下一代種子的時(shí)間間隔仍顯短暫，從保障種質(zhì)資源安全的角度來(lái)看，延長(zhǎng)其保存期限具有重要意義，而超低溫保存正是目前為止實(shí)現(xiàn)種質(zhì)資源長(zhǎng)期保存的最佳途徑。

種子的超低溫保存是指將種子投入到液態(tài)氮（-196?℃）或氣態(tài)氮（-150?℃）條件下進(jìn)行保存。在此溫度下，大多數(shù)植物的種子新陳代謝活動(dòng)基本停止，劣變最大限度降低，理論上可以保存成百上千年（Walters?et?al.，2004;Basu，2008），是目前一種集簡(jiǎn)便、實(shí)用、占地少、低成本于一體的長(zhǎng)期保存種質(zhì)資源的方法（Wilde，2015）。超低溫保存技術(shù)已成功應(yīng)用于多種木本植物成熟種子或種胚的保存，如櫻桃（宋常美等，2019）、樟樹(shù)（馬健等，2019）、黑楊（Marcin?et?al.，2015）、合歡和青杄（河英虎等，2013）、高山栲（盧玲等，2013）、紅豆杉（程利紅等，2012）。

孫鴻有等（1994）的研究認(rèn)為，馬尾松種子最適保存溫度是-18～-15?℃。

喻方圓等（2006a）研究認(rèn)為，種子在-30?℃儲(chǔ)藏初期發(fā)芽率就開(kāi)始大幅下降。譚?。?009）研究認(rèn)為，從種子的安全貯藏來(lái)看，馬尾松種子不適合在-25?℃及以下的溫度貯藏。喻方圓等（2006b）利用差式掃描量熱儀證明，馬尾松種子在-24.826?℃的溫度下結(jié)晶，細(xì)胞質(zhì)中粗脂肪含量高，低聚糖與蔗糖比值低，決定了其難形成玻璃化狀態(tài)，并推測(cè)這是馬尾松種子不耐-30?℃以下儲(chǔ)藏的主要原因。

楊學(xué)軍（2008）首次利用脫水干燥法將馬尾松種子進(jìn)行了超低溫保存，當(dāng)含水量為4.3%時(shí)，獲得80%的發(fā)芽率，但主要針對(duì)含水量和冷凍保護(hù)劑對(duì)超低溫保存效果的影響進(jìn)行了研究。本研究在此基礎(chǔ)上，以無(wú)菌種子為材料，系統(tǒng)研究了含水量、冷凍方式、化凍方式及種皮的保護(hù)作用等對(duì)凍存效果的影響，簡(jiǎn)化了馬尾松種子超低溫保存技術(shù)體系，提高了保存效率，確定了最適含水量和安全含水范圍，并首次指出超低溫保存對(duì)馬尾松種子具有一定“刺激”作用，進(jìn)一步驗(yàn)證馬尾松種子超低溫保存的可行性。這對(duì)馬尾松種子資源長(zhǎng)期保存提供了理論指導(dǎo)和技術(shù)支撐，為其他林木種子的超低溫保存研究提供參考。本研究利用無(wú)菌種子不僅消除了種子發(fā)霉對(duì)發(fā)芽率的干擾和影響，而且還可直接獲得無(wú)菌幼苗用于后續(xù)研究。

1?材料與方法

1.1?種子質(zhì)量特性的測(cè)定及含水梯度的建立

試驗(yàn)用馬尾松種子于2017年11月采自廣西藤縣。試驗(yàn)用干燥箱：上海施都凱，BAO-150A;超凈工作臺(tái)：蘇州凈化SW-CJ-2D;光照培養(yǎng)箱：杭州匯爾GZH-0158;冷凍管：美國(guó)?Nunc;硅膠：上海新火;KMnO4?：鄭州中天實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;升汞：貴州省銅仁化工研究所。

參照《林木種子檢驗(yàn)規(guī)程》（國(guó)家質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局，2000）要求測(cè)定千粒重、初始含水量和發(fā)芽率等種子質(zhì)量特性。

1.1.1?發(fā)芽率的測(cè)定?將待測(cè)種子播種于含雙層濾紙的培養(yǎng)皿，定期噴水，保持濾紙濕潤(rùn)。光照培養(yǎng)箱27?℃黑暗培養(yǎng)5?d;?第6天開(kāi)始，光照強(qiáng)度2?000?lx，光照時(shí)間8?h·d-1。當(dāng)根長(zhǎng)等于種子長(zhǎng)時(shí)記為發(fā)芽。發(fā)芽率=（發(fā)芽種子數(shù)/種子總數(shù)）×100%。4個(gè)重復(fù)，每重復(fù)100粒。

1.1.2?初始含水量（ω0）的測(cè)定?采用低溫烘干法（103?℃烘干16?h）測(cè)定，ω0=（鮮重-絕干重）/鮮重×100%。3個(gè)重復(fù)，每重復(fù)50?g。

1.1.3?含水梯度的獲取?消毒后的種子采用浸種和硅膠干燥的方式獲取27.43%～3.2%的10個(gè)含水量梯度的種子，密閉于雙層鋁箔袋中4?℃保存?zhèn)溆?。?shí)際含水量（ω1）采用減重法計(jì)算，ω1=100%-[最初重量×（100%-相對(duì)含水量）]/最后重量。（消毒方式：流水沖洗2?h，0.5%?KMNO4浸泡0.5?h，無(wú)菌水沖洗6次，0.1%升汞消毒5?min，無(wú)菌水沖洗6次。）

1.2?種子的超低溫保存試驗(yàn)

1.2.1?不同含水量對(duì)凍存后發(fā)芽率的影響?先取含水量分別為3.2%、4.8%、6.1%、7.5%、10.7%、15.8%、16.8%、22.7%、24.6%、27.4%的馬尾松種子裝于1.8?mL冷凍管中直接投入液氮保存24?h后，室溫自然化凍，隨后將種子播于鋪有三層無(wú)菌濾紙的培養(yǎng)皿中，封口，置于光照培養(yǎng)箱進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)，并測(cè)定凍存后發(fā)芽率。

1.2.2?冷凍方式對(duì)凍存后發(fā)芽率的影響?取含水量為3.2%、4.8%、6.1%、10.7%、16.8%、22.7%、27.4%的?7個(gè)梯度的種子裝于冷凍管中進(jìn)行如下操作：（1）快凍法：直接投入液氮;（2）緩凍法：經(jīng)-20?℃預(yù)凍30?min投入液氮;（3）慢凍法：經(jīng)-20?℃低溫預(yù)處理24?h后投入液氮。三種冷凍方式統(tǒng)一在液氮保存24?h后，室溫自然化凍，統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率。

1.2.3?化凍方式對(duì)凍存后發(fā)芽率的影響?先將上述7個(gè)含水量梯度的種子直接投入液氮，凍存后的材料從液氮中取出，設(shè)置室溫空氣化凍、42?℃水浴化凍兩種化凍方式各5?min后，再將種子播于鋪有三層無(wú)菌濾紙的培養(yǎng)皿，封口，置于光照培養(yǎng)箱黑暗培養(yǎng)，記錄凍存后發(fā)芽率。

1.2.4種皮對(duì)凍存后發(fā)芽率的影響?取含水量為27.4%、10.7%、6.1%?和3.2%的種子，剝?nèi)シN皮，裝于1.8?mL冷凍管，直接投入液氮保存24?h，室溫空氣化凍后，測(cè)定發(fā)芽率。

1.2.5超低溫保存對(duì)種子發(fā)芽率的影響?取含水量為27.4%、10.7%、6.1%和3.2%的種子裝于1.8?mL冷凍管中直接投入液氮保存24?h，室溫空氣化凍后置于含三層濕潤(rùn)濾紙的培養(yǎng)皿測(cè)定凍存后發(fā)芽率;對(duì)照不經(jīng)液氮直接放入相同條件培養(yǎng)皿測(cè)定發(fā)芽率。

1.3?數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)100粒種子。采用Microsoft?Office?Excel（2016）軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和繪圖。試驗(yàn)結(jié)果為3個(gè)重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。數(shù)據(jù)差異的顯著性采用SPSS方差分析中的?Duncan?新復(fù)極差法進(jìn)行估算。

2?結(jié)果與分析

2.1?種子的質(zhì)量特性及含水量梯度的建立

待測(cè)馬尾松種子千粒重為11.48?g，含水量為9.56%，發(fā)芽率為90.25%。利用浸種和硅膠干燥的方式獲取含水量為27.4%、?24.6%、22.7%、16.8%、15.8%、10.7%、7.5%、6.1%、4.8%、3.2%等10個(gè)梯度的種子，用以進(jìn)行超低溫保存等后續(xù)研究。

2.2?不同含水量對(duì)超低溫保存后種子發(fā)芽率的影響

10個(gè)不同含水量梯度的馬尾松種子凍存后發(fā)芽率結(jié)果如圖1所示。隨著含水量的下降，凍存后發(fā)芽率逐漸增高，直到含水量降為6.1%時(shí)，發(fā)芽率達(dá)到最大值91.33%，當(dāng)繼續(xù)干燥，發(fā)芽率不再上升，甚至有輕微的下降，6.1%為馬尾松種子超低溫保存的最適含水量。含水量為6.1%～15.8%時(shí)，發(fā)芽率緩慢下降;當(dāng)含水量大于15.8%時(shí)，發(fā)芽率急劇下降。含水量從15.8%增加到16.8%時(shí)，發(fā)芽率從69.33%迅速下降到45.67%。馬尾松種子適宜超低溫保存的含水量范圍很廣，將凍后發(fā)芽率在80%以上的含水量范圍3.2%～7.5%作為馬尾松種子超低溫保存的安全含水量范圍。

2.3?不同冷凍方式對(duì)超低溫保存后種子發(fā)芽率的影響

不同冷凍方式對(duì)超低溫保存效果的影響如圖2所示。不同含水量的種子利用緩凍和慢凍法進(jìn)行超低溫保存后發(fā)芽率均不同程度地低于快凍法保存，結(jié)果表明將馬尾松種子直接投入液氮保存效果優(yōu)于先在-20?℃預(yù)凍不同時(shí)間再投入液氮。

2.4?不同化凍方式對(duì)馬尾松種子超低溫保存后發(fā)芽率的影響

室溫空氣化凍和42?℃水浴化凍對(duì)馬尾松種子超低溫保存效果的影響如圖3所示。圖3結(jié)果顯示，室溫空氣化凍效果優(yōu)于?42?℃水浴化凍，含水量越小，兩種化凍方式的差異越明顯，采用室溫空氣化凍后不需要回濕直接置于含濕潤(rùn)濾紙的培養(yǎng)皿進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)。另外，研究發(fā)現(xiàn)42?℃水浴化凍會(huì)發(fā)生種子炸裂現(xiàn)象，致使種子受到機(jī)械損傷。

2.5?外種皮對(duì)超低溫保存效果的影響

外種皮對(duì)超低溫保存效果的影響如圖4所示，在4個(gè)含水量梯度下，帶外種皮的種子保存后發(fā)芽率顯著高于去掉外種皮的種子，但去掉外種皮種子凍存后露白時(shí)間要早于帶外種皮的種子1～2?d，可能是解除了種皮的機(jī)械限制作用的結(jié)果。

保留外種皮的種子胚根先突破胚乳和種皮長(zhǎng)出，接著下胚軸延伸，當(dāng)下胚軸伸長(zhǎng)到一定程度后，子葉初現(xiàn)如圖5：A，B所示，去掉外種皮的種子發(fā)芽情況如圖5：C-G所示。其中：圖5：C，D所示為正常發(fā)育的種子，胚根先突破胚乳長(zhǎng)出（圖5：C），后下胚軸延長(zhǎng)、子葉初現(xiàn)（圖5：D）;圖5：E-G為發(fā)育順序或幼苗形態(tài)異常的情況，子葉和下胚軸同時(shí)在種子兩端生長(zhǎng)（圖5：E），子葉和下胚軸在胚根發(fā)育相反一側(cè)先于胚根發(fā)育（圖5：F），子葉和下胚軸在種子中間突破胚乳發(fā)育延長(zhǎng)（圖5：G）。這種發(fā)育順序異?；蛘哒f(shuō)幼苗形態(tài)異?，F(xiàn)象的具體原因及機(jī)理機(jī)制有待于深入研究。

2.6?超低溫保存對(duì)種子發(fā)芽率的影響

含水量為3.2%、6.1%、10.7%、27.4%的馬尾松種子經(jīng)超低溫保存前后發(fā)芽率如圖6所示，當(dāng)含水量為6.1%時(shí)，經(jīng)超低溫保存后發(fā)芽率為91%，顯著高于該含水量下不經(jīng)超低溫保存的馬尾松種子的發(fā)芽率86%，P=0.049（P<0.05）。這表明在最適含水量6.1%時(shí)，超低溫保存后對(duì)種子的發(fā)芽表現(xiàn)出了適度的“刺激”作用。

3?討論與結(jié)論

據(jù)報(bào)道，林木種子離體保存資金投入約是其樹(shù)上原位保存的1%（Li?&?Pritchard，2009），而作為離體保存方法之一的超低溫保存，能在較小的空間較低的成本下極大地延長(zhǎng)材料的保存時(shí)間（Trajkovic'?et?al.，2019）。借助超低溫保存技術(shù)，正常型林木種子的保存壽命有望延長(zhǎng)到百年及以上（Wang?&?Simpson，2006）。毫無(wú)疑問(wèn)，超低溫保存是目前為止最經(jīng)濟(jì)有效的長(zhǎng)期保存種子資源的方法。種子的超低溫保存一般是將種子投入液氮一定時(shí)間（幾小時(shí)至幾年）取出化凍后采用TTC染色法監(jiān)測(cè)材料的生活力或直接監(jiān)測(cè)發(fā)芽率判斷該方法的適用性。馬尾松種子在液氮保存24?h后化凍后發(fā)芽率為91.33%，本研究不僅為馬尾松種子的長(zhǎng)期保存提供了高效可行的方法，而且還為馬尾松種質(zhì)資源超低溫庫(kù)的建設(shè)提供了理論依據(jù)和實(shí)踐指導(dǎo)，并為其他林木種子超低溫保存研究提供了借鑒。

植物的超低溫耐性與其脫水耐性、過(guò)冷卻能力和玻璃化能力密切相關(guān)（文彬，2011;Popova?et?al.，2012）。根據(jù)脫水耐性及儲(chǔ)藏能力種子被分為正常型、中間型、頑拗型三種類(lèi)型。一般將能忍受脫水至含水量為0.05?g·g-1DW并能在0?℃以下低溫保存的稱(chēng)為正常型種子，林木正常型種子成熟或脫落時(shí)含水量一般為20%～50%（Wang?&?Simpson，2006）。據(jù)此可明確馬尾松種子為正常型種子。正常型種子因?yàn)槟兔撍?，可以在冷凍前把自由水安全地移除，因此存在一個(gè)相對(duì)較寬的安全含水量范圍。對(duì)于這類(lèi)種子FAO/IPGRI推薦的適合長(zhǎng)期保存的含水量為4%～7%，本研究的結(jié)果與此相近。在3.2%～7.5%時(shí)，發(fā)芽率較高（在80%以上），因此認(rèn)為3.2%～7.5%為馬尾松種子的安全含水量范圍，在這個(gè)范圍內(nèi)既可以避免高含水量在零下低溫時(shí)造成的胞內(nèi)結(jié)冰損傷又可以避免含水量過(guò)低引起的脫水損傷。本研究中，當(dāng)含水量從6.1%升到15.8%時(shí)，發(fā)芽率緩慢下降（從91.33%降到69.33%），含水量大于15.8%時(shí)，發(fā)芽率急劇下降，但直到含水量升為22.7%時(shí)，發(fā)芽率仍高達(dá)34%。這與楊學(xué)軍（2008）的研究結(jié)果有些不同，雖然他指出當(dāng)含水量超過(guò)15.6%時(shí)，馬尾松種子超低溫保存后發(fā)芽率急劇下降，但其結(jié)果顯示當(dāng)含水率大于21.6%時(shí)，發(fā)芽率僅為2%。一般認(rèn)為含水量是影響超低溫保存效果的主要因素之一。史鋒厚等（2005）研究認(rèn)為含水量對(duì)超低溫保存效果的影響不顯著，其原因可能是試驗(yàn)油松種子本身的含水量較低，已經(jīng)在超低溫貯藏的適宜含水量范圍之內(nèi)，加上其實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的含水量梯度不大。本研究中，馬尾松種子初始含水量為9.56%，并通過(guò)干燥和浸種擴(kuò)大其含水量梯度為3.2%～27.4%，結(jié)果證明雖然馬尾松種子超低溫保存安全含水量范圍較廣，但含水量仍然對(duì)影響超低溫保存效果有顯著影響。

胞內(nèi)結(jié)冰是影響超低溫保存成功與否的關(guān)鍵因素之一。玻璃化狀態(tài)的形成理論上可以避免細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成（曾琳等，2014）。細(xì)胞內(nèi)含物如可溶性糖、可溶性蛋白能提高植物的脫水耐性，降低過(guò)冷卻點(diǎn)，增強(qiáng)玻璃化能力（文彬，2011）。如喻方圓等（2006b）研究認(rèn)為脂類(lèi)對(duì)杉木種胚玻璃化狀態(tài)的形成十分重要。頑拗性種子易受超低溫傷害的主要原因是細(xì)胞代謝旺盛，線粒體、內(nèi)膜系統(tǒng)豐富，液胞大而脂肪體，蛋白體和淀粉粒少（文彬，2011）。相反，Vertucci（1989）研究認(rèn)為富含油脂的正常型種子易受超低溫傷害：一方面是貯油體與水分的相互作用會(huì)促進(jìn)大冰晶的形成，導(dǎo)致電解質(zhì)的泄露;另一方面是這類(lèi)種子在凍存過(guò)程中容易因油體破裂導(dǎo)致生活力喪失。馬尾松種子富含油脂，其粗脂肪、粗蛋白質(zhì)和總糖含量分別為44.8%、42.5%、7.1%（秦國(guó)峰等，2017b），但未發(fā)現(xiàn)油脂對(duì)其超低溫保存的不利影響，相反，在最適含水量6.1%時(shí)，經(jīng)超低溫保存后馬尾松種子的發(fā)芽率較對(duì)照有所上升。這種超低溫保存對(duì)種子發(fā)芽的“刺激”作用，在人參（商麗煌等，2018）和一些野生花卉也有報(bào)道（王荷和劉燕，2011）。馬尾松種子內(nèi)含物成分及含量與其耐受超低溫保存的關(guān)系，以及超低溫保存對(duì)其發(fā)芽率的“刺激”作用的機(jī)理機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

超低溫保存對(duì)材料的傷害是一個(gè)累積的過(guò)程，冷凍階段的結(jié)冰和化凍階段的次生結(jié)冰都會(huì)導(dǎo)致機(jī)械損傷。因此，一般采取快速冷凍（曾琳等，2018）、快速化凍（Zhang?et?al.，2014）使材料迅速通過(guò)冰晶生長(zhǎng)的溫度危險(xiǎn)區(qū)。有研究認(rèn)為大塊材料的快速升溫可能因?yàn)槭軣岵痪鶆虬l(fā)生機(jī)械傷害。本研究在含水量高的情況下，發(fā)現(xiàn)從液氮取出后，種子凍結(jié)成一整塊兒，推測(cè)這可能是高含水量種子發(fā)芽率低的原因之一。本研究采用直接投入液氮的快速冷凍和室溫空氣緩慢化凍的方法保存效果最好，42?℃水浴快速化凍發(fā)芽率較低，同時(shí)觀察到種子炸裂現(xiàn)象。此現(xiàn)象在合歡、祁州漏蘆等種子（王荷和劉燕，2011;何英虎等，2013）的研究中有報(bào)道，認(rèn)為這種炸裂與種子含水量有關(guān)系，隨著含水量的降低，發(fā)生炸裂的種子比例增加。主要原因可能是種子承受不了冷凍和化凍過(guò)程中的巨大物理壓力而導(dǎo)致（何英虎等，2013）。這種炸裂對(duì)種胚產(chǎn)生的機(jī)械損傷可能是其低發(fā)芽率的原因之一。種殼能極大地提高種子在冷凍和化凍過(guò)程中所承受的物理壓力，減緩溫度變化對(duì)種皮的直接傷害而對(duì)種子起到保護(hù)作用，如在紅水櫻桃種子超低溫保存研究中，無(wú)種殼種子污染率高，發(fā)芽率低，且苗畸形（宋常美等，2019）。本研究認(rèn)為種皮或種殼在超低溫保存中起到一定保護(hù)作用，去掉種皮的種子凍存后發(fā)芽率有所下降，且由于沒(méi)有種皮的保護(hù)，胚根和子葉的發(fā)育受到了影響，所以出現(xiàn)了形態(tài)不正常的幼苗。本研究通過(guò)降低化凍溫度，緩和化凍時(shí)種子內(nèi)部發(fā)生的熱量交換有效地緩解了種子炸裂的問(wèn)題。

總之，超低溫保存是目前為止種子資源長(zhǎng)期保存最有效的方法。種子的超低溫耐性與其脫水耐性、過(guò)冷卻能力和玻璃化能力密切相關(guān)，而這些能力又受到種子特性（如大小、頑拗性程度、含水量、種皮結(jié)構(gòu)、內(nèi)含物組分）以及冷凍、化凍方式、冷凍保護(hù)劑作用、凍后的復(fù)水、回濕、吸漲吸水及恢復(fù)培養(yǎng)等各種因素影響。本研究證實(shí)了含水量、冷凍方式、化凍方式及種皮的保護(hù)作用等對(duì)馬尾松種子凍存效果的影響，確定了最適含水量和安全含水范圍，初步建立了馬尾松種子超低溫保存技術(shù)體系，獲得了高發(fā)芽率的長(zhǎng)期保存方法，但其超低溫保存保護(hù)和損傷的機(jī)理機(jī)制仍不明確，需要進(jìn)一步從生理生化和蛋白組學(xué)等方面開(kāi)展研究。

參考文獻(xiàn)：

BASU?C，2008.?Gene?amplification?from?cryopreserved?Arabidopsis?thaliana?shoot?tips[J].?Curr?Iss?Mol?Biol，10（1-2）：55-60.

CHENG?LH，DUAN?XC，ZHANG?ZQ，et?al.，2012.?Cryopreservation?of?Chinese?Taxus?chinensis?seeds[J].?J?NW?A?&?F?Univ?（Nat?Sci?Ed），40（2）：71-78.[程利紅，段旭昌，張宗勤，等，2012.?中國(guó)紅豆杉種子超低溫保存技術(shù)研究[J].?西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），40（2）：71-78.?]

DENG?LX，LI?M，2009.?The?research?present?situation?and?prospects?on?the??Pinus?massoniana?Lamb.?plantation[J].?J?Anhui?Agric?Sci，37（7）：2968-2971.[鄧倫秀，李茂，2009.?馬尾松人工林研究現(xiàn)狀及展望[J].?安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，37（7）：2968-2971.]

HE?YH，F(xiàn)U?YQ，LIU?Y，2013.?Cryopreservation?seeds?of?Albizzia?julibrissin?and?Picea?wilsonii[J].?Seed，32（3）：33-35.[河英虎，傅伊倩，劉燕，2013.?合歡和青杄種子超低溫保存研究[J].?種子，32（3）：33-35.?]

LI?DZ，PRITCHARD?HW，2009.?The?science?and?economics?of?ex?situ?plant?conservation[J].?Trends?Plant?Sci，14（11）：614-621.

LU?L，WANG?HY，TU?Y，et?al.，2013.?Cryopreservation?of?castanopsis?delavayi?seeds[J].?J?NE?For?Univ，41（7）：6-8.[盧玲，王海英，圖雅，等，2013.?高山栲種子的超低溫保存[J].?東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，41（7）：6-8.]

MA?J，YE?RY，ZHANG?JH，2019.?Study?on?the?cryopreservation?of?Cinnamomum?camphora?presl?mature?seeds[J].?J?Anhui?Agric?Sci，47（9）：170-172.[馬健，葉潤(rùn)燕，張俊紅，2019.?樟樹(shù)成熟種子超低溫保存研究[J].?安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，47（9）：170-172.]

MARCIN?M，BEATA?P?P，TADEUSZ?T，et?al，2015.?Desiccation?tolerance?and?cryopreservation?of?seeds?of?black?poplar?（Populus?nigra?L.），a?disappearing?tree?species?in?Europe[J].?Eur?J?For?Res，134（1）：53-60.

POPOVA?EV，HYUN?KD，HEE?HS，et?al.，2012.?Narrowing?of?the?critical?hydration?window?for?cryopreservation?of?Salix?caprea?seeds?following?ageing?and?a?reduction?vigour[J].?Cryoletters，33（3）：220-231.

QIN?GF，ZHOU?ZC，et?al，2012.?Germplasm?resources?of?Chinese?masson?pine[M].?Beijing：China?Forestry?Publishing?House：18-21.[秦國(guó)峰，周志春，等，2012.?中國(guó)馬尾松優(yōu)良種質(zhì)資源[M].?北京：中國(guó)林業(yè)出版：18-21.]

QIN?GF，ZHOU?ZC，JIN?GQ，et?al.，2017a.?Seed?orchard?of?masson?pine[M].?Beijing：China?Forestry?Publishing?House：304.[秦國(guó)峰，周志春，金國(guó)慶，等，2017a.?馬尾松種子園[M].?北京：中國(guó)林業(yè)出版社：304.]

QIN?GF，ZHOU?ZC，JIN?GQ，et?al.，2017b.?Seed?orchard?of?masson?pine[M].?Beijing：China?Forestry?Publishing?House：59.[秦國(guó)峰，周志春，金國(guó)慶等，2017b.?馬尾松種子園[M].?北京：中國(guó)林業(yè)出版社：59.]

SHANG?LH，LEI?XJ，SONG?J，et?al.，2018.?Study?on?Cryopreservation?of?Panax?ginseng?split?seeds[J].?Seed，37（7）：68-70.[商麗煌，雷秀娟，宋娟，等，2018.?人參裂口種子超低溫保存技術(shù)研究[J].?種子，37（7）：68-70.]

SHI?FH，YU?FY，SHEN?YB，et?al.，2005.?Cryopreservation?of?Chinese?pine?seeds[J].?J?Nanjing?For?Univ?（Nat?Sci?Ed），29（6）：119-122.[史鋒厚，喻方圓，沈永寶，等，2005.?超低溫貯藏對(duì)油松種子的影響[J].?南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），29（6）：119-122.]

SHI?J，LUO?YQ，ZENG?FY，et?al.，2005.?Impact?of?invasion?of?pine?wood?nematode?on?the?niche?of?main?populations?in?masson?pine?community[J].?J?Beijing?For?Univ，27（6）：76-82.[石娟，駱有慶，曾凡勇，等，2005.?松材線蟲(chóng)入侵對(duì)馬尾松林主要種群生態(tài)位的影響[J].?北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，27（6）：76-82.]

SONG?CM，WEN?XP，LI?QH，2019.?Cryopreservation?of?seed?of?Prunus?pseudocerasu?L.?‘Hongshui?by?vitrification[J].?Seed，38（4）：156-158.[宋常美，文曉鵬，李慶宏，2019.?紅水櫻桃種子玻璃化超低溫保存[J].?種子，38（4）：156-158.]

SUN?HY，CAI?KX，WU?ZY，et?al.，1994.?Long-term?seed?storage?of?eight?main?forest?species?（Cunninghamia?lanceolata，Pinus?massoniana，etc.）?in?southern?China[J].?J?ZheJiang?For?Coll，11（3）：223-234.[孫鴻有，蔡克孝，吳祖映，等，1994.?杉木馬尾松等南方8個(gè)主要造林樹(shù)種種子長(zhǎng)期貯藏[J].?浙江林學(xué)院學(xué)報(bào)，11（3）：223-234.]

TAN?J，2009.?Studies?on?physiological?changes?of?Cunninghamia?lanceolata?and?Pinus?massoniana?seeds?during?storage[D].?Nanjing：Nanjing?Forestry?University：1-88.[譚俊，2009.?杉木、馬尾松種子貯藏過(guò)程中的生理變化研究[D].?南京：南京林業(yè)大學(xué)：1-88.]

TRAJKOVIC'M，ANTONIC'D，CINGEL?A，et?al，2019.?Advancement?in?protocol?for?in?vitro?seed?germination，plant?regeneration?and?cryopreservation?of?Viola?cornuta[J].?Biotechnology，?9（1）：1-10.

VERTUCCI?CW，1989.?Relationship?between?thermal?transitions?and?freezing?injury?in?pea?and?soybeans[J].?Plant?Physiol，90（3）：1121-1128.

WALTERS?C，WHEELER?L，STANWOOD?P?C，2004.?Longe-vity?of?cryogenically?stored?seeds[J].?Cryobiology，48（3）：229-244.

WANG?BSP，SIMPSON?JD，2006.?Factors?affecting?tree?seed?storage[J].?J?Nanjing?For?Univ?（Nat?Sci?Ed），30（1）：1-7.

WANG?H，LIU?Y，2011.?Study?on?cryopreservation?of?25?kinds?of?wildflower?species?seeds[J].?Seed，30（4）：80-82.[王荷，劉燕，2011.?25種野生花卉種子超低溫保存研究[J].?種子，30（4）：80-82.?]

WEN?B，2011.?An?introduction?to?cryopreservation?of?plant?germplasm[J].?Plant?Diver?Resour，33（3）：311-329.[文彬，2011.?植物種質(zhì)資源超低溫保存概述[J].?植物分類(lèi)與資源學(xué)報(bào)，33（3）：311-329.]

WILDE?M，2015.?Cryopreservation?modern?insights[M].?New?York，USA：Callisto?Reference：97.

YANG?XJ，2008.?Studies?on?seed?glass?tansition?and?cryopreservation?of?three?coniferous?species[D].?Nanjing：Nanjing?Forestry?University：1-82.[楊學(xué)軍，2008.?三個(gè)針葉樹(shù)種種子玻璃與超低溫保存研究[D].?南京：南京林業(yè)大學(xué)：1-82.]

YANG?ZQ，2012.?Genetic?improvement?of?key?wood?and?resin?properties?of?Pinus?massoniana?Lamb[D].?Beijing：Beijing?Forestry?University：1-11.[楊章旗，2012.?馬尾松材性與產(chǎn)脂性狀遺傳改良研究[D].?北京：北京林業(yè)大學(xué)：1-11.?]

YU?FY，SHAO?L，SHEN?YB，2006a.?Studies?on?physiological?and?biochemical?changes?of?Chinese?fir?and?masson?pine?seeds?during?storage[J].?Sci?Silv?Sin，42（12）：137-142.[喻方圓，?邵嵐，沈永寶，2006a.?杉木、馬尾松種子貯藏過(guò)程中生理生化變化研究[J].?林業(yè)科學(xué)，42（12）：137-142.]

YU?FY，SHAO?L，CHEN?SF，2006b.?A?comparison?on?cytoplasmic?vitrification?and?freezing?point?of?Chinese?fir?and?masson?pine?seeds[J].?J?Nanjing?For?Univ（Nat?Sci?Ed），30（5）：1-4.[喻方圓，邵嵐，陳淑芬，等，2006b.?杉木、馬尾松種子細(xì)胞質(zhì)凍結(jié)和玻璃化的比較[J].?南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，30（5）：1-4.]

The?State?Bureau?of?Quality?and?Technical?Supervision，2000.?Forest?seed?inspection?regulations?（GB2772-1999）[S].?Beijing：China?Standard?Publishing?House：10-15.[國(guó)家質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局，?2000.?林木種子檢驗(yàn)規(guī)程?（GB2772-1999）[S].?北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社：10-15.]

ZENG?L，HE?MJ，CHEN?K，et?al.，2014.?Study?on?cryopreservation?of?Alpinia?officinarum?Hance?seeds[J].?Chin?Agric?Sci?Bull，30（28）：164-168.[曾琳，何明軍，陳葵，等，2014.?高良姜種子超低溫保存研究[J].?中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，30（28）：164-168.]

ZENG?L，WU?Y，HE?MJ，et?al.，2018.?Physiological?and?biochemical?characteristics?of?Alpinia?oxyphylla?seeds?after?cryopreservation[J].?Guihaia，38（4）：529-535.[曾琳，吳怡，何明軍，等，2018.?超低溫冷凍對(duì)益智種子生理生化特性的影響[J].?廣西植物，38（4）：529-535.]

ZHANG?JM，ZHANG?XN，LU?XX，et?al.，2014.?Optimization?of?droplet-vitrification?protocol?for?carnation?genotypes?and?ultrastructural?studies?on?shoot?tips?during?cryopreservation[J].?Acta?Physiol?Plant，36（12）：3189-3198.

（責(zé)任編輯?蔣巧媛）