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    解淀粉芽孢桿菌抑菌肽的分離鑒定及其抑菌譜表征

    2020-08-26 03:49:44姚佳明田亞平
    食品科學(xué) 2020年16期
    關(guān)鍵詞:抗菌肽質(zhì)譜培養(yǎng)基

    姚佳明,田亞平*

    (江南大學(xué)生物工程學(xué)院,江蘇 無錫 214122)

    抑菌肽是廣泛存在于自然界生物體中的一類小分子肽,是人或動物先天免疫系統(tǒng)的重要組成部分[1]。抑菌肽具有抑菌活性強、抑菌譜廣、穩(wěn)定性高、種類繁多、不產(chǎn)生抗藥性,對動物、人體的正常細(xì)胞無毒無害等優(yōu)點[2],近年來成為動物飼料加工、食品防腐劑、生物防治、醫(yī)藥研發(fā)等領(lǐng)域研究的熱點。抗菌肽主要來源于微生物、植物、動物[3-4],其中微生物來源的抗菌肽因資源豐富、生長周期短、代謝快等優(yōu)點,為目前研究開發(fā)的重點。

    屬于生防菌株的解淀粉芽孢桿菌(B a c i l l u s amyloliquefaciens),可強烈抑制多種病原真菌,如番茄青枯病菌[5]、蘆筍莖枯病菌[6]、水稻紋枯病菌[7],及多種細(xì)菌的生長,目前被廣泛用于飼料添加[8]、食品防腐[9]、生物防治、污水治理[10-11]等領(lǐng)域。近年來,已有許多學(xué)者對B. amyloliquefaciens發(fā)酵產(chǎn)物中抑菌活性成分進行分離分析研究。Wong[12]和Arrebola[13]等分別從B. amyloliquefaciens發(fā)酵產(chǎn)物中分離出可抑制肝癌、結(jié)腸癌細(xì)胞生長的蛋白質(zhì)及具有抑制病原真菌作用的IturinA脂肽。An Junying等[14]從B. amyloliquefaciensZJHD3-06發(fā)酵產(chǎn)物中分離出分子質(zhì)量為20 kDa、對食物腐敗菌有抑制作用的細(xì)菌素CAMT2。桑建偉等[15]用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)判斷B. amyloliquefaciensBEB17是否含有脂肽類和聚酮類物質(zhì)的合成基因,結(jié)合質(zhì)譜法分析,已明確證明菌株可分泌Surfactin、Fengycin和Iturin三類脂肽,及Bacillibactin、Difficidin和Bacillaene三類聚酮類物質(zhì)。目前分離得到的抑菌肽大多具有分子質(zhì)量小、帶正電、兩性親和等特點[16],如何高效的分離、純化微生物產(chǎn)生的具有高抑菌活性的物質(zhì)已成為研究熱點。

    前期通過誘變及培養(yǎng)基配方優(yōu)化,使B. amyloliquefaciens發(fā)酵液的抑菌物質(zhì)活性大幅度提高[17]。在此基礎(chǔ)上,本實驗以B. amyloliquefaciens發(fā)酵液作為原料,以金黃色葡萄球菌作為指示菌,對發(fā)酵液中抑菌活性成分進行多步分離純化,并對抑菌活性較高的成分進行鑒定及抑菌譜的表征,以期為新型抗菌肽的不斷開發(fā)提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    1.1.1 菌種

    B. amyloliquefaciens、大腸桿菌(E. coli)JM 109、枯草芽孢桿菌(B. subtilis)WB 600均為本實驗室保存;腸炎沙門氏菌(Salmonella enteritidis)BNCC 103134、單核細(xì)胞性李斯特菌(Listeria monocytogenes)CICC 336877 北納生物菌種保藏管理中心;金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)ATCC 29213 中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

    1.1.2 培養(yǎng)基

    種子培養(yǎng)基:蛋白胨10 g/L、酵母粉10 g/L、葡萄糖40 g/L、MgSO4·7H2O 1 g/L、CaCO310 g/L,pH 7; 發(fā)酵培養(yǎng)基:麥芽糖10 g/L、蛋白胨15 g/L、MgSO4·7H2O 2 g/L、CaCO310 g/L、瓊脂20 g/L(固體培養(yǎng)基添加),pH 7;LB培養(yǎng)基:酵母粉5 g/L、NaCl 10 g/L、蛋白胨10 g/L、瓊脂20 g/L(固體培養(yǎng)基添加),pH 7。

    1.1.3 試劑

    流動相試劑均為色譜純。

    1.2 儀器與設(shè)備

    ?KTA avant蛋白純化系統(tǒng) 美國GE公司;1525 EF半制備型反相高效液相色譜(reverse phasehigh performance liquid chromatography,RP-HPLC)系統(tǒng)、MALDI SYNAPT MS液相色譜-質(zhì)譜(liquid chromatograph-mass spectrometry,LC-MS)系統(tǒng)美國Waters公司;CF15RN立式冷凍離心機 日本Hitachi公司;0.22 μm水相濾膜 上海弗立特實業(yè)有限公司;Enspire 2300多功能酶標(biāo)儀 珀金埃爾默有限公司。

    1.3 方法

    1.3.1 蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度測定

    用二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)試劑盒測定多肽及蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度,以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白,測定并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,測定范圍為25~2 500 μg/mL。

    1.3.2 抑菌圈測定

    參考石慧等[18]對放線菌抑菌活性的檢測方法,對其進行改良。無菌平板內(nèi)放置3 枚內(nèi)徑為7 mm的無菌牛津杯,取生長對數(shù)期的指示菌菌液,加入預(yù)冷至40 ℃的固體LB培養(yǎng)基中,使指示菌的終濃度為107CFU/mL,倒平板,冷卻后,取出牛津杯,每孔加入100 μL,BCA質(zhì)量濃度為1 mg/mL的抑菌劑。4 ℃擴散1 h后,37 ℃培養(yǎng)24 h,用游標(biāo)卡尺測抑菌圈直徑,求平均值。

    1.3.3 抑菌率測定

    取100 μL BCA質(zhì)量濃度為1 mg/mL的抑菌劑與100 μL菌濃度為108CFU/mL的指示菌菌懸液混合均勻,37 ℃培養(yǎng)24 h,用酶標(biāo)儀在600 nm波長處測定吸光度。等量無菌LB液體培養(yǎng)基代替抑菌劑作對照,抑菌率計算公式如下:

    式中:A1為實驗組的吸光度;A0為對照組的吸光度。

    1.3.4 抑菌物質(zhì)的純化鑒定及抑菌譜表征

    1.3.4.1 抑菌物質(zhì)粗提液的制備

    從B. amyloliquefaciens的固體平板上挑取單菌落,接種于種子培養(yǎng)基,37 ℃、150 r/min培養(yǎng)9 h后以接種量2%(體積分?jǐn)?shù))接種于發(fā)酵培養(yǎng)基,相同條件下培養(yǎng)24 h,4 ℃、8 000 r/min離心20 min,用0.22 μm無菌濾膜對上清液過濾除菌,緩慢滴加6 mol/L HCl溶液,不斷攪拌至pH 2,4 ℃過夜保存,4 ℃、8 000 r/min離心20 min,棄上清液,用等量的無菌水重懸沉淀,用2 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH 7。冷凍干燥后,用三氯甲烷-甲醇(3∶1,V/V)的多次萃取,40 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)有機溶劑,得到黃色晶體。測定BCA質(zhì)量濃度并檢測抑菌活性。

    1.3.4.2 DEAE-Sepharose-Fast Flow陰離子交換層析

    用少量甲醇溶解1.3.4.1節(jié)粗提樣品,用濾膜除菌,色譜柱:DEAE-Sepharose-Fast Flow陰離子色譜柱,流動相:A為20 mmol/L,pH 8的Tris-HCl緩沖液;B為1 mol/L NH4HCO3的Tris-HCl緩沖液;進樣量5 mL,檢測波長2 20 nm。用3 倍柱體積的流動相A洗脫后,用0%、60%、80%、100%體積分?jǐn)?shù)的流動相B進行梯度洗脫,按峰收集,濃縮除鹽后測定每個收集液的蛋白濃度并檢測抑菌活性。

    1.3.4.3 RP-HPLC分析

    取1.3.4.2節(jié)分離得到的樣品溶于少量甲醇中,用濾膜除菌。色譜條件:Waters XBridge Prep C18色譜柱(10 mm×250 mm,5 μm),流動相A:含0.1%三氟乙酸(trifluoroacetic acid,TFA)的乙腈,流動相B:含0.1% TFA的超純水,流速0.5 mL/min,檢測波長220 nm,進樣量0.5 mL。用流動相B平衡3 倍柱體積,選擇線性洗脫方式,按峰收集,除去有機溶劑后,測定蛋白質(zhì)量濃度并檢測抑菌活性。

    1.3.4.4 LC-MS檢測

    收集抑菌活性較高的分離峰,用濾膜過濾除菌。層析柱:BEH C18(2.1 mm×50 mm,1.7 μm),流動相A:含0.1% TFA的乙腈,流動相B:含0.1% TFA的超純水,流速0.3 mL/min,進樣量5 μL,檢測波長220 nm,柱溫45 ℃,梯度洗脫程序:0~3 min,5% A、95% B;3~15 min,5%~95% A、95%~5% B;15~17 min,95%~100% A、5%~0% B;17.1 min,5% A、95% B。分離峰被注入MALDI SYNAPT MS LC-MS系統(tǒng),采用電噴霧電離正離子模式,獲得信號峰的質(zhì)譜圖。

    1.3.4.5 Surfactin與6肽的抑菌譜測定

    配制BCA質(zhì)量濃度為1 mg/mL的Surfactin與6肽的抑菌液,選取枯草芽孢桿菌、單核細(xì)胞性李斯特菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、腸炎沙門氏菌,根據(jù)1.3.2節(jié)方法,測定抑菌圈。

    1.4 數(shù)據(jù)處理

    實驗均重復(fù)3 次,采用Origin 8.5軟件處理數(shù)據(jù)。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 DEAE-Sepharose-Fast Flow陰離子交換層析分離

    如圖1a所示,收集得到A、B、C、D四個峰,測定每個峰的抑菌圈直徑和抑菌率,由圖1b可知,洗脫液中NH4HCO3濃度為0.6 mol/L時,所對應(yīng)的洗脫峰B檢測出抑菌圈,抑菌直徑為(19.2±0.3)mm,抑菌率為61.25%,由此判斷洗脫峰B為活性峰,對其進一步分離。

    圖1 DEAE陰離子交換層析圖譜(a)及其抑菌效果(bb)Fig. 1 Separation of bioactive substances by DEAE anion ion exchange chromatography (a) and their antibacterial activity (b)

    2.2 RP-HPLC層析分離

    圖2 RP-HPLC層析圖譜(a)及其抑菌效果(bb)Fig. 2 RP-HPLC chromatogram of peak B as shown in Fig. 1 (a) and antibacterial activity of its components (b)

    采用RP-HPLC對離子交換層析得到的活性峰進一步分離,結(jié)果如圖2a所示,收集共10 個洗脫峰,編號為A~J,測定各個峰的抑菌活性,如圖2b所示,當(dāng)乙腈體積分?jǐn)?shù)為30%~40%時,對應(yīng)洗脫峰D的抑菌活性最高,抑菌直徑為(18.0±0.2)mm,抑菌率為57.62%;當(dāng)乙腈體積分?jǐn)?shù)為45%~55%時,對應(yīng)洗脫峰F的抑菌活性次之,抑菌直徑(16.2±0.3)mm,其抑菌率為48.35%,其他收集峰未檢測出抑菌圈。由此得到2 種純化產(chǎn)物,對其進一步質(zhì)譜分析。

    2.3 多步分離純化的抑菌活性比較

    圖3 分離純化活性峰的抑菌直徑Fig. 3 Diameters of inhibition zone of S. aureus when exposed to the fermentation supernatant of B. amyloliquefaciens and antibacterial components puri fied from it

    B. amyloliquefaciens菌株發(fā)酵上清液通過酸沉、有機溶劑萃取、DEAE陰離子交換層析、半制備型RP-HPLC,最終得到兩個抑菌活性較高的分離峰。抑菌劑的多肽質(zhì)量濃度都均為1 mg/mL,以純甲醇為對照,對比抑菌圈直徑,由圖3可見,抑菌活性從大到小為:酸沉有機溶劑萃?。?8.1±0.3)mm>發(fā)酵上清液(25.4±0.2)mm>離子交換層析峰B(19.2±0.3)mm>RP-HPLC峰D(18.0±0.2)mm>RP-HPLC峰F(16.2±0.3)mm。據(jù)報道B. amyloliquefaciens發(fā)酵液中含有多種抑菌成分,通過分離純化得到純度相對較高的兩種抑菌成分,與同質(zhì)量濃度的粗提成分相比,發(fā)現(xiàn)抑菌活性反而降低,分析除純化過程中部分抑菌活性可能有所損失外,推測多種抑菌成分并存時,可能還存在協(xié)同抑菌或聯(lián)合抑菌效果。

    2.4 LC-MS分析

    2.4.1 活性峰D的質(zhì)譜分析

    利用LC-MS對活性峰D分析,由圖4可見,主要信號峰出現(xiàn)在6.57、7.09、7.40 min,對3 個信號峰進行質(zhì)譜分析,通過主要信號峰的積分面積,計算3 種脂肽同系物的純度為93.78%。如圖5所示,3 種[M+H]+的m/z分別為1 008.8、1 022.8、1 036.8的信號峰,它們的分子質(zhì)量相差14 Da,與CH2的分子質(zhì)量大小一致,說明相差一個脂肪酸鏈。分析三者的二級質(zhì)譜圖,圖5中m/z為441.2是y型碎片離子峰,可解釋為[Val-Asp-Leu-Leu/Ile+H]+;其中m/z686.3的信號最強,為y型碎片離子峰,分析該碎片為[Leu-Leu-Val-Asp-Leu-Leu/Ile+H2O+H]+。其中[M+H]+的m/z值為1 008.8的二級質(zhì)譜中m/z1 009.5-686.3=323.2,代表b型碎片離子,解釋為[R13-Glu-H2O+H]+,同理,[M+H]+的m/z為1 022.8與1 036.8的二級質(zhì)譜中,1 023.5-686.3=337.2代表[R14-Glu-H2O+H]+,1 037.5-686.3=351.2代表[R15-Glu-H2O+H]+。與黎循航[19]、向亞平等[20]報道的Surfactin[M+H]+的m/z吻合,與Chen Yulin等[21]報道的Surfactin二級質(zhì)譜碎片符合,由此確定活性峰D主要為含有C13~C15三種脂肽Surfactin的同系物。

    圖4 活性峰D的色譜圖Fig. 4 Chromatogram of bioactive peak D as shown in Fig. 2

    圖5 主要信號峰的二級質(zhì)譜圖Fig. 5 Tandem mass spectra of the main signal peaks as shown in Fig. 4

    2.4.2 活性峰F的質(zhì)譜分析

    對活性峰F進行LC-MS分析,由圖6可見,主要信號峰出現(xiàn)在10.52 min,此峰所占的峰面積為95.46%,此信號峰對應(yīng)二級質(zhì)譜圖中的母離子[M+H]+為m/z640.3。利用MassLynx V4.1軟件對二級質(zhì)譜中的特征碎片峰分析,結(jié)果如圖7所示,預(yù)測活性峰F是由6 個氨基酸組成的小肽,序列為L-V-N-P-P-T。借助ExPasy中的ProtParam軟件,在線分析該抑菌肽的分子質(zhì)量為639.75 Da,分子式為C29H49N7O9,等電點為5.52,GRAVY為0.100,脂溶性指數(shù)113.33。將此多肽在NCBI、APD數(shù)據(jù)庫進行同源性分析,結(jié)果如表1所示,發(fā)現(xiàn)與APD數(shù)據(jù)庫中已報道抑菌肽的同源相似性較低,與來自鏈霉菌屬的抗菌肽,APD ID為AP02577的氨基酸序列的同源性最高,為37.5%。由此推斷,此6肽為一種新型抗菌肽。

    圖6 活性峰F的色譜圖Fig. 6 Chromatograms of bioactive peak F as shown in Fig. 2

    圖7 活性峰F的質(zhì)譜圖Fig. 7 Mass spectrum of bioactive peak F as shown in Fig. 2

    表1 6肽與APD數(shù)據(jù)庫中已知的抗菌肽對比Table 1 Comparison between the hexapeptide and known antibacterial peptides in the APD database

    2.5 兩種純化肽的抑菌譜表征

    Surfactin與該6肽對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌都有抑菌效果,如表2所示。Surfactin對金黃色葡萄球菌、單核細(xì)胞性李斯特菌、大腸桿菌、腸炎沙門氏菌的抑制活性高于6肽。兩種抑菌肽對金黃色葡萄球菌、腸炎沙門氏菌、單核細(xì)胞性李斯特菌的抑制活性均較好。

    表2 兩種純化肽的抑菌譜表征Table 2 Antibacterial spectra of the two puri fied peptides

    3 結(jié)論與討論

    從B. amyloliquefaciens發(fā)酵上清液出發(fā),通過酸沉、有機溶劑萃取,DEAE陰離子交換層析,結(jié)合制備型RP-HPLC,收集到抑菌活性較高的2 個洗脫峰。對2 種純化產(chǎn)物進行LC-MS分析,由二級質(zhì)譜中的特征離子碎片,結(jié)合文獻[21-22]報道及MassLynx V4.1軟件分析,明確純化產(chǎn)物為含有C13~C15脂肪酸鏈的Surfactin同系物與氨基酸序列為L-V-N-P-P-T,分子質(zhì)量為639.75 Da的抑菌肽。將6肽的氨基酸序列與APD數(shù)據(jù)庫中已報道的抑菌肽進行同源性比較,其中同源性最高的僅為37.5%,由此推斷,此6肽為新型抗菌肽。鑒于Surfactin與6肽對金黃色葡萄球菌、腸炎沙門氏菌、單核細(xì)胞性李斯特菌3 種致病菌的生長均有較強的抑制作用,可將其應(yīng)用于肉類、奶制品等食品防腐劑或飼料添加劑中。

    Surfactin最早發(fā)現(xiàn)于芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)物,屬于環(huán)脂肽類抑菌物質(zhì)。Surfactin由7 個氨基酸和含有C13~C15的脂肪酸鏈組成[23],兼?zhèn)鋬尚晕镔|(zhì)的特點,分子質(zhì)量小,抗逆性強,具有抗腫瘤、真菌、支原體、病毒的功效[24]。近年來被廣泛應(yīng)用于食品、化妝品、醫(yī)藥等領(lǐng)域。目前認(rèn)為,Surfactin的抑菌作用是通過使敏感細(xì)胞膜上的?;湴l(fā)生傾斜,磷脂基團重定向于細(xì)胞膜內(nèi)部[25],導(dǎo)致Surfactin的肽段插入細(xì)胞膜,從而有效破壞細(xì)胞膜滲透性及完整性[26-27]。

    純化得到的6肽疏水性較強,具有分子質(zhì)量小、合成簡單的優(yōu)點。結(jié)合疏水性較強的肽類可在體外與敏感細(xì)菌的DNA結(jié)合的報道[28],推測該6肽穿過細(xì)胞膜后,可與細(xì)菌DNA雙螺旋內(nèi)部的疏水區(qū)結(jié)合,干擾細(xì)菌DNA的轉(zhuǎn)錄、復(fù)制、翻譯,影響細(xì)胞正常分裂。

    在分離過程中發(fā)現(xiàn)菌株代謝產(chǎn)生多種抑菌物質(zhì),隨著單一抑菌成分純度提高,發(fā)現(xiàn)抑菌物質(zhì)的活性提升并不顯著。目前,已發(fā)現(xiàn)鼠李糖脂與乳酸菌素Nisin可協(xié)同抑制李斯特菌[29],ε-葡萄素與萬古霉素可協(xié)同抑制金黃色葡萄球菌[30-31]。由此推測,B. amyloliquefaciens發(fā)酵液中多種抑菌物質(zhì)之間可能也存在協(xié)同或者聯(lián)合抑菌作用。新型抑菌肽的抑菌機理及可能的協(xié)同或聯(lián)合抑菌作用有待進一步的研究。

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