硫化物脅迫對刺參(Apostichopus japonicus)幼參的急性毒性效應(yīng)及抗氧化防御系統(tǒng)的影響

王昕宇,陶文卿,呂慧超,李秉鈞,趙 業(yè)

(煙臺大學海洋學院,山東 煙臺 264005)

刺參(Apostichopusjaponicus)隸屬于棘皮動物門(Echinodermata),海參綱(Holothuuroidea),楯手目(Aspidochirota),刺參科(Stichopodidae)[1]．刺參營底棲生活,加之行動遲緩,因而十分容易受到底質(zhì)中氨氮和硫化物等有害物質(zhì)的脅迫[2]．硫化物廣泛存在于自然水體和養(yǎng)殖水體及其沉淀物和底泥中,主要存在形式包括H2S、HS-和S2-．在實際的養(yǎng)殖生產(chǎn)中,硫化物很難被準確測量,但其對水生動物的養(yǎng)殖卻時刻存在著重大威脅[3]．硫化物對水生生物的毒性主要表現(xiàn)在抑制有氧呼吸、降低免疫力、影響攝食等[4]．硫化物脅迫也會造成動物體內(nèi)活性氧增加,并引起其抗氧化能力的改變[5]．動物體通過體內(nèi)的抗氧化防御系統(tǒng)清除體內(nèi)多余的活性氧．目前,有關(guān)硫化物對水生生物的毒性研究主要集中在魚類、蝦類、單環(huán)刺螠等物種上[6-8],對棘皮動物尤其是刺參的毒性及其抗氧化防御機制影響的研究鮮有報道．

本研究以刺參幼參為研究對象,通過為期4 d的急性硫化物脅迫對刺參幼參的急性毒性實驗,得出半致死濃度和安全濃度,并測定在2個亞致死濃度硫化物脅迫下刺參幼參腸道組織中主要抗氧化防御酶活性的變化,旨在探討其對硫化物的耐受力和抗氧化防御系統(tǒng)的適應(yīng),為刺參養(yǎng)殖水體環(huán)境的有效調(diào)控和刺參健康養(yǎng)殖提供參考．

1 材料與方法

1.1 供試動物

試驗刺參幼參平均體質(zhì)量5.00±0.24 g,平均體長5.00±0.50 cm,選自刺參幼參購于煙臺東方海洋科技股份有限公司,為人工繁殖飼養(yǎng)5個月齡的幼參．幼參在室內(nèi)50 L塑料箱內(nèi)暫養(yǎng)7 d,暫養(yǎng)期間日換水1次,隔日投喂餌料1次．試驗開始1 d前停止投喂餌料,隨機分組用于試驗．試驗海水取自煙臺近海,砂濾除雜質(zhì),pH值為7.51,溶氧量為7.64 mg/L,鹽度為31.83,置于消毒玻璃缸中待用．

1.2 試驗設(shè)計

1.2.1 急性毒性試驗 參照《水生生物檢測手冊》中靜水毒性試驗法[9],先根據(jù)預實驗結(jié)果確定出硫化物的試驗濃度范圍,由預實驗所得濃度范圍依據(jù)等對數(shù)間距法計算,設(shè)置刺參幼參急性實驗的質(zhì)量濃度(0、2、2.378、2.828、3.363、4 mg/L)，每種濃度設(shè)置3個平行．硫化物以母液(10 mmol/L Na2S·9H2O, 1 mol/L HCl調(diào)pH值至6.9)的形式加入各實驗組水體中．

在室溫下采取靜水試驗法,每個2 L燒杯中放入12頭刺參,燒杯密封,試驗期間,不投喂不充氣,保持水溫為16.5±1.5 ℃,每隔2 h(根據(jù)硫化物濃度變化實驗可知硫化物在2 h內(nèi),濃度變化不大[8])補充1次硫化物(添加值由初始濃度和實測濃度的差值算得),維持硫化物濃度為原始預設(shè)濃度,每隔24 h全量換水1次．本實驗中采取的硫化物測定方法是亞甲基藍分光光度法,此方法檢出限為2.5 μmol/L[10]．試驗期間,每隔4 h觀察一次幼參狀態(tài),并記錄掛壁個數(shù)和死亡個數(shù),幼參死亡的判定以沉入燒杯底部、管足無吸附能力、對輕微刺激無反應(yīng)、放入自然海水不能復活為準[11],及時清除死亡個體,保證水質(zhì)免受污染．

各試驗組取3個平行組的平均值計算死亡率和附壁率．附壁率(RA)是用來評價幼參附著能力和活動情況的參數(shù),按公式RA=100%×NA/12計算,式中NA為附著在燒杯壁上的幼參數(shù)．采用SPSS 20.0軟件Probit回歸分析,用概率單位法做出濃度對數(shù)-概率單位線性方程,并計算出硫化物對刺參的24 h、48 h、72 h、96 h的半致死濃度(LC50)及95%置信區(qū)間．安全濃度(SC)計算公式:SC=96 hLC50×0.1[12]．

1.2.2 亞致死毒性試驗 根據(jù)預實驗結(jié)果,設(shè)0.8 mg/L(低濃度組)和1.6 mg/L(高濃度組)2個硫化物組,以自然海水為空白對照組,每個實驗組設(shè)2個平行．在每個25 L圓柱形塑料桶中放入30頭刺參,試驗期間密封,不充氣,每隔24 h投餌．根據(jù)預實驗硫化物濃度變化,為維持各實驗組硫化物初始濃度,每隔2 h添加硫化物母液1次．每隔24 h全量換水1次．試驗開始后的第24、48、72、96小時進行取樣．每次從每個平行中隨機選取5頭刺參作為樣本．取樣后用0.9%的生理鹽水沖洗刺參體表,用滅菌后的濾紙吸干體表水分,在滅菌的冰培養(yǎng)皿上迅速解剖刺參．取腸道置入凍存管中放入液氮中暫存．

1.2.3 酶活性測定 取0.1 g刺參腸道組織,加入1 mL的勻漿介質(zhì)(0.01 mol/L Tris, 0.1 mmol/L EDTA-2Na, 0.01 mol/L 蔗糖,0.8% NaCl, pH值調(diào)至7.4)．冰浴條件下,勻漿機充分勻漿后,4 ℃、1 000 r/min離心20 min．取上清液至于-20 ℃保存?zhèn)溆茫?/p>

超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、總抗氧化能力(T-AOC)、總谷胱肝肽(GSSG+GSH)和總蛋白含量采用碧云天生物技術(shù)有限公司的試劑盒進行測定．SOD活性測定采用黃嘌呤氧化酶法,在黃嘌呤氧化酶偶聯(lián)反應(yīng)體系中抑制百分率為50%時,反應(yīng)體系中的SOD酶活力定義為一個酶活力單位;CAT活力單位定義為:在25 ℃,pH 7.0條件下,在1 min內(nèi)催化分解1 μmol H2O2所需CAT的量定義為一個酶活力單位(U)．SOD和CAT的活性單位為U/mg．T-AOC測定結(jié)果用mmol/g表示．GSSG+GSH含量測定結(jié)果用nmol/mg表示．

2 結(jié) 果

2.1 硫化物對刺參幼參的急性毒性致死效應(yīng)

2.1.1 硫化物對刺參幼參死亡率的影響 硫化物對刺參幼參的急性致死效應(yīng)如圖1所示,結(jié)果表明對照組無一個體死亡,而各硫化物脅迫實驗組個體均有不同程度的死亡,且死亡率隨著硫化物濃度和脅迫時間的增加而不斷升高．各時間段濃度對數(shù)與概率單位的回歸方程如表1所示,通過實驗數(shù)據(jù)計算出硫化物脅迫下刺參幼參的LC50及相應(yīng)95%置信區(qū)間．刺參幼體在硫化物中暴露的24 h、48 h、72 h和96 h的LC50分別為4.397、3.769、3.001、2.678 mg/L,SC為 0.267 8 mg/L．

2.1.2 硫化物對刺參幼參附壁率的影響 如圖2所示,在硫化物暴露下刺參幼參的附壁率隨硫化物處理時間和硫化物濃度的增加而降低．試驗期間,對照組刺參幼參的附壁率為100%．高濃度硫化物在短時間雖未造成刺參大規(guī)模死亡,但附壁率幾乎為0．這說明高濃度硫化物會極大抑制刺參活力．

2.1.3 硫化物對刺參幼參狀態(tài)的影響 在低濃度的硫化物暴露下,少量刺參從瓶壁上脫落至瓶底．隨著暴露時間和硫化物濃度的增加,刺參開始出現(xiàn)口器張開、搖頭晃尾甚至局部腫脹．隨著硫化物濃度繼續(xù)升高,刺參出現(xiàn)吐腸、化皮現(xiàn)象乃至死亡(圖3)．

表1 硫化物對刺參幼參急性毒性作用及安全濃度分析

2.2 硫化物對刺參幼參腸道組織抗氧化防御系統(tǒng)的影響

2.2.1 刺參腸道總抗氧化能力變化 刺參腸道總抗氧化能力T-AOC變化趨勢如圖4(a)所示,在硫化物暴露下,低濃度組T-AOC略高于對照組,與對照組差異性不大．硫化物暴露至24 h時,高濃度硫化物處理組T-AOC顯著高于對照組(P<0.05),是對照組的1.43倍．硫化物暴露至48 h,高濃度硫化物處理組T-AOC下降至對照組的1.15倍,與對照組差異不明顯．硫化物暴露至72 h,高濃度硫化物處理組略低于對照組,差異不明顯．硫化物暴露至96 h時,高濃度硫化物處理組 T-AOC顯著低于對照組(P<0.05),下降至對照組的82%．

2.2.2 刺參腸道超氧化物歧化酶活性變化 刺參腸道超氧化物歧化酶SOD活性變化趨勢如圖4(b)所示,硫化物暴露24 h時,低濃度硫化物處理組和高濃度硫化物處理組SOD活性稍高于對照組,差異不顯著．硫化物暴露至48 h時,低濃度硫化物處理組SOD活性顯著高于對照組(P<0.05),為對照組的1.2倍．硫化物暴露至72 h時,低濃度硫化物處理組和高濃度硫化物處理組均顯著高于對照組(P<0.05),約為對照組的1.21倍．硫化物暴露72 h至96 h,低濃度硫化物處理組和高濃度硫化物處理組SOD活性變化不大,均約為對照組的1.2倍．

2.2.3 刺參腸道過氧化氫酶活性變化 刺參腸道過氧化氫酶活性變化趨勢如圖4(c)所示,在硫化物暴露24 h至96 h,低濃度硫化物處理組和高濃度硫化物處理組CAT活性隨時間不斷上升．其中,硫化物暴露24 h時,低濃度硫化物處理組和高濃度硫化物處理組CAT活性均稍高于對照組,差異不顯著．硫化物暴露至48 h,高濃度硫化物處理組CAT活性顯著高于對照組(P<0.05),為對照組的1.19倍．硫化物暴露至72 h,低濃度硫化物處理組和高濃度硫化物處理組CAT活性均顯著高于對照組(P<0.05),分別為對照組的1.19倍和1.28倍．硫化物暴露至96 h時,低濃度硫化物處理組和高濃度硫化物處理組均約為對照組的1.29倍,差異顯著(P<0.05)．

2.2.4 刺參腸道總谷胱肝肽含量變化 刺參腸道總谷胱甘肽GSSG+GSH含量變化趨勢如圖4(d)所示,高濃度硫化物處理組總谷胱甘肽含量在24 h至96 h間持續(xù)上升．其中暴露24 h、48 h、72 h和96 h時,高濃度組總谷胱甘肽含量均顯著高于對照組(P<0.05),分別為對照組1.8、2.2、2.8和3倍．低濃度組總谷胱甘肽含量在2 h至96 h間也持續(xù)上升,上升趨勢比高濃度組緩慢．其中,硫化物暴露24 h和48 h時,低濃度組總谷胱甘肽含量稍高于對照組,差異不明顯．在硫化物暴露72 h和96 h,低濃度組總谷胱甘肽含量顯著高于對照組(P<0.05),分別為對照組的1.4倍和1.7倍．

3 討 論

3.1 硫化物對刺參幼參的急性毒性

硫化物的危害一方面表現(xiàn)為硫化氫具有強烈的毒性,另一方面硫化物耗氧力強,容易導致水體缺氧．國家海水水質(zhì)標準規(guī)定海水硫化物 (以S計)濃度應(yīng)小于0.05 mg/L才達到對海洋生物幼體安全的濃度．然而,硫化物對不同種類生物的毒性效應(yīng)差異較大,如對羅氏沼蝦幼蝦Macrobrachiumrosenbergii96 hLC50為2.57～4.20 mg/L[6];對北美底鳉Fundulusparvipinnis96 hLC50為22.4 mg/L[7];對30～50 mm的紫貽貝Mytilusedulis96 hLC50為 50 mg/L[13];對中華絨毛蟹Eriocheirsinensis96 hLC50為3.09 mg/L[4];對日本沼蝦Macrobrachiumnipponense96 hLC50為11.35 mg/L[5]．本試驗刺參對硫化物96 hLC50為2.678 mg/L,表明刺參與其他水生生物相比,其對硫化物的耐受力比較弱．硫化物對刺參幼參的SC為0.267 8 mg/L,因此建議生產(chǎn)上應(yīng)密切監(jiān)測養(yǎng)殖水質(zhì),控制硫化物低于該數(shù)值．本研究中,刺參在硫化物急性暴露下出現(xiàn)附著力下降并出現(xiàn)排臟,說明硫化物對刺參的毒性較強,短時間的硫化物處理已誘發(fā)刺參的應(yīng)激反應(yīng)．

3.2 硫化物對刺參腸道組織抗氧化防御系統(tǒng)的影響

T-AOC是近年研究發(fā)現(xiàn)用于衡量機體抗氧化系統(tǒng)功能狀況的綜合指標,它的大小可代表和反映機體抗氧化防御系統(tǒng)對外來刺激的代償能力以及機體自由基代謝的狀態(tài)[14]．本研究表明,低濃度硫化物組刺參幼參腸道T-AOC隨時間延長略有升高;高濃度組T-AOC在24 h時高于對照組,至48 h高濃度組T-AOC隨時間的延長而降低,96 h時顯著低于對照組．這與硫化物對日本沼蝦的脅迫實驗中[5],低濃度組和高濃度組沼蝦在脅迫試驗前期T-AOC升高,高濃度組在12 h后T-AOC隨暴露時間的延長而降低的結(jié)果一致．這可能是由于硫化物對刺參的脅迫作用導致個體內(nèi)的活性氧含量增加,刺激了各種抗氧化酶活性的升高,從而提高了T-AOC．

SOD是廣泛存在于各種生物體中的抗氧化酶,它能夠催化超氧陰離子(O2-)轉(zhuǎn)化成H2O2,保護機體免受氧化的損傷[15]．CAT是生物體內(nèi)過氧化物酶類的標志酶,能夠?qū)Ⅲw內(nèi)的H2O2分解成水和氧氣,保護機體免受氧化的危害．SOD和CAT的活力高低可以反映抗氧化體系活性氧清除機制的高低,也能側(cè)面反映體內(nèi)活性氧水平．本研究中,高低濃度硫化物組刺參幼參SOD和CAT活性都出現(xiàn)了明顯的升高,這說明短時間內(nèi)合適濃度硫化物會增加抗氧化酶活性,表現(xiàn)出明顯的“毒物興奮作用”[16]．SUN等[17]研究表明硫化物能增加SOD活性,尤其是Mn-SOD的活性．本研究結(jié)果與管越強的硫化物對日本沼蝦脅迫的結(jié)果一致[5]．

谷胱甘肽是一種重要的抗氧化物質(zhì),它能夠清除氧自由基．有研究發(fā)現(xiàn),生物內(nèi)的谷胱甘肽含量與環(huán)境脅迫有關(guān)[18]．在一定的脅迫條件下,谷胱甘肽含量顯著增加[19]．本試驗中,在硫化物暴露下,刺參腸道的谷胱甘肽含量顯著增加,這與上述研究結(jié)果一致．

硫化物的毒性作用,使刺參體內(nèi)的O2-含量增加,刺激了刺參體內(nèi)的抗氧化防御機制,從而使體內(nèi)的抗氧化防御酶活性上升．在刺參體內(nèi),O2-會經(jīng)過超氧化物歧化酶SOD的歧化作用,轉(zhuǎn)化為H2O2．生成的H2O2又經(jīng)過氧化氫酶和谷胱甘肽的催化生成H2O和O2,從而減輕毒害作用．本試驗中,硫化物暴露后,刺參腸道中各種酶活性的變化是抗氧化防御體系為保護機體而產(chǎn)生的毒性響應(yīng),是刺參對硫化物毒性的一種適應(yīng)．

4 結(jié) 論

刺參與其他水生生物相比,對硫化物的耐受力較弱, 24 h、48 h、72 h、96 h的LC50分別為 4.397、3.769、3.001、2.678 mg/L,SC為0.267 8 mg/L．硫化物會顯著影響刺參的存活率、附壁率和抗氧化防御能力．在硫化物暴露下,低濃度硫化物處理組刺參幼參T-AOC始終略高于對照組．而高濃度硫化物處理組在24 h時顯著高于對照組,隨后隨時間不斷下降,至96 h,顯著低于對照組．SOD和CAT活性均在硫化物暴露72 h內(nèi)不斷升高,至72 h,高、低濃度硫化物處理組均顯著高于對照組,72 h后變化不大．硫化物處理下高、低濃度組GSSG+GSH含量始終高于對照組(P<0.05)．