多指標(biāo)權(quán)重分析法結(jié)合正交試驗(yàn)優(yōu)選醋南五味子的工藝研究

孫 浩，羅 川，胡 雨

(1.合肥華潤神鹿藥業(yè)有限公司， 安徽 合肥 231202；2.安徽華潤金蟾藥業(yè)股份有限公司，安徽 淮北 235000 )

南五味子為華中五味子SchisandrasphenantheraRehd.et Wils. 的干燥成熟果實(shí)。味微酸，收斂固澀，益氣生津，補(bǔ)腎寧心。[1]南五味子的主要化學(xué)成分有木脂素、多糖、揮發(fā)油[2]等成分。其主要功能為收斂固澀，益氣生津，補(bǔ)腎寧心。[1]五味子酯甲是五味子木脂素的主要單體成分之一，具有較強(qiáng)的抗氧化功能及護(hù)肝活性[3～4]。南五味子臨床生用用于斂肺止咳，斂汗；醋炙以后，能增強(qiáng)其溫補(bǔ)作用。臨床常用醋五味子，一般采用醋蒸法進(jìn)行加工炮制。[5]2015版《中國藥典》對(duì)醋南五味子炮制工藝的描述較簡(jiǎn)單，缺少可控的工藝參數(shù)，導(dǎo)致醋南五味子的質(zhì)量不一?，F(xiàn)在，關(guān)于醋南五味子炮制工藝研究的文獻(xiàn)[6～7]，多以五味子酯甲、多糖或總木脂素成分等為評(píng)價(jià)指標(biāo)，缺少對(duì)醋南五味子外觀性狀的描述評(píng)價(jià)。而本研究以外觀性狀、標(biāo)準(zhǔn)湯劑出膏率及五味子酯甲為指標(biāo)，采用L9(34)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，考察醋用量，蒸制時(shí)間，悶潤時(shí)間3個(gè)因素，優(yōu)選醋南五味子的炮制工藝，以期可以為醋南五味子的標(biāo)準(zhǔn)化及產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供參考依據(jù)。

1 儀器和試劑

1.1 儀器

高效液相色譜儀Thermo Scientific Ultimate 3000色譜系統(tǒng)，包括四元梯度輸液泵(LPG-3400SDN型)、自動(dòng)進(jìn)樣器(WPS-3000SL)、色譜柱溫箱(TCC-3000SD)、二極管陣列紫外檢測(cè)器(DAD-3000)、Chromeleon 7 色譜管理系統(tǒng)；色譜柱(Kromasil 100-5 C18 ,5 μm,4.6×250 nm)、KQ-500E型超聲清洗儀、AT系列溶劑過濾器(0.22 μm)、DFY-300搖擺式粉碎機(jī)(林大機(jī)械有限公司)。

1.2 試劑

五味子酯甲(批號(hào)：111529-201706)、乙腈(色譜級(jí))、甲醇(色譜級(jí))、四氫呋喃(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)、南五味子(批號(hào)：18042511)；本研究用的南五味子飲片購自協(xié)和成藥業(yè)飲片有限公司，經(jīng)鑒定為：南五味子是華中五味子SchisandrasphenantheraRehd.et Wils. 的干燥成熟果實(shí)。

2 方法

2.1 五味子酯甲的含量測(cè)定

2.1.1 液相色譜條件 色譜柱(Kromasil 100-5 C18 ,5 μm,4.6×250 nm)，流動(dòng)相：四氫呋喃-水(38:62)，檢測(cè)波長：254 nm；流速為 1.0 mL·min-1，柱溫：25℃，進(jìn)樣量為 20 μL。理論塔板數(shù)以五味子酯甲峰計(jì)算應(yīng)≥3000，色譜峰對(duì)稱性較好[1]。見圖1。

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備 取五味子酯甲對(duì)照品2.015 mg，精密稱定，置于50 mL的容量瓶中，加甲醇配制成每1 mL含40 μg的溶液，即得。[8]

2.1.3 樣品溶液的制備 取樣品粉末(過3#篩)約0.5 g，精密稱定，置白色具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱重，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)重，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，即得[1]。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)湯劑出膏率的測(cè)定

2.2.1 標(biāo)湯制備參數(shù)考察 基于《中藥配方顆粒質(zhì)量控制與標(biāo)準(zhǔn)制定技術(shù)要求》(征求意見稿)制定醋南五味子標(biāo)準(zhǔn)湯劑實(shí)驗(yàn)方案。[9]按照醋南五味子的藥性、功能主治及用藥部位(果實(shí)類)選擇煎煮參數(shù)，對(duì)加水量(倍數(shù))的要求“煎煮開始時(shí)的用水量一般以浸過藥面2～5 cm為宜”進(jìn)行考察，確定了醋南五味子標(biāo)準(zhǔn)湯劑加水量及煎煮參數(shù)，具體參數(shù)見表1。為遵循傳統(tǒng)煎煮方法，采用可實(shí)現(xiàn)煎煮火候的控制(“武火”煮沸，“文火”保持微沸至規(guī)定要求)的一種煎煮設(shè)備，選擇多功能液體加熱器(500W)煎藥砂鍋為研究的煎煮器具。

表1 醋南五味子標(biāo)準(zhǔn)湯劑參數(shù)

2.2.2 不同工藝醋南五味子標(biāo)準(zhǔn)湯劑的制備 取正交試驗(yàn)表(表3)中各工藝醋南五味子樣品約100 g，置砂鍋中，加入800 mL純化水浸泡30 min，采用多功能液體加熱器(500 W)煎煮器具先武火煮沸，再文火煎煮30 min，400目濾布趁熱過濾，濾液至冰箱中迅速冷卻至室溫；藥渣再加600 mL純化水，武火煮沸后，再文火煎煮25 min，400目濾布趁熱過濾，濾液至冰箱中迅速冷卻至室溫，合并兩次濾液，稱取濾液重量[10]。

2.2.3出膏率測(cè)定 取合并水煎液約50 g，精密稱定，放于已恒定重量的蒸發(fā)皿中，置于水浴鍋上蒸干，放在105 ℃烘箱內(nèi)干燥3 h，移至干燥器中，冷卻30 min，稱重，計(jì)算水煎液含固量，并根據(jù)水煎液總重量和飲片重量換算出膏率。出膏率=固體重( g) × 水煎液總重量(g) /[取樣量(g) × 飲片重量( g)]×100%

2.3 正交試驗(yàn)

2.3.1 醋南五味子工藝的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素考察及有關(guān)參考文獻(xiàn)[5～7,11]的基礎(chǔ)上，利用L9(34) 正交設(shè)計(jì)，考察醋用量(A)、蒸制時(shí)間(B)、悶潤時(shí)間(C) 3個(gè)因素，以外觀性狀、標(biāo)準(zhǔn)湯劑出膏率及五味子酯甲為指標(biāo)，優(yōu)選醋南五味子的炮制工藝。各因素水平見表2。

表2 正交設(shè)計(jì)因素水平

2.3.2 外觀性狀的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn) 2015版《中國藥典》及2005版《安徽省中藥飲片炮制規(guī)范》醋南五味子性狀項(xiàng)下描述：醋南五味子形如南五味子，表面棕黑色，油潤，稍有光澤。微有醋香氣[1,12]。本研究按照正交設(shè)計(jì)制備醋南五味子，參照2015版藥典及炮制規(guī)范確定評(píng)分：棕黑色，微有醋香氣，計(jì)10分；棕黑色，無醋香氣，計(jì)8分；黑色，微有醋香氣，計(jì)6分；黑色，無醋香氣，計(jì)4分。

2.3.3 綜合評(píng)分標(biāo)準(zhǔn) 為了更準(zhǔn)確地反映醋南五味子炮制工藝中各因素對(duì)其質(zhì)量的影響。本試驗(yàn)以外觀性狀、標(biāo)準(zhǔn)湯劑出膏率及五味子酯甲為評(píng)價(jià)指標(biāo)，用綜合評(píng)分法來評(píng)定[13]。五味子酯甲是南五味子飲片中的主要有效成分，也是2015版《中國藥典》規(guī)定的指標(biāo)性成分，所以其權(quán)重系數(shù)擬定為0.6；外觀性狀的質(zhì)量評(píng)價(jià)是傳統(tǒng)意義上中藥飲片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，是影響中藥飲片質(zhì)量的重要因素，所以將其作為指標(biāo)之一[13～14]；再者，中藥飲片一般是通過水煎煮服用，主要用其水溶性部位，故將標(biāo)準(zhǔn)湯劑出膏率作為醋南五味子工藝優(yōu)選的評(píng)價(jià)指標(biāo)之一是合理可行的，外觀性狀和標(biāo)準(zhǔn)湯劑出膏率的權(quán)重系數(shù)均定為0.2。外觀性狀的評(píng)分=(性狀的評(píng)分/ 9個(gè)樣品里最高性狀的評(píng)分)×2；五味子酯甲含量的加權(quán)評(píng)分=(五味子酯甲含量/ 9個(gè)樣品里五味子酯甲的最高含量) ×6；出膏率含量的加權(quán)評(píng)分=(出膏率含量/ 9個(gè)樣品里出膏率的最高含量) ×2。綜合的評(píng)分=外觀性狀的加權(quán)評(píng)分+五味子酯甲的加權(quán)評(píng)分+出膏率的加權(quán)評(píng)分[13]。實(shí)驗(yàn)安排及實(shí)驗(yàn)結(jié)果見下表3，方差分析詳見下表4。

表3 醋南五味子工藝的L9 (34) 正交試驗(yàn)結(jié)果及分析

表4 綜合評(píng)分方差分析

由直觀分析可知，三個(gè)因素對(duì)醋南五味子炮制加工工藝的影響由大到小順序?yàn)?B >A > C。方差分析表明因素B對(duì)炮制工藝具有顯著性影響，A，C 因素對(duì)炮制工藝則無顯著性影響。[15]所以從直觀分析及方差分析結(jié)果綜合可知醋南五味子的最優(yōu)加工炮制工藝為 A1B1C2，即取凈南五味子2 kg，加入20%的醋拌勻，悶潤1 h，置于蒸制容器中蒸制7 h，取出，60 ℃干燥即可，制備得醋南五味子樣品呈棕黑色，微有醋香氣。

2.4 驗(yàn)證性試驗(yàn)

取凈南五味子2 kg，按優(yōu)選的工藝制備醋南五味子樣品3份，觀察飲片外觀性狀和測(cè)定出膏率及五味子酯甲含量，驗(yàn)證結(jié)果見表5。

表5 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果表明，采用該優(yōu)選工藝制備的醋南五味子性狀、標(biāo)準(zhǔn)湯劑出膏率及五味子酯甲含量均較穩(wěn)定，表明該炮制工藝較穩(wěn)定、可控。即醋南五味子炮制的最優(yōu)工藝為：取凈南五味子適量，加入20%的醋拌勻，悶潤1 h，置于蒸制容器中蒸制7 h，取出，60℃干燥即可[16～17]。

3 討論

醋南五味子蒸至表面棕黑色，油潤，稍有光澤，微有醋香氣時(shí)，其五味子酯甲含量較高，質(zhì)量相對(duì)較佳，與醋南五味子傳統(tǒng)的外觀性狀表述相一致，表明外觀性狀是中藥材及中藥飲片質(zhì)量評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)之一，是單一化學(xué)成分及有效部位不能取代的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)[14]。

孫靜等[5]以五味子酯甲含量為指標(biāo)，優(yōu)選出醋南五味子最佳炮制條件為加入30%醋，拌勻悶潤2 h，蒸制3 h，干燥即得。宋小妹等[6]篩選出醋南五味子最佳炮制工藝為加醋30%，悶潤1 h，蒸制3 h。孫華芳等[7]以總木脂素的含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，優(yōu)選出醋南五味子的最優(yōu)加工工藝為加入20% 米醋，拌勻后，悶潤1 h，蒸制4 h，干燥即得。上述文獻(xiàn)優(yōu)選所得工藝各不相同，該文以醋南五味子外觀性狀、標(biāo)準(zhǔn)湯劑的出膏率及指標(biāo)性成分五味子酯甲等多指標(biāo)代替單一指標(biāo)來考察醋南五味子的炮制加工工藝，其結(jié)果更具科學(xué)性和適用性。

該試驗(yàn)以外觀性狀、標(biāo)準(zhǔn)湯劑出膏率及五味子酯甲為綜合優(yōu)選評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用多指標(biāo)權(quán)重分析法結(jié)合正交試驗(yàn)優(yōu)選出的醋南五味子的炮制工藝穩(wěn)定，重現(xiàn)性良好，可為醋南五味子的工業(yè)化生產(chǎn)提供一定的技術(shù)參考。此外，僅從外觀性狀、標(biāo)準(zhǔn)湯劑出膏率和化學(xué)成分角度來優(yōu)選醋南五味子的炮制工藝，尚且不足。以后，還應(yīng)引入藥動(dòng)學(xué)及藥效學(xué)指標(biāo)優(yōu)選工藝，以便工藝更客觀實(shí)用。