黃芪根腐病病株和健株根圍微生物菌群變化分析

閆歡　高芬　王夢(mèng)亮　秦雪梅

摘要 通過分析黃芪根腐病病株和健株根圍微生物菌群的變化， 探究根腐病的發(fā)病機(jī)理， 尋找預(yù)警病害發(fā)生的生物指示因子， 為土壤微生態(tài)的生物調(diào)控提供依據(jù)。試驗(yàn)通過菌落計(jì)數(shù)、PCR-DGGE和16S rRNA V3區(qū)基因測(cè)序的方法， 分析不同年限下黃芪根圍病/健土中微生物區(qū)系、多樣性及群落結(jié)構(gòu)的變化。結(jié)果表明：細(xì)菌作為黃芪根圍土中的優(yōu)勢(shì)種群，是影響病土中微生物數(shù)量升高的關(guān)鍵因子， 其多樣性降低是影響病害加重的主要原因之一。假單胞菌屬Pseudomonas和無色桿菌屬Achromobacter為土壤中的優(yōu)勢(shì)菌群， 健土中的1號(hào)和4號(hào)特異條帶分別為未培養(yǎng)的假單胞菌Uncultured Pseudomonas sp.和熒光假單胞菌P.fluorescens;6號(hào)未培養(yǎng)假單胞菌Uncultured Pseudomonas sp.的豐度與根腐病發(fā)病率負(fù)相關(guān)，16號(hào)無色桿菌Achromobacter sp. 的豐度則在3年生土壤中顯著升高，隨后急劇下降。上述4個(gè)菌可作為潛在的土壤健康或發(fā)病指示因子進(jìn)一步研究。

關(guān)鍵詞 黃芪; 根腐病; 微生物區(qū)系; 細(xì)菌多樣性; 群落結(jié)構(gòu)

中圖分類號(hào)： S 435.67

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2019184

Changes of microbial community in root zone soil of Astragalus membranaceus suffering from root rot disease

YAN Huan2，3#， GAO Fen1#， WANG Mengliang1， QIN Xuemei3*

（1. Institute of Applied Chemistry， Shanxi University， Taiyuan 030006，China; 2. College of Chemistry and

Chemical Engineering， Shanxi University， Taiyuan 030006， China; 3. Modern Research Center for Traditional

Chinese Medicine， Shanxi University， Taiyuan 030006， China）

Abstract

By analyzing the changes of microbial community in root zone soil of Astragalus membranaceus diseased and healthy plants， the study aimed at exploring the pathogenesis mechanism and biological warning indicators for the root rot disease occurrence so as to provide a theoretical basis for the biological regulation of soil micro-ecology. The microbial community in the diseased and healthy soil samples was examined through plate colony counting， PCR-DGGE and 16S rRNA V3 gene sequencing to probe into the changes of the microflora， microbial diversity and community structure in different planting years. The results showed that bacteria， as the dominant flora in the soil， were a key factor resulting in significant increase of microorganism quantity in diseased soils. The significant decrease in the bacterial diversity was one of the main causes for the increase of root rot disease incidence. Pseudomonas and Achromobacter were the dominant genera in the root zone soil. The specific bands No.1 and No.4 in the healthy soil were Uncultured Pseudomonas sp. and P. fluorescens， respectively; the abundance of No.6 Uncultured Pseudomonas sp. was negatively correlated with the root rot incidence， and No.16 Achromobacter sp. increased remarkably at the 3rd year and then began to decrease sharply. The four strains were worth further study as the potential biological indicator of soil health and disease occurrence in the future.

Key words

Astragalus membranaceus; root rot disease; microflora; bacterial diversity; community structure

黃芪為豆科植物蒙古黃芪Astragalus membranaceus （Fisch.）Bge.var. mongholicus （Bge.）Hsiao或膜莢黃芪A.membranaceus （Fisch.）Bge.的干燥根，具有提高免疫力、保護(hù)肝臟、滋養(yǎng)補(bǔ)益、利尿消腫、抗糖尿病等多種藥理功效，以其為原料的中成藥多達(dá)200余種，是中醫(yī)藥學(xué)公認(rèn)的道地大宗藥材和保健品原料[1]，素有“十藥八芪”之稱。根腐病作為一類毀滅性的土傳病害，近年來在黃芪種植中發(fā)生逐年加重。山西作為道地黃芪的重要產(chǎn)區(qū)，一般移栽黃芪田塊的發(fā)病率為10%～30%，重者高達(dá)60%，3年或3年以上植株發(fā)病更為嚴(yán)重[2]，這對(duì)黃芪產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展產(chǎn)生了嚴(yán)重影響。目前，引起山西黃芪根腐病的致病菌已基本明確，包括銳頂鐮刀菌Fusarium acuminatum、腐皮鐮刀菌F.solani、尖孢鐮刀菌F.oxysporum、芬芳鐮刀菌F.redolens、鏈格孢菌Alternaria sp. 以及Ilyonectria torresensis，其中銳頂鐮刀菌和腐皮鐮刀菌為優(yōu)勢(shì)致病菌[3]。對(duì)于該病害的防治，生產(chǎn)上最常用的方法是化學(xué)防治，但病菌抗藥性的產(chǎn)生，以及化學(xué)農(nóng)藥高毒高殘留的特性，使得防治效果并不理想，并且對(duì)黃芪的臨床安全性產(chǎn)生了很大的負(fù)面影響，而傳統(tǒng)的農(nóng)業(yè)防治措施受限因素多、成本高，實(shí)施非常困難?；诖?，亟待發(fā)展新的有效防治措施。近年來，生物調(diào)控和生物防治因其綠色環(huán)保、不易產(chǎn)生抗性、發(fā)展?jié)摿Υ蟮葍?yōu)勢(shì)日益受到人們重視。

研究發(fā)現(xiàn)，土壤微生態(tài)特別是根際微生物系統(tǒng)結(jié)構(gòu)失調(diào)與土傳病害發(fā)生有很大關(guān)聯(lián)[4]。通常土傳病害發(fā)病土壤的微生物區(qū)系與健康土壤明顯不同。如三七病株根際土和根系土中細(xì)菌數(shù)目的大量增加是急性青枯型根腐病最明顯的特征[5]，而丹參紅葉病病株根區(qū)土細(xì)菌數(shù)量較健株減少41.3%，真菌和放線菌數(shù)量分別較健株增加156.6%和189.5%[6]。為了明確病/健土中差異性微生物類群發(fā)生了怎樣的變化，科研人員通過分析其多樣性來更清晰地反映土壤中微生物的動(dòng)態(tài)。Wang 等[7]對(duì)煙草青枯病的研究發(fā)現(xiàn)，與感病土壤相比，健康土壤表現(xiàn)出更高的細(xì)菌多樣性，但Wu等[8]卻發(fā)現(xiàn)對(duì)香草枯萎病的抑制性與較高的真菌多樣性和較低的細(xì)菌多樣性有關(guān)。可見微生物多樣性是土壤健康的一個(gè)指標(biāo)，但哪類微生物的多樣性起主導(dǎo)作用卻隨植物和病害的不同而不同。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，土壤微生物群落結(jié)構(gòu)變化也會(huì)對(duì)植物土傳病害產(chǎn)生明顯影響[9]，且從該角度切入還可以尋找到有效的土壤抑病或感病指示因子。如陸曉菊等[10]發(fā)現(xiàn)伯克氏菌屬Burkholderia，芽胞桿菌屬Bacillus，鏈霉菌屬Streptomyces等細(xì)菌是三七健康土壤中的優(yōu)勢(shì)種群。Xu等[11]發(fā)現(xiàn)苜蓿莖點(diǎn)霉Phoma medicaginis和P.pinodella的豐度與豆科植物根腐病的病情指數(shù)正相關(guān)，而柄孢殼菌Podospora spp.、Pseudaleuria spp.和Veronaea spp.的豐度與病情指數(shù)負(fù)相關(guān)，這表明上述真菌與豆科植物根部病害的發(fā)生關(guān)系密切，是潛在的土壤生物指示因子。借助這些指示菌株不僅可以評(píng)價(jià)土壤健康狀況、預(yù)測(cè)病害的發(fā)生，同時(shí)也可為病害的生物調(diào)控提供依據(jù)。但針對(duì)黃芪根腐病的相關(guān)研究目前還未見報(bào)道。

本研究采集1～6年的健康和發(fā)病黃芪根圍土壤樣品，通過菌落計(jì)數(shù)、PCR-DGGE和16S rRNA V3區(qū)基因測(cè)序的方法，分析比較黃芪根圍病土和健土之間微生物菌群的變化，旨在從土壤微生態(tài)的角度探究根腐病的發(fā)生機(jī)理，尋找病害發(fā)生的預(yù)警生物指示因子，為黃芪土壤微生態(tài)的生物調(diào)控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病害調(diào)查及土樣采集

樣品采自山西省大同市渾源縣仿野生黃芪種植基地，地處113.72°E～113.76°E， 39.41°N～39.48°N，海拔1 708.80～1 989.40 m。根據(jù)當(dāng)?shù)匕l(fā)病情況，定向選擇1～6年生的黃芪健康地塊和發(fā)病地塊進(jìn)行樣品采集，各地塊管理方法完全一致，且土質(zhì)均為砂質(zhì)土。5點(diǎn)取樣法采集根圍病/健土壤樣本，根據(jù)地塊大小，每個(gè)取樣點(diǎn)的間隔距離約為5～8 m。每點(diǎn)采集3～5株黃芪根圍半徑10 cm、深度10 cm之內(nèi)的土壤，去除草根、石礫等雜物后，裝入無菌自封袋作為試驗(yàn)子樣品。帶回實(shí)驗(yàn)室后取子樣品各100 g混合均勻得最終試驗(yàn)樣品，一部分保存于4℃冰箱，用于微生物類群分析;另一部分保存于-80℃冰箱，用于分子試驗(yàn)。采樣的同時(shí)調(diào)查該地塊根腐病的發(fā)病率。

1.2 細(xì)菌、真菌和放線菌的分離計(jì)數(shù)

根據(jù)田間調(diào)查結(jié)果選取代表性土壤進(jìn)行計(jì)數(shù)分析，包括發(fā)病率較低的1、2年生病/健土和發(fā)病率較高的3、4年生病/健土。參考周永強(qiáng)等[12]的方法

分離各類微生物：取土樣5 g，置于盛有45 mL無菌水（內(nèi)置30粒滅菌玻璃珠）的三角瓶?jī)?nèi)，搖床振蕩（160 r/min，28℃）30 min得土壤懸浮液，梯度稀釋至10-4。每梯度取200 μL涂布平板，每濃度涂布3次。細(xì)菌平板32℃恒溫培養(yǎng)，48 h時(shí)計(jì)數(shù);真菌和放線菌平板28℃恒溫培養(yǎng)，分別在72 h和120 h時(shí)計(jì)數(shù)。細(xì)菌：肉汁胨培養(yǎng)基（BPA）;真菌：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA），同時(shí)加入適量（0.1 g/L）氯霉素;放線菌：高氏1號(hào)培養(yǎng)基（GA）。試驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)。采用Microsoft Excel 2016處理數(shù)據(jù)，SPSS 16.0進(jìn)行方差分析。

1.3 細(xì)菌DNA的提取及16S rDNA V3區(qū)的PCR擴(kuò)增

參考徐巖等[13]的方法提取土壤中的細(xì)菌DNA，所得DNA溶液保存于-20℃冰箱中。以提取的DNA為模板，338F（GC）： 5′-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGG-AGGCAGCAG-3′和518R： 5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′為引物[14]進(jìn)行PCR擴(kuò)增。50 μL反應(yīng)體系：DNA模板1 μL;Taq PCR Master Mix 25 μL;引物各1 μL;ddH2O 22 μL。PCR程序：94℃預(yù)變性5 min;95℃變性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán);最終72℃延伸10 min。

1.4 變性梯度凝膠電泳（DGGE）及條帶的回收

采用Bio-Rad公司DcodeTM基因突變檢測(cè)系統(tǒng)（Bio-Rad Lab，LA，USA）電泳分離PCR反應(yīng)產(chǎn)物。聚丙烯酰胺膠濃度為8%（m/V），變性梯度為35%～60%。電泳運(yùn)行條件：1×TAE電泳緩沖液，75 V電壓，60℃恒溫、恒壓電泳11.5 h。采用4S Red Plus Nucleic Acid進(jìn)行染色、成像，并保存DGGE圖譜。圖譜經(jīng)軟件Quantity One 4.6.2分析后，輸出各樣品中每個(gè)條帶的豐度值。以豐富度指數(shù)（S）、均勻度指數(shù)（J）和香農(nóng)多樣性指數(shù)（H′）為指標(biāo)比較各樣品的細(xì)菌多樣性。多樣性計(jì)算公式[15]如下：

H′=-Σ Piln Pi;

J =H′/Hmax=H′/lnS

式中：Pi=ni/N，ni是第i條條帶的豐度，N為樣品中所有條帶的總豐度;Hmax=lnS，S為樣品中總的條帶數(shù)。

DGGE圖譜中主要的共有及特異性條帶采用SIMCA軟件進(jìn)行主成分分析（PCA）分析。

1.5 16S rRNA V3區(qū)基因測(cè)序及系統(tǒng)進(jìn)化分析

切取DGGE圖譜中共有及特異性的優(yōu)勢(shì)條帶，放入2 mL滅菌離心管中。50 μL無菌水沖洗3次，加入30 μL無菌水，4℃過夜，上清液作為模板用于PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系同1.3，引物為338F（無GC夾）和518R。PCR產(chǎn)物由英濰捷（上海）貿(mào)易有限公司完成測(cè)序，將有效序列在NCBI上進(jìn)行比對(duì)，同時(shí)取同源性高的典型菌株的基因序列作為參比對(duì)象，通過MEGA 6.0軟件，鄰接法（neighbor joining method）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 病情調(diào)查

對(duì)山西渾源黃芪的根腐病發(fā)病情況進(jìn)行調(diào)查發(fā)現(xiàn)，1、2年生黃芪發(fā)病率最低，3年時(shí)發(fā)病率明顯升高，4、5年時(shí)逐漸加重，6年時(shí)又開始降低，且此時(shí)若不發(fā)病，以后則基本不會(huì)發(fā)病。本研究中1～6年生黃芪采樣地塊的發(fā)病率分別為：3.33%、10.00%、26.67%、36.67%、43.33%、33.33%。

2.2 黃芪根圍土壤的微生物區(qū)系分析

1～4年生黃芪根圍土中，病土的微生物總量均顯著高于健土。其中，細(xì)菌總量均顯著高于健土且3年生差異最大;真菌總量1、2年生無顯著改變，3、4年生顯著低于健土;放線菌總量均低于健土，且除2年生外都差異顯著。同時(shí)，無論病土還是健土中，細(xì)菌的數(shù)量和占總量的比例均遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于真菌和放線菌，具體順序?yàn)榧?xì)菌>放線菌>真菌（表1）。可見，細(xì)菌為黃芪根圍土中的優(yōu)勢(shì)菌，是影響病土微生物數(shù)量顯著高于健土的關(guān)鍵因子。

2.3 基于DGGE的黃芪根圍病/健土細(xì)菌多樣性比較

試驗(yàn)提取了黃芪根腐病發(fā)病的代表性階段（1～6年生）根圍病/健土的細(xì)菌DNA，其條帶大小為15 kb左右，16S rRNA V3區(qū)擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物為230 bp左右。對(duì)該產(chǎn)物進(jìn)行DGGE分析，發(fā)現(xiàn)各樣品中條帶的數(shù)量和亮度明顯不同，表明不同樣品中細(xì)菌的種類和量有所差異（圖1）。

根據(jù)圖譜中每條條帶的信息，綜合分析樣品中細(xì)菌的豐富度指數(shù)（S）、均勻度指數(shù)（J）和多樣性指數(shù)（H′）。

物種豐富度指一個(gè)群落或生境中物種數(shù)目的多少，物種均勻度指一個(gè)群落或生境中全部物種個(gè)體數(shù)目分配的均勻程度，而物種多樣性是物種豐富度和物種均勻度的綜合指標(biāo)。結(jié)果顯示，1～6年生黃芪根圍病土與健土的豐富度指數(shù)無顯著差異;1年生黃芪根圍病土與健土的均勻度指數(shù)和多樣性指數(shù)也均無顯著差異;2～5年生病土中除3年生的均勻度指數(shù)和健土持平外，2、4、5年生均顯著小于健土;此期間香農(nóng)多樣性指數(shù)則全部小于健土，且2年和5年生病健土之間差異顯著;6年生黃芪根圍病土均勻度和多樣性指數(shù)均略有恢復(fù)并高于健土，但差異不顯著（表2）。結(jié)合發(fā)病情況分析可知，2～5年生黃芪發(fā)病率逐年上升，病土中的細(xì)菌多樣性指數(shù)隨之逐漸降低，而6年時(shí)發(fā)病率開始降低，多樣性又有所回升，說明細(xì)菌多樣性的降低是根腐病發(fā)生加重的原因之一。此外，病土中細(xì)菌的多樣性低于健土，其原因主要在于某些細(xì)菌的分配均勻度發(fā)生了改變。

對(duì)各樣品的DGGE條帶進(jìn)行PCA分析發(fā)現(xiàn)，1年生病/健土在PC2水平上呈分離趨勢(shì)，2～6年生病/健土則均在PC1水平上明顯分離（圖2），表明從主要的共有和特異性條帶的種類及豐度來看，1年生病/健土間細(xì)菌多樣性差異較小，2～6年生病/健土間差異逐漸加大，進(jìn)一步印證了田間調(diào)查和多樣性分析的結(jié)果。

2.4 黃芪根圍土壤的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析

多樣性分析明確了黃芪根圍病土中細(xì)菌多樣性的降低因均勻度改變而引起，但無法確定是哪些菌的數(shù)量與分布發(fā)生了變化。因此，需對(duì)共有條帶和特異性條帶進(jìn)行測(cè)序和鑒定。本試驗(yàn)共回收條帶17條，其中優(yōu)勢(shì)條帶16條（除1外）（圖1）。所有樣品的共有條帶為6和16，健土中特異性條帶為1和4，病土中無特異性條帶，其他均為部分樣品共有條帶。

將17個(gè)條帶的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行BLAST比對(duì)，與比對(duì)菌株同源性大于98%的暫定為相似種，大于90%而小于98%的暫定為潛在新種[10，16]。結(jié)果顯示條帶8、9、10、11、12和13的序列比對(duì)同源性大于90%但小于98%，可能為潛在新種。構(gòu)建其他11個(gè)條帶的系統(tǒng)發(fā)育樹，除15號(hào)外均屬于變形桿菌門Proteobacteria，且主要分布于γ-變形桿菌綱的假單胞菌屬Pseudomonas、寡養(yǎng)單胞菌屬Stenotrophomonas和β-變形桿菌綱的無色桿菌屬Achromobacter（圖3）。

在鑒定出的細(xì)菌中，7株屬假單胞菌屬Pseudomonas，2株屬無色桿菌屬Achromobacter，1株屬寡養(yǎng)單胞菌屬Stenotrophomonas。上述菌株的數(shù)量隨發(fā)病程度變化而不同。其中，6號(hào)未培養(yǎng)假單胞菌Uncultured Pseudomonas sp.和16號(hào)無色桿菌Achromobacter sp.在各樣品中均有分布。將這二者的豐度與黃芪發(fā)病率進(jìn)行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)6號(hào)未培養(yǎng)假單胞菌的豐度與發(fā)病率呈顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.819（P<0.05）;16號(hào)無色桿菌的豐度與發(fā)病率無相關(guān)性，但3年生豐度較1～2年生顯著升高，呈現(xiàn)特異性變化，4～6年時(shí)豐度則又顯著下降（表3）。此外，對(duì)于健土中的特異條帶，1號(hào)經(jīng)鑒定為未培養(yǎng)的假單胞菌Uncultured Pseudomonas sp.，4號(hào)為熒光假單胞菌Pseudomonas fluorescens。

3 討論

越來越多的證據(jù)顯示：根際土壤微生物的數(shù)量、種類、代謝活性及微生物間的相互作用決定著植物的健康狀況。從土壤微生物區(qū)系、多樣性和群落結(jié)構(gòu)的角度分析土壤的健康狀態(tài)，探討土傳病害的發(fā)生機(jī)理，對(duì)病害的生物調(diào)控和防治具有很好的指導(dǎo)意義。

與其他微生物區(qū)系的研究結(jié)果相比，本研究各樣品中黃芪根圍微生物的數(shù)量相對(duì)小一些，但與孫窗舒對(duì)內(nèi)蒙古黃芪根際土壤微生物[17]的研究結(jié)果相近。有文獻(xiàn)報(bào)道，根際微生物數(shù)量往往大于非根際微生物的數(shù)量[18]，且砂質(zhì)土壤的微生物含量也低于壤土[19]，而本研究進(jìn)行試驗(yàn)的黃芪種植地區(qū)土壤為砂質(zhì)土，且采集的樣本為根圍土，這也可能是導(dǎo)致試驗(yàn)中微生物數(shù)量相對(duì)較低的原因。

大量文獻(xiàn)報(bào)道根際土壤微生物多樣性與植物健康正相關(guān)[20]。本研究也發(fā)現(xiàn)黃芪根腐病的發(fā)病率與根圍土壤中細(xì)菌多樣性的改變密切相關(guān)，多樣性降低發(fā)病加重，反之發(fā)病減輕或植株保持健康，這與Wang等[7]及Yang 等[20]對(duì)煙草青枯病的研究結(jié)果一致。然而，也有結(jié)論與此相反，如陳波等[21]發(fā)現(xiàn)香蕉枯萎病發(fā)病土壤的細(xì)菌多樣性比健康土壤更豐富，這一現(xiàn)象可能與作物、土壤種類以及生長(zhǎng)環(huán)境的差異有關(guān)。

群落結(jié)構(gòu)分析表明，假單胞菌屬是黃芪根圍土壤中的優(yōu)勢(shì)種群。作為根際土壤細(xì)菌群落的主要成員之一，該屬細(xì)菌的許多種具有抑制植物病原菌、促進(jìn)植物生長(zhǎng)的作用[22]。本研究中6號(hào)未培養(yǎng)假單胞菌的豐度與根腐病發(fā)病率呈顯著負(fù)相關(guān)，推測(cè)其可能為某種有益拮抗菌，其數(shù)量降低導(dǎo)致病原菌侵染加重，發(fā)病率上升，故可作為土壤健康和黃芪根腐病發(fā)生的潛在指示因子，但其分類歸屬、在土壤中的作用和動(dòng)態(tài)變化等還有待進(jìn)一步研究。此外，健康土壤中的4號(hào)特異性條帶被鑒定為熒光假單胞菌，該菌具有優(yōu)良的抗病能力[23]，是近幾十年來研究報(bào)道最多、最具應(yīng)用價(jià)值的一類生防菌，其在健康土壤中的特異性存在，也表明其是一種土壤健康的指示因子。另外，16號(hào)無色桿菌的豐度在根腐病發(fā)病率明顯升高的第3年顯著升高，但在4～6年時(shí)又急劇降低，盡管二者不具有相關(guān)性，但文獻(xiàn)報(bào)道一些無色桿菌屬細(xì)菌可通過誘導(dǎo)或增強(qiáng)SOD和POD活性、合成ACC脫氨酶、降低葉片中MDA含量來減輕番茄在鹽脅迫下的損傷[24]或調(diào)節(jié)乙烯對(duì)根系生長(zhǎng)的抑制作用，促進(jìn)接種植物根系的延伸[25]。據(jù)此我們推測(cè)，16號(hào)無色桿菌也可能作為一種有益菌，在土壤健康狀態(tài)的保持或黃芪的抗病性中起一定作用，但其與根腐病發(fā)生的相關(guān)性還需加以確定。

調(diào)查中還發(fā)現(xiàn)：黃芪連續(xù)種植6年后，根腐病發(fā)病率不升反降。有文獻(xiàn)報(bào)道，連續(xù)種植小麥全蝕病感病品種可以誘導(dǎo)土壤中產(chǎn)抗生素2，4-DAPG的熒光假單胞菌類群大量增加[26]。連續(xù)單一種植草莓15年的土壤再種植草莓，枯萎病的發(fā)病率很低，土壤具備了抑制性，且與種植草莓3年的土壤相比，放線菌門Actinobacteria、變形桿菌門Proteobacteria和酸桿菌門Acidobacteria細(xì)菌在15年的土壤中更為豐富[27]。由此推測(cè)，6年生黃芪發(fā)病率的降低也可能預(yù)示著連續(xù)種植誘導(dǎo)出了土壤的抑病特性，特別是有益拮抗菌的增加，抑制或抵抗了黃芪根腐病菌的侵染。

上述研究初步明確了黃芪根腐病病/健株根圍土壤微生物菌群的變化，但通過16S rDNA V3區(qū)的PCR擴(kuò)增鑒定回收條帶的分類地位，大部分菌株僅僅鑒定到了屬，還有6個(gè)菌株由于比對(duì)相似性低而難以確定歸屬，而且所鑒定的條帶中，僅有2條屬于所有樣品的共有條帶。這些因素都可能降低尋找土壤健康指示因子的覆蓋面和準(zhǔn)確度。同時(shí)，每個(gè)DGGE條帶代表的不只是一種細(xì)菌，僅憑該技術(shù)進(jìn)行微生物群落結(jié)構(gòu)的研究也有一定的缺陷。因此，目前尋找到的指示菌是否能夠真正用于指導(dǎo)病害發(fā)生檢測(cè)和生防調(diào)控，還必須深入、全面地研究和驗(yàn)證。

參考文獻(xiàn)

[1] LI Aiping， LI Zhenyu， QU Tingli， et al. Nuclear magnetic resonance based metabolomic differentiation of different Astragali Radix [J]. Chinese Journal of Natural Medicines， 2017， 15（5）： 363-374.

[2] 高芬， 任小霞， 王夢(mèng)亮， 等. 中草藥根腐病及其微生物防治研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)中藥雜志， 2015， 40（21）： 4122-4126.

[3] 高芬， 趙曉霞， 秦雪梅， 等. 山西省蒙古黃芪根腐病優(yōu)勢(shì)致病菌群分析[J]. 植物保護(hù)學(xué)報(bào)， 2018， 45（4）： 878-885.

[4] 官會(huì)林， 陳昱君， 劉士清， 等. 三七種植土壤微生物類群動(dòng)態(tài)與根腐病的關(guān)系[J]. 西南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2006， 28（5）： 706-709.

[5] 尋路路， 趙宏光， 梁宗鎖， 等. 三七根腐病病株和健株根域土壤微生態(tài)研究[J]. 西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)， 2013， 22（11）： 146-151.

[6] 段佳麗， 舒志明， 薛泉宏， 等. 丹參紅葉病發(fā)生的微生態(tài)機(jī)制[J]. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)， 2013， 24（7）： 1991-1999.

[7] WANG Rui， ZHANG Hongchun， SUN Liguang， et al. Microbial community composition is related to soil biological and chemical properties and bacterial wilt outbreak [J/OL]. Scientific Reports， 2017， 7（1）： 343. DOI： 10.1038/s41598-017-00472-6.

[8] WU Xiong， RONG Li， YI Ren， et al. Distinct roles for soil fungal and bacterial communities associated with the suppression of vanilla Fusarium wilt disease [J]. Soil Biology & Biochemistry， 2017， 107： 198-207.

[9] LEE C G， IIDA T， INOUE Y， et al. Prokaryotic communities at different depths between soils with and without tomato bacterial wilt but pathogen-present in a single greenhouse [J]. Microbes and Environments， 2017， 32（2）： 118-124.

[10]陸曉菊， 官會(huì)林， 張正蕓， 等. 三七連作根際土壤微生物區(qū)系的16S rRNA系統(tǒng)遺傳多樣性[J]. 微生物學(xué)報(bào)， 2015， 55（2）： 205-213.

[11]XU Lihui， RAVNSKOV S， LARSEN J， et al. Soil fungal community structure along a soil health gradient in pea fields examined using deep amplicon sequencing [J]. Soil Biology & Biochemistry， 2012， 46： 26-32.

[12]周永強(qiáng)， 薛泉宏， 楊斌， 等. 生防放線菌對(duì)西瓜根域微生態(tài)的調(diào)整效應(yīng)[J]. 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）， 2008， 36（4）： 143-150.

[13]徐巖， 吳友根， 張軍鋒， 等. 廣藿香根際土壤微生物總DNA提取方法的優(yōu)化[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2015， 43（2）： 45-47.

[14]MUYZER G， DEWAAL E C， UITTERLINDEN A G. Profiling of complex microbial populations by denaturing gradient gel electrophoresis analysis of polymerase chain reaction-amplified genes coding for 16S rRNA [J]. Applied and Environmental Microbiology， 1993， 59（3）： 695-700.

[15]劉紹雄， 王明月， 王娟， 等. 基于PCR-DGGE技術(shù)的劍湖濕地湖濱帶土壤微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性分析[J]. 農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)， 2013， 32（7）： 1405-1412.

[16]徐麗華， 李文均， 劉志恒， 等. 放線菌系統(tǒng)學(xué)—原理、方法及實(shí)踐[M]. 北京： 科學(xué)出版社， 2007： 202.

[17]孫窗舒. 連作對(duì)黃芪品質(zhì)形成和根際土壤微生物的影響及黃芪輪作換茬方式的研究[D]. 呼和浩特： 內(nèi)蒙古大學(xué)， 2017： 27-29.

[18]張千和， 周立香， 郭荻. 中藥材根際和非根際土壤酶和微生物特征[J]. 西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)， 2014， 23（12）： 189-196.

[19]蔡燕飛， 廖宗文， 羅潔， 等. 不同質(zhì)地土壤抑病性和微生物特征[J]. 農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)， 2003， 22（5）： 553-556.

[20]YANG Hongwu， LI Juan， XIAO Yunhua， et al. An integrated insight into the relationship between soil microbial community and tobacco bacterial wilt disease [J/OL]. Frontiers in Microbiology， 2017， 8： 2179. DOI： 10.3389/fmicb.2017.02179.

[21]陳波， 黃霄， 劉小玉， 等. 不同香蕉枯萎病區(qū)土壤細(xì)菌群落多樣性[J]. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)， 2013， 24（8）： 2281-2286.

[22]JORQUERA M A， CROWLEY D E， MARSCHNER P， et al. Identification of β-propeller phytase-ecoding genes in culturable Paenibacillus and Bacillus spp. from the rhizosphere of pasture plants on volcanic soils [J]. FEMS Microbiology Ecology， 2011， 75： 163-172.

[23]張亮， 盛浩， 袁紅， 等. 熒光假單胞菌PEF-5#18防控番茄枯萎病的定殖機(jī)理[J]. 中國(guó)生物防治學(xué)報(bào)， 2017， 33（5）： 658-666.

[24]鄭娜， 柯林峰， 楊景艷， 等. 來源于污染土壤的植物根際促生細(xì)菌對(duì)番茄幼苗的促生與鹽耐受機(jī)制[J]. 應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào)， 2018， 24（1）： 47-52.

[25]MA Wenbo， PENROSE D M， GLICK B R. Strategies used by rhizobia to lower plant ethylene levels and increase nodulation [J]. Canadian Journal of Microbiology， 2002， 48： 947-954.

[26]WELLER D M， RAAIJMAKERS J M， THOMASHOW L S， et al. Microbial populations responsible for specific soil suppressiveness to plant pathogens [J]. Annual Review of Phytopathology， 2002， 40： 309-348.

[27]CHA J Y， HAN S， HONG H J， et al. Microbial and biochemical basis of a Fusarium wilt-suppressive soil [J]. ISME Journal， 2016， 10： 119-129.

（責(zé)任編輯：田 喆）