pCEC法檢測無糖型運動營養(yǎng)品中5種糖醇

張迪，劉木子，胡穎

1.秦皇島職業(yè)技術(shù)學(xué)院（秦皇島 066100）；2.南京信息職業(yè)技術(shù)學(xué)院（南京 210000）；3.山西建筑職業(yè)技術(shù)學(xué)院（太原 030006）

運動營養(yǎng)品是為了滿足運動人群在運動后的生理代謝需求、緩解運動疲勞而加工生產(chǎn)的具有豐富營養(yǎng)元素的特殊食品。運動營養(yǎng)品的種類很多，其中就有針對不能攝入糖分人群的無糖型運動營養(yǎng)品，此類產(chǎn)品中的糖替代品一般選擇糖醇[1-2]。糖醇不僅具有糖的甜味，而且被人體攝入后，無需胰島素調(diào)節(jié)，血糖含量不會產(chǎn)生波動，因此糖醇作為糖替代品制作的無糖運動營養(yǎng)品非常適合不能攝入糖分的人群食用[3-4]。市場上這類無糖型運動營養(yǎng)品較受歡迎，但相關(guān)產(chǎn)品的標(biāo)準(zhǔn)及檢測方法相對滯后，這給這類產(chǎn)品的質(zhì)量判定及監(jiān)管帶來不便。

糖醇的檢測方法有高效液相色譜法[5-10]和氣相色譜法[11-13]。氣相色譜法檢測前需進(jìn)行衍生化處理，試驗步驟冗長、重現(xiàn)性不好。高效液相色譜法中，結(jié)合蒸發(fā)光散射器的優(yōu)點，樣品無需衍生直接檢測，試驗操作簡單。加壓毛細(xì)管電色譜（pCEC）技術(shù)是一種結(jié)合毛細(xì)管電泳的高柱效及高效液相色譜的高選擇性的新型電動微分離技術(shù)[14-16]，更適合復(fù)雜樣品的多組分檢測。試驗將加壓毛細(xì)管電色譜雙重分離機理與蒸發(fā)光散射檢測器的優(yōu)點相結(jié)合，開發(fā)無糖型運動營養(yǎng)品中5種糖醇的分析檢測新方法。該方法操作簡單、分析速度快，對此類產(chǎn)品中糖醇的測定方法體系形成有效補充。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

2100型加壓毛細(xì)管電色譜系統(tǒng)（美國賽默飛公司）；Sedex 75型蒸發(fā)光散射檢測器（美國賽默飛公司）。

木糖醇、山梨糖醇、麥芽糖醇、乳糖醇、赤蘚糖醇標(biāo)準(zhǔn)品（國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心）；乙腈、乙醇（色譜純）。

1.2 樣品來源

樣品均為隨機購買市場上銷售的無糖型運動營養(yǎng)品。

1.3 色譜條件

色譜柱：ZORBAX糖分析色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流速1.2 mL/min；進(jìn)樣量10 μL；柱溫30 ℃。

1.4 試驗方法

參考相關(guān)文獻(xiàn)中糖醇的分離條件，以乙腈-水為流動相，采用親水作用毛細(xì)管電色譜柱進(jìn)行5種糖醇的分離。通過對流動相添加劑體系、電壓強度分離條件的優(yōu)化，以及ELSD蒸發(fā)管溫度、載氣流速檢測條件的選擇，確定加壓毛細(xì)管電色譜條件。

1.4.1 流動相體系對糖醇色譜行為的影響

試驗以流動相[V（乙腈）∶V（水）=80∶20]為基礎(chǔ)，在流動相中分別加入10 mmol/L甲酸、三乙胺、乙酸-乙酸銨和三乙胺-甲酸（等摩爾添加），考察5種糖醇在不同流動相添加體系的分離情況和信噪比。

1.4.2 電壓強度對糖醇色譜行為的影響

電壓是加壓毛細(xì)管電色譜試驗條件中一個重要的試驗參數(shù)，施加不同的電壓強度對樣品的分離能力和分離速度會產(chǎn)生不同影響，試驗分別施加0，2，4，5和8 kV正向電壓，考察5種糖醇在電壓強度的分離情況。

1.4.3 蒸發(fā)光散射檢測器條件的優(yōu)化

影響蒸發(fā)光散射檢測器的兩個重要的參數(shù)分別是蒸發(fā)管溫度和載氣流速，兩者對色譜圖的信噪比（S/N）影響較大，一般建立適當(dāng)?shù)恼舭l(fā)光散射檢測方法時，需對這2個參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。

1.4.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

稱取相應(yīng)質(zhì)量的木糖醇、山梨糖醇、麥芽糖醇、乳糖醇、赤蘚糖醇標(biāo)準(zhǔn)品，配制成質(zhì)量濃度為0.005，0.010，0.020，0.040，0.060和0.100 g/100 mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)儀器分析，以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.5 樣品的前處理

無糖型運動營養(yǎng)品中營養(yǎng)元素較多，食品基質(zhì)較復(fù)雜，按照GB 5009.279—2016中方法進(jìn)行前處理，會出現(xiàn)一定的不適用性，基質(zhì)影響較大，檢測譜圖中目標(biāo)組分易被雜質(zhì)成分干擾，試驗針對此類樣品進(jìn)行前處理優(yōu)化，進(jìn)一步消除此類樣品中的雜質(zhì)干擾。具體步驟：稱取2.00 g樣品置于25 mL離心管中，加入30℃溫水定容，搖勻后超聲10 min，以5 000 r/min離心5 min。取10 mL上清液于25 mL離心管中，加入2 mL提取液后搖勻靜置10 min，以5 000 r/min離心5 min，取全部上清液，加入水定容到20 mL，搖勻后取850 μL濾液，加入150 μL碳酸鈉溶液，搖勻中和后上機檢測。試驗比較三氯乙酸、乙腈、乙醇3種不同提取液對5種糖醇檢測的影響。

1.4.6 方法的精密度、重復(fù)性與回收率

以未檢出5種糖醇的運動營養(yǎng)品為空白基質(zhì)，加入不同濃度的木糖醇、山梨糖醇、麥芽糖醇、乳糖醇、赤蘚糖醇混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，使用優(yōu)化后的前處理方法提取，上機檢測，計算回收率。

2 結(jié)果與討論

2.1 流動相體系對糖分色譜行為的影響

試驗發(fā)現(xiàn)，5種糖醇的分離情況未有明顯變化；但信噪比差異明顯，其信噪比在不同添加體系下的變化如圖1所示。

結(jié)果表明，三乙胺-甲酸添加體系的信噪比最高，這種添加劑可以形成離子對，可有效提高糖醇顆粒大小，從而提高散射光強度。另外，流動相添加三乙胺時信噪比有明顯提高，與添加三乙胺-甲酸時相差并不大，而且在堿性環(huán)境下更利于產(chǎn)生電滲流，故選擇三乙胺作為流動相添加劑。

圖1 不同流動相體系對5種糖醇信噪比的影響

2.2 電壓強度的選擇

在流動相中加入10 mmol/L三乙胺，分別施加0，2，4，5和8 kV正向電壓，結(jié)果如圖2所示。

結(jié)果表明，隨著電壓的升高，在電滲流的推動下5種糖醇的分離速度明顯加快，同時色譜峰形變窄；施加電壓+5 kV時，樣品分離時間加快到14 min左右，并且5種糖醇樣品完全分離。施加電壓達(dá)到+8 kV后，分離速度無明顯加快，并且儀器電流急劇增大，故選擇施加電壓+5 kV。

2.3 載氣流速的選擇

較低的載氣流速有利于提高ELSD的檢測靈敏度，試驗在較低載氣流速范圍內(nèi)進(jìn)行最佳氣體流速考察。分別在載氣流速為0.5，0.6，0.8，1.0和1.2 L/min條件下，考察5種糖醇的信噪比，結(jié)果如圖3所示。

結(jié)果表明，當(dāng)載氣流速低于0.8 L/min時，糖醇樣品的色譜峰開始明顯展寬，影響到樣品分離度，信噪比也均出現(xiàn)下降趨勢。過低的氣體流速會降低樣品霧化效率，基線噪聲變大，色譜峰展寬嚴(yán)重，從而使信噪比降低，故選擇最佳載氣流速0.8 L/min。

圖2 電壓強度對5種糖醇分離速度的影響

圖3 載氣流速對5種糖醇信噪比的影響

2.4 蒸發(fā)管溫度的選擇

在優(yōu)化試驗條件下，分別考察5種糖醇在蒸發(fā)管溫度90，100，110，120和130 ℃時的信噪比，結(jié)果如圖4所示。

結(jié)果表明，山梨糖醇、麥芽糖醇和乳糖醇隨著蒸發(fā)管溫度的升高，其信噪比保持上升趨勢；木糖醇信噪比在蒸發(fā)管溫度超過110 ℃時開始下降，山梨糖醇信噪比在蒸發(fā)管溫度超過120 ℃時開始下降。綜合考慮，以信噪比較低的乳糖醇和赤蘚糖醇為主要優(yōu)化對象，故選擇最佳蒸發(fā)管溫度120 ℃。

圖4 蒸發(fā)管溫度對5種糖醇信噪比的影響

在優(yōu)化后條件下檢測含有木糖醇的無糖型運動營養(yǎng)品，如圖5所示。

圖5 無糖型運動營養(yǎng)品的pCEC分離譜圖

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

為驗證5種糖醇在80%乙腈-水（含10 mmol/L三乙胺）流動相體系中的線性關(guān)系，配制木糖醇、山梨糖醇、麥芽糖醇、乳糖醇和赤蘚糖醇濃度分別為0.005，0.010，0.020，0.040，0.060和0.100 g/100 mL的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。結(jié)果表明，5種糖醇分在0.005～0.100 g/100 mL濃度范圍內(nèi)均具有良好線性關(guān)系（r2＞0.99）；采用在空白基質(zhì)中添加目標(biāo)組分的方法，依據(jù)色譜峰的信噪比大于3倍確定檢出限，信噪比大于10倍確定定量限，得到5種目標(biāo)組分的檢出限和定量限，分別為0.5～1.0和1.5～3.0 mg/100 mL，結(jié)果見表1。

表1 5種糖醇的保留時間、標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)、檢出限與定量限

2.6 提取液的選擇

針對于樣品提取液的選擇，分別選用提取液Ⅰ（三氯乙酸）、提取液Ⅱ（乙醇）、提取液Ⅲ（乙腈）來進(jìn)行比較，以5種糖醇的回收率為比較依據(jù)，結(jié)果如圖6所示。

結(jié)果表明，提取液Ⅲ（乙腈）的提取效果最好，能將樣品溶液中的蛋白類物質(zhì)沉淀完全，除雜效果較好，5種糖醇的回收率均在85%以上，其次為乙醇和三氯乙酸，所以選擇乙腈作為提取液。

2.7 加標(biāo)回收率與精密度

在加標(biāo)回收試驗中，選用植物源性基質(zhì)、動物源性基質(zhì)共2種基質(zhì)的運動營養(yǎng)品，分別添加5.0，50和100 mg/100 g 低、中、高的3個水平混合標(biāo)準(zhǔn)品，每個結(jié)果測定5次，進(jìn)行加標(biāo)回收的試驗。

由表2可見，5種組分的3個水平的加標(biāo)回收率為87.5%～102.4%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.15%～5.23%，表明試驗所建立的方法能夠滿足檢測實際樣品需要。

圖6 提取液選擇對5種糖醇回收率的影響

表2 方法的回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=5）

3 結(jié)論

利用加壓毛細(xì)管電色譜-蒸發(fā)光散射聯(lián)用法，通過對流動相體系、電壓強度、蒸發(fā)管溫度和載氣流速的優(yōu)化，以及樣品提取液的比較，建立了同時分離檢測無糖型運動營養(yǎng)品中的木糖醇、山梨糖醇、麥芽糖醇、乳糖醇和赤蘚糖醇5種糖醇的親水作用電色譜法。結(jié)果表明，在V（乙腈）∶V（水）=80∶20流動相體系中添加10 mmol/L三乙胺，在電壓強度+5 kV、載氣流速0.8 L/min、蒸發(fā)管溫度120 ℃條件下，木糖醇、山梨糖醇、麥芽糖醇、乳糖醇、赤蘚糖醇5種組分能得到良好基線分離，其峰型良好，出峰時間合適。樣品在經(jīng)提取液乙腈的提取下，可實現(xiàn)對目標(biāo)物的凈化，有效解決多組分糖醇共存時樣品前處理復(fù)雜、回收率低的分析難點，可為無糖型運動營養(yǎng)品中糖醇的分析和監(jiān)控提供技術(shù)支持。