干燥方式對(duì)桑葉主要活性成分及抗氧化活性的影響

趙慧玲，王佳燕，呂慧，張立華

棗莊學(xué)院食品科學(xué)與制藥工程學(xué)院（棗莊 277160）

桑樹(shù)（Morus alba L.）為?？粕俾淙~喬木，在世界上現(xiàn)存10～14種[1]。我國(guó)種植桑樹(shù)的歷史悠久，桑園面積達(dá)80.5萬(wàn) km2[2]，被譽(yù)為最大的桑樹(shù)種植國(guó)。桑樹(shù)為特種經(jīng)濟(jì)樹(shù)種，用途廣泛，葉可飼蠶，桑椹為食藥同源的果實(shí)[3]。桑葉除用于養(yǎng)蠶外，還是傳統(tǒng)的中藥，被稱(chēng)為“鐵扇子”“神仙草”[4]，具有抗敏、防痙攣、涼血明目等功效[5]，用于治療傷風(fēng)感冒、咽喉腫疼等癥。現(xiàn)代研究表明桑葉中含有黃酮、多糖、多酚、1-脫氧野尻霉素（DNJ）活性物質(zhì)[6]，具有降血糖、降血壓、抗衰老等作用。且近代研究發(fā)現(xiàn)DNJ是桑葉降血糖作用的主要功能成分[7-8]。給糖代謝障礙患者服用富含DNJ的桑葉提取物12周，能夠控制患者餐后血糖的升高[9-10]。桑提取物還能夠改善d-半乳糖誘導(dǎo)的衰老小鼠認(rèn)知障礙，有利于抑制衰老進(jìn)程[11]。

有人分析了不同品種和產(chǎn)地的桑葉總黃酮、總酚、粗多糖及γ-氨基丁酸的含量，結(jié)果顯示有較大的差異[12-13]；不同季節(jié)的桑葉中活性成分也存在差異[14-15]。環(huán)境溫度影響桑葉干物質(zhì)的積累，32 ℃的環(huán)境溫度有利于桑葉干物質(zhì)積累[16]。而有關(guān)不同干燥方式對(duì)桑葉活性成分和抗氧化活性的影響鮮見(jiàn)報(bào)道，試驗(yàn)比較分析自然晾干、凍干、烘干及發(fā)酵后烘干這4種不同方式干燥桑葉的活性成分及抗氧化活性，為桑葉資源更有效的利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

桑葉（2018年10月采自棗莊市市中區(qū)的九龍山，經(jīng)專(zhuān)家鑒定為魯桑品種的桑樹(shù)葉片）；乙醇（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品（天津博迪化工股份有限公司）；DNJ、DPPH和蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（上海源葉生物科技有限公司）；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

DHG-9053A電熱恒溫干燥箱（揚(yáng)州鴻都電子有限公司）；LYO-0.5真空冷凍干燥機(jī)（上海東富龍科技股份有限公司）；TDL-40B低速臺(tái)式大容量離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；FA1104B精密電子天平（上海越平科學(xué)儀器有限公司）；薄層色譜儀（上?？普苌萍加邢薰荆?；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（尤尼柯上海儀器有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 桑葉樣品的處理

采摘的新鮮桑葉分別進(jìn)行以下處理：自然晾干，在室溫條件下晾曬至干燥；凍干，使用真空冷凍干燥機(jī)在-15 ℃下冷凍直至干燥；烘干，使用鼓風(fēng)干燥箱在65 ℃下烘干；發(fā)酵后烘干，先使用茶葉揉捻機(jī)揉捻處理至汁液滲出，參考紅茶加工工藝中的發(fā)酵處理方法[17]在室溫下發(fā)酵8 h，之后使用鼓風(fēng)干燥箱在65 ℃下烘干。

將這4種不同方式干燥的桑葉樣品使用微型中藥粉碎機(jī)分別粉碎處理，過(guò)60目篩，備用。

1.2.2 桑葉水分含量測(cè)定

利用快速水分測(cè)定儀對(duì)鮮桑葉及4種干桑葉樣品進(jìn)行水分含量測(cè)定，所得數(shù)據(jù)繪制成圖。

1.2.3 桑葉中多酚、黃酮的含量測(cè)定。

1.2.3.1 多酚、黃酮提取液的制備

采用醇提法[18]提取黃酮和多酚類(lèi)化合物。分別稱(chēng)取1.00 g 4種樣品桑葉粉，新鮮桑葉也稱(chēng)取1.00 g使用研缽研碎，在30 mL 80%的乙醇、70 ℃條件下水浴浸提2 h，提取液在4 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心10 min，上清液即為多酚和黃酮粗提取液。

1.2.3.2 多酚的含量測(cè)定

采用Folin-Denis試劑法[19]測(cè)定多酚含量，以沒(méi)食子酸對(duì)照品溶液（0.02 mg/mL）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算多酚含量，測(cè)定時(shí)分別取0.50 mL桑葉粗提液，用蒸餾水稀釋至8 mL，得到桑葉稀釋液A，先后加入福林試劑、桑葉稀釋液A、水和20%的Na2CO3溶液至反應(yīng)終體積6 mL，空白不加樣品，振蕩后靜置30 min，在750 nm處測(cè)定吸光度。

1.2.3.3 黃酮的含量測(cè)定

采用AlCl3法[20]測(cè)定黃酮含量，以蘆丁對(duì)照品溶液（0.21 mg/mL）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算黃酮含量，測(cè)定時(shí)分別取2 mL桑葉粗提液用蒸餾水稀釋到15 mL，得到桑葉稀釋液B，先后加入桑葉稀釋液B、乙醇、NaNO2溶液，振蕩后靜置5 min，然后加入Al(NO3)3溶液振蕩后靜置6 min，最后加入NaOH溶液并用乙醇溶液補(bǔ)至終體積10 mL，振蕩后靜置10 min，在510 nm處測(cè)定吸光度。

1.2.4 DNJ含量測(cè)定

分別稱(chēng)取20.00 g 4種樣品桑葉粉、20.00 g新鮮桑葉，使用研缽研碎，加入100 mL 70%乙醇，在超聲波清洗機(jī)中超聲輔助提取40 min，提取液在4 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心10 min，置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至10 mL，得到脫氧野尻霉素粗提取液。

將4種桑葉提取液過(guò)濾，定量點(diǎn)樣，置于由正丁醇-冰乙酸-水（體積比4∶1∶1）組成的展開(kāi)體系中展開(kāi)，以茚三酮為染液進(jìn)行染色，然后取出，在波長(zhǎng)334 nm處進(jìn)行掃描，得到圖譜，并對(duì)其積分求含量。以DNJ標(biāo)準(zhǔn)品制作工作曲線(xiàn)。

1.2.5 清除DPPH自由基能力的測(cè)定

在20 mL試管中依次加入DPPH標(biāo)準(zhǔn)液、超純水和樣品溶液至反應(yīng)終體積5 mL，樣品空白以無(wú)水乙醇代替藥品，以抗壞血酸為陽(yáng)性對(duì)照，在黑暗條件下反應(yīng)30 min，并在517 nm處測(cè)定光吸光度[21]。

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

各試驗(yàn)至少重復(fù)3次以上，試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同方式干燥桑葉樣品中水分含量

4種干燥方式獲得的桑葉及新鮮樣品中水分含量結(jié)果見(jiàn)圖1。同批新鮮桑葉樣品水分含量為64.20%，自然晾干、凍干、烘干和發(fā)酵后烘干樣品含水量分別為5.98%，7.46%，5.95%和5.69%。其中凍干樣品含水量相對(duì)較高，比最低的發(fā)酵后烘干高出1.75%，其他三者差別不明顯。

圖1 不同桑葉樣品中水分含量

2.2 不同方式干燥桑葉中多酚含量比較

4種處理的樣品及新鮮桑葉中多酚含量見(jiàn)圖2。其含量差異顯著（p＜0.005），晾干樣品含量最高達(dá)到18.40 mg·g-1，凍干處理樣品最低僅有2.96 mg·g-1，烘干及發(fā)酵后烘干分別為6.03和8.67 mg·g-1，新鮮桑葉中多酚含量為1.11 mg·g-1。因新鮮桑葉含水量高（64.20%），換算成無(wú)水材料，多酚含量約為3.24 mg·g-1，與凍干樣品的多酚含量基本一致。分析認(rèn)為自然晾干處理是在室溫環(huán)境下緩慢失水干燥，在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)葉肉細(xì)胞是有生命的，而且處于一種脅迫狀態(tài)，仍會(huì)發(fā)生復(fù)雜的代謝活動(dòng)，一些中間產(chǎn)物可能會(huì)轉(zhuǎn)化成酚類(lèi)物質(zhì)，從而會(huì)使酚類(lèi)物質(zhì)顯著增加；凍干過(guò)程溫度較低，采摘后的桑葉細(xì)胞雖然是有生命的，但各種代謝受到抑制，物質(zhì)變化也受到抑制，即桑葉中酚類(lèi)物質(zhì)沒(méi)有較大變化；烘干是在65 ℃高溫環(huán)境下進(jìn)行的，桑葉細(xì)胞很快被殺死，之后代謝活動(dòng)也會(huì)停止，酚類(lèi)物質(zhì)變化也較??；發(fā)酵后烘干處理有晾青和揉捻的過(guò)程，在此過(guò)程中會(huì)發(fā)生一系列物質(zhì)的轉(zhuǎn)化，包括酚類(lèi)物質(zhì)增加，但隨后的烘干會(huì)使各種代謝活動(dòng)終止，所以該種處理中多酚含量相對(duì)較高些。

圖2 不同桑葉樣品中多酚含量

2.3 不同方式干燥桑葉中黃酮含量比較

黃酮類(lèi)化合物常以游離苷原或與糖結(jié)合的苷類(lèi)等形式存在于植物中[22]。4種處理的桑葉樣品中黃酮含量差異顯著，結(jié)果見(jiàn)圖3。凍干處理樣品中含量最低僅有30.86 mg·g-1，發(fā)酵后烘干樣品中最高達(dá)到70.13 mg·g-1，烘干及自然晾干分別為54.82和57.21 mg·g-1。新鮮桑葉黃酮含量為11.73 mg·g-1，去除高含水量的影響，折算為無(wú)水材料，約為32.76 mg·g-1，與凍干樣品基本一致。凍干樣品中黃酮含量較低，其原因可能與上述對(duì)多酚的分析是相同的。發(fā)酵后烘干樣品黃酮含量最高，該處理有晾青和揉捻的過(guò)程，可能會(huì)使黃酮類(lèi)物質(zhì)增加，微生物參與的發(fā)酵活動(dòng)也可能會(huì)增加黃酮含量；此外，桑葉經(jīng)過(guò)揉捻，細(xì)胞結(jié)構(gòu)被充分破壞，在提取時(shí)有利于黃酮的溶出，使得所測(cè)黃酮含量較高。

2.4 不同方式干燥桑葉中DNJ含量比較

1-脫氧野尻霉素（DNJ）是一種多羥基生物堿，最初是從鏈霉菌中提取并氫化得到，后又從桑的根皮中分離得到[23]，研究發(fā)現(xiàn)野柘草、風(fēng)信子等植物和芽孢桿菌等微生物中也含有DNJ[24]。經(jīng)測(cè)定幾種桑葉樣品中DNJ含量如圖4所示，鮮桑葉含量最低0.64 mg·g-1，自然晾干、凍干和烘干樣品分別為1.72，1.80和1.83 mg·g-1，三者相差甚微，如去除鮮桑葉中水分的影響，其中DNJ含量與該三者也基本相當(dāng)。發(fā)酵后烘干樣品的DNJ含量最高，可達(dá)2.30 mg·g-1，比前3種處理平均值提高了27.22%。在處理方式上，其他4種樣品缺少發(fā)酵環(huán)節(jié)，因此判斷在發(fā)酵過(guò)程中一系列酶促反應(yīng)和微生物活動(dòng)促進(jìn)了DNJ的增加。肖紅等[25]研究發(fā)現(xiàn)30 ℃發(fā)酵6 h的桑葉茶中DNJ含量增加了7.10%，也認(rèn)為發(fā)酵能夠提高桑葉中DNJ含量。

圖3 不同桑葉樣品中黃酮含量

圖4 不同桑葉樣品中DNJ含量

2.5 不同方式干燥桑葉清除DPPH自由基能力

各桑葉樣品粗提液對(duì)DPPH自由基的清除能力大小如圖5所示。各樣品之間清除率差異顯著，鮮桑葉的清除力最低僅20.76%，烘干樣品為40.54%，凍干及發(fā)酵后烘干分別為57.99%和71.73%，晾干樣品最高達(dá)到86.40%?？紤]到鮮桑葉含水量高的因素，其清除DPPH自由基的能力與凍干樣品是基本相當(dāng)?shù)摹４痔嵋褐泻卸喾?、黃酮、DNJ及其它化學(xué)成分，它們都可能是清除自由基的貢獻(xiàn)者，一般認(rèn)為桑葉中多酚的清除自由基能力最強(qiáng)[26]，自然晾干處理下多酚含量最高（18.4 mg·g-1），故晾干處理樣品對(duì)DPPH清除作用強(qiáng)；烘干處理因短期內(nèi)干燥、溫度高，可能對(duì)桑葉中其他熱敏性抗氧化活性成分造成破壞，使其清除能力較低；發(fā)酵后烘干樣品黃酮和DNJ含量最高，多酚含量較高（8.67 mg·g-1），綜合作用的結(jié)果，使得發(fā)酵處理的樣品清除DPPH自由基的能力僅次于晾干的樣品。

圖5 不同桑葉樣品對(duì)DPPH自由基的清除能力

3 討論與結(jié)論

經(jīng)測(cè)定4個(gè)處理及鮮桑葉的含水量，鮮桑葉含64.20%的水分，自然晾干、烘干和發(fā)酵后烘干樣品含水量基本一致，分別為5.98%，5.95%和5.69%，凍干樣品含水量較高一些，為7.46%，凍干樣品高出其他3個(gè)處理平均值1.58%。對(duì)多酚、黃酮、DNJ的含量和DPPH清除能力的分析有一定影響，在具體的分析判斷時(shí)考慮其影響因素。

凍干條件溫度低，避免了各類(lèi)成分的破壞，最大限度地保留了桑葉中的原有物質(zhì)含量，此次結(jié)果顯示凍干樣品中多酚、黃酮、DNJ的含量與鮮葉樣品除去水分的因素后的數(shù)據(jù)基本一致，說(shuō)明凍干的確最大限度保留了鮮葉樣品的物質(zhì)含量。4種處理中，凍干樣品的多酚、黃酮含量最低，其他3種處理都有不同程度提高，說(shuō)明在采摘之后多酚和黃酮類(lèi)物質(zhì)還在變化著，晾曬、加熱及微生物發(fā)酵等條件會(huì)提高二者的含量。如前所述，DNJ是桑葉降血糖的主要功能成分，并發(fā)現(xiàn)對(duì)α-葡萄糖苷酶的活性有一定的競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用[11]，因此DNJ的研究成為了一個(gè)熱點(diǎn)，桑葉中DNJ含量因不同產(chǎn)地[12]、不同桑樹(shù)品種[13]及不同生長(zhǎng)季節(jié)[14]會(huì)有不同，此次結(jié)果顯示發(fā)酵處理的桑葉DNJ含量提高了27.22%，肖紅等[25]的研究也得到了一致的結(jié)果，至于發(fā)酵能提高DNJ含量的機(jī)制尚不清楚，有待進(jìn)一步研究。

凍干處理除了能最大限度保留桑葉中原有物質(zhì)含量，對(duì)物質(zhì)活性保護(hù)也是有利的。雖然4個(gè)處理中多酚、黃酮類(lèi)物質(zhì)含量最低，但對(duì)DPPH自由基清除能力卻高于烘干的樣品，可能是低溫條件下較好地保留了多酚、黃酮之外其他類(lèi)型抗氧化物質(zhì)。而烘干在較高溫度下破壞了一些熱敏性的抗氧化物質(zhì)。

綜上所述，不同干燥處理方式會(huì)影響桑葉中多酚、黃酮和DNJ的含量及抗氧化活性。其中，自然晾干有利于提高多酚的含量及抗氧化活性，發(fā)酵后烘干有利于提高DNJ和黃酮物質(zhì)的含量，生產(chǎn)中應(yīng)根據(jù)不同的目的選擇適宜的加工方式。