響應(yīng)面法優(yōu)化低共熔溶劑提取桑葉DNJ

王璐，許路路，陳雄，趙宇明，韓靜

沈陽(yáng)藥科大學(xué)（本溪 117004）

1-脫氧野尻霉素（1-deoxynojirimycin，DNJ），可以抑制α-葡萄糖苷酶活性、降低血糖、抑制病毒活性、抑制腫瘤轉(zhuǎn)移、還可以與胰島素連用增加其敏感度[1]。DNJ的來源分為植物和微生物，桑的枝、葉、根中DNJ含量在已知?jiǎng)又参镏凶罡遊2]。雖然DNJ化學(xué)合成的方法很多，但是存在操作復(fù)雜，產(chǎn)率低，污染大等問題，中國(guó)桑葉資源豐富，絲綢產(chǎn)業(yè)下滑，桑葉資源利用不充分，所以桑葉中DNJ提取分離純化十分緊迫。

低共熔溶劑[3]（DES）定義為特定摩爾比的氫鍵受體和氫鍵供體形成的均一、澄清、透明的液體，為2種或多種組分的混合物。DES作為一類新出現(xiàn)的溶劑，它的優(yōu)點(diǎn)有原料普遍、價(jià)錢合理、操作簡(jiǎn)便、不必純化等。它被廣泛應(yīng)用在化學(xué)合成、氣體吸收、藥物緩釋、催化、提取、電化學(xué)等領(lǐng)域[4-6]，在天然產(chǎn)物提取中的應(yīng)用有人參皂苷、花色素、石蒜科生物堿[7-9]。因此，可針對(duì)提取物體的性質(zhì)選出最適合的DES溶劑，循環(huán)利用，以節(jié)約成本，減少污染[7]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

桑葉（遼寧本溪農(nóng)戶提供，中藥學(xué)院袁丹教授鑒定為藥桑（Morus nigra L.））；1-脫氧野尻霉素標(biāo)準(zhǔn)品（純度98.9%，上海新鉑化學(xué)技術(shù)有限公司）；乙腈（色譜純，天津市康科德科技有限公司）；氯甲酸-9-芴基甲酯（FMOC-Cl，阜陽(yáng)曼林生物技術(shù)有限公司）；氯化膽堿、甘油（分析純，天津市富寧精細(xì)化工有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

Scientz IID超聲細(xì)胞破碎儀（寧波新芝生物科技股份有限公司）；L-2130高效液相色譜儀（日本日立公司）。

1.3 方法

1.3.1 提取方法

稱取桑葉粉末1.0 g，按料液比1∶20（g/mL）加入低共熔溶劑（含水量50%），在40 ℃，150 W，使用超聲細(xì)胞破碎機(jī)提取1 次，時(shí)間10 min，提取液以10 000 r/min離心15 min，抽濾，少量水潤(rùn)洗濾渣，獲得桑葉DNJ提取液。

1.3.2 DNJ檢測(cè)方法

1.3.2.1 樣品的衍生化處理

精密稱取DNJ標(biāo)準(zhǔn)品2.0 mg，用0.05 mol/L鹽酸定容于10 mL容量瓶，取70 μL的DNJ的標(biāo)準(zhǔn)品溶液或樣品溶液與338 μL濃度為0.4 mol/L硼酸鉀緩沖液（pH 8.5）混合，加入500 μL濃度5 mol/L氯甲酸-9-芴基甲酯（FMOC-Cl溶于50%乙腈溶液），25 ℃水浴20 min，加入50 μL濃度1 mol/L甘氨酸，25 ℃水浴5 min終止反應(yīng)，加入1%乙酸132 μL及超純水324 μL[10]，渦旋混勻，過0.45 μm濾膜收集待測(cè)。

1.3.2.2 色譜條件

高效液相色譜（HPLC）檢測(cè)，色譜柱Supersil ODS2 C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）。流動(dòng)相：乙腈-0.1%乙酸水溶液（40∶60，V/V）。檢測(cè)器紫外波長(zhǎng)254 nm；進(jìn)樣量10 μL；流速1.0 mL/min；柱溫25℃，桑葉DNJ提取液進(jìn)樣。

1.3.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線建立

將DNJ標(biāo)準(zhǔn)品配制成梯度濃度溶液（14.28，20，40，60，80和100 μg/mL），衍生化處理后進(jìn)行HPLC測(cè)定。以標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度x對(duì)峰面積y進(jìn)行線性回歸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程y=1 371.2x+3 478.4，R2=0.999 2，在14.28～100 μg/mL范圍內(nèi)質(zhì)量濃度與峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

1.3.2.4 桑葉DNJ提取量的計(jì)算

桑葉DNJ提取量計(jì)算如式（1）。

式中：X為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算的提取液的質(zhì)量濃度，μg/mL；V0為桑葉DNJ提取液體積，mL；M為桑葉樣品質(zhì)量，g。

1.3.3 DES種類的篩選

1.3.3.1 DES的種類（參見表1）

表1 DES種類

1.3.3.2 DES的制備

按照摩爾比將氫鍵供體和氫鍵受體混合，在65 ℃水浴鍋中加熱約30 min，充分?jǐn)嚢杌靹?，得到澄清、透明、微黏稠的液體狀溶劑，在10 000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心10 min，無固體析出，按照比例加入去離子水，制成DES備用。

1.3.4 單因素試驗(yàn)

按照1.3.1的方法，分別對(duì)氯化膽堿甘油摩爾比（2∶1，1∶1，1∶2，1∶3和1∶4）、超聲時(shí)間?。?0，20，30，40，50和60 min）、DES含水量（10%，20%，30%，40%和50%）3個(gè)因素進(jìn)行考察，得到其對(duì)DNJ提取效果的影響，每組重復(fù)3次。

1.3.5 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)

對(duì)單因素進(jìn)行分析，將氯化膽堿甘油摩爾比、低共熔溶劑含水量、超聲時(shí)間這3個(gè)因素作為Box-Behnken的自變量，響應(yīng)值為桑葉DNJ提取量，用響應(yīng)面法進(jìn)行分析優(yōu)化，三因素三水平響應(yīng)面具體數(shù)據(jù)見表2。

2 結(jié)果與分析

2.1 DES種類的篩選

由圖1可知，總體上，氯化膽堿制備成的低共熔溶劑對(duì)DNJ的提取優(yōu)于甜菜堿，DESs-1氯化膽堿與甘油制備DES提取桑葉中的DNJ效果最好。

圖1 DES的種類對(duì)提取的影響

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 氯化膽堿與甘油摩爾比對(duì)提取效果的影響

一般而言，大多數(shù)DES黏度隨溫度升高和氫鍵供體增多，黏度減小[11]。由圖2可看出，氯化膽堿與甘油摩爾比1∶3時(shí)提取量最多，氯化膽堿量低時(shí)，可能形成較少的分子內(nèi)氫鍵，并且黏度很大，不利于與桑葉粉末充接觸，隨著甘油的增多，黏度下降，提取量增加，但是摩爾比1∶4時(shí)，提取量下降，可能是形成的低共熔溶劑不穩(wěn)定，氫鍵減少所造成。因此，摩爾比1∶3更有利于DNJ的提取。

2.2.2 超聲時(shí)間對(duì)提取效果的影響

由圖3可得出，DNJ的提取量隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增大，30 min時(shí)，提取值最大，含量逐漸降低。這可能是因?yàn)殚L(zhǎng)時(shí)間提取，桑葉粉充分吸收提取溶劑，黏稠度增加，過濾困難，過濾出的桑葉體積減少。

2.2.3 DES含水量對(duì)提取效果的影響

室溫下的DES的高黏度限制其應(yīng)用，加水降低黏度，增加傳質(zhì)速度，提高提取產(chǎn)率[12]，由圖4可看出，隨著溶劑中含水量逐漸增大，DNJ提取量的波動(dòng)在40%時(shí)達(dá)到最大，可能是由于分子間的氫鍵比較多，黏度比較適合DNJ溶出，含水量50%時(shí)，提取效率降低，可能是過量的水會(huì)導(dǎo)致現(xiàn)有氫鍵的損失，破壞DES的特殊結(jié)構(gòu)[13]。含水量30%時(shí)，提取量比較低，這種現(xiàn)象可能是因?yàn)镈NJ類化合物與DES相互作用形成聚合物，或者因?yàn)镈ES的穩(wěn)定性下降[14]。

圖2 氯化膽堿與甘油摩爾比對(duì)DNJ提取量的影響

圖3 超聲時(shí)間比對(duì)DNJ提取量的影響

圖4 DES含水量對(duì)DNJ提取量的影響

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)

根據(jù)單因素的分析結(jié)果，按照響應(yīng)面的試驗(yàn)方法，選擇氯化膽堿甘油摩爾比、含水量、超聲時(shí)間進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面分析方法。

優(yōu)化桑葉DNJ的最佳提取條件，結(jié)果見表3，使用Design-Expert 10對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行擬合，得到DNJ提取量對(duì)氯化膽堿甘油摩爾比（A）、含水量（B）、超聲時(shí)間（C）數(shù)學(xué)回歸模型：Y=-2.3+0.6A+0.11B+0.04C+0.000 25AB+0.003 7AC+0.000 071BC-0.11A2-0.000 14B2-0.000 85C2。

表3 響應(yīng)面設(shè)計(jì)及結(jié)果

由表4可知，二次回歸分析模型p＜0.000 1顯著性良好，失擬項(xiàng)大于0.5不顯著，決定系數(shù)R2=0.999 5，校正決定系數(shù)R2adj=0.998 8，證明實(shí)測(cè)值與模型預(yù)測(cè)值之間具有良好的擬合性，模型可用于分析影響DNJ的提取量的因素。

表4 回歸模型和方差分析

2.4 響應(yīng)面分析

超聲細(xì)胞破碎機(jī)輔助提取桑葉DNJ的響應(yīng)面見圖5。固定1個(gè)變量，隨著另一個(gè)變量的增加，DNJ提取量先增加達(dá)到最大值后下降，含水量（B）和超聲時(shí)間（C）、氯化膽堿甘油摩爾比（A）和超聲時(shí)間（C）的平面圖呈橢圓形，表明兩者的交互作用明顯。

圖5 各因素及其交互作用對(duì)超聲輔助提取影響的響應(yīng)面

2.5 驗(yàn)證試驗(yàn)

由模型可以看出，桑葉DNJ的超聲細(xì)胞破碎機(jī)輔助提取工藝最優(yōu)條件為：氯化膽堿甘油摩爾比1∶3.34，含水量40.445%，超聲時(shí)間31.74 min。該條件下提取含量為1.447 mg/g，為減少實(shí)際操作的繁瑣復(fù)雜，將氯化膽堿甘油摩爾比、含水量和超聲時(shí)間調(diào)整為1∶3.4、40%和32 min。進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，桑葉DNJ平均提取量為1.445±0.001 8 mg/g，與理論值1.447 mg/g接近。證明模型擬合結(jié)果良好，優(yōu)化的工藝條件可靠，對(duì)實(shí)際生產(chǎn)有幫助。

3 結(jié)論

桑葉DNJ的最佳條件為：氯化膽堿甘油摩爾比1∶3.4，含水量40%，超聲時(shí)間32 min，重復(fù)3次。此時(shí)DNJ平均提取量為1.445±0.001 8 mg/g，與理論值1.447 mg/g接近。DES提取提高了桑葉中DNJ提取量，并且DES制備簡(jiǎn)單、可循環(huán)利用、生物降解性良好，還可增加提取物穩(wěn)定性，延長(zhǎng)保存時(shí)間，為桑葉提取開發(fā)利用和天然產(chǎn)物的提取純化保存提供思路。