擾動方式對太湖藻類胞外多糖濃度的影響

郭亞格, 田 偉, 楊桂軍, 張宏亮, 湯祥明

1.中國科學院南京地理與湖泊研究所，湖泊與環(huán)境國家重點實驗室, 江蘇 南京 210008 2.安陽師范學院資源環(huán)境與旅游學院, 河南 安陽 455000 3.安徽師范大學環(huán)境科學與工程學院, 安徽 蕪湖 241003 4.江南大學環(huán)境與土木工程學院, 江蘇 無錫 214122

隨著我國經(jīng)濟的快速發(fā)展，大量污染物排入河流和湖泊，導致水體富營養(yǎng)化現(xiàn)象日趨嚴重. 藍藻水華是富營養(yǎng)化湖泊的重要表征之一，藍藻水華頻發(fā)，已成為我國面臨的重大環(huán)境問題之一[1-3]. 研究[4]表明，部分藍藻在生長過程中或外部環(huán)境脅迫條件下會分泌大量的EPS (extracellular polysaccharide，胞外多糖)，包括黏附在細胞外的bEPS (bound extracellular polysaccharide，固著性胞外多糖)和釋放到周圍環(huán)境中的sEPS (soluble extracellular polysaccharide，溶解性胞外多糖). 藍藻EPS在維持生物量龐大的藍藻生長和增殖中起著重要作用，EPS的釋放有利于藻細胞的聚集，聚集成團的藻細胞可以幫助藍藻抵御外界的不良環(huán)境[5]. 研究證明，藍藻胞外結(jié)合的多糖層能幫助其對抗脫水、吞噬作用、抗體識別和病毒的溶菌作用[6-7]，還能使細胞附著在固體基質(zhì)上以防止被流水沖走[8]. QIN等[9]發(fā)現(xiàn)由于EPS的存在，中度或小的風浪擾動會導致藻細胞聚集成更大的群體，從而增加藻團的浮力，加速藍藻水華的形成.

在自然水體中，當生存狀況惡劣時，藍藻會分泌sEPS和bEPS，細胞表面的EPS層變厚[10]. Yim等[11]研究表明，氮和磷缺乏能夠刺激EPS的合成. Staats等[12]研究發(fā)現(xiàn)，當藻細胞被接種到低濃度氮或磷培養(yǎng)基時，EPS的分泌會受到激發(fā). 研究[13-14]表明，氮、磷限制在一定程度上可以促進EPS的分泌. 風浪擾動對藍藻EPS的形成也具有重要作用，水動力擾動會在很大程度上改變水體的理化性質(zhì)[15-17]，從而影響藻類EPS的分泌. 關(guān)于擾動對藻類EPS的影響，國內(nèi)外學者進行了部分研究[18-19]，但關(guān)于不同擾動方式對藻類EPS影響的研究還較少. 芮政等[20]研究表明，間歇擾動組的水華微囊藻EPS含量顯著高于不擾動組，其原因可能是擾動作用對微囊藻細胞產(chǎn)生了刺激作用，引起藻細胞生理特征的改變，從而促進了EPS的分泌.

太湖是一個典型的大型淺水湖泊[21]，面積為 2 338 km2，平均水深為1.9 m，最大水深不足3 m[22-23]. 受亞熱帶季風和臺風的影響，尤其是在夏秋季節(jié)，風浪擾動使湖水始終處于一個動態(tài)環(huán)境. 研究[24-25]表明，藍藻水華的暴發(fā)與風浪擾動密切相關(guān). 太湖由風浪引起的擾動屬于間歇擾動. 該研究通過模擬試驗，對比了間歇擾動、持續(xù)擾動和不擾動(對照組)3種方式下太湖藻類ρ(EPS)的差異，并探討了擾動方式以及相關(guān)環(huán)境因子對藍藻EPS的影響，為藍藻水華暴發(fā)機理提供科學依據(jù).

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)置和樣品采集

1.1.1試驗設(shè)置

試驗在中國科學院太湖湖泊生態(tài)系統(tǒng)研究站生態(tài)室水池內(nèi)進行. 以9只洗凈晾干的100 L塑料水桶為試驗容器. 在太湖邊打撈發(fā)生水華時的藻類和湖水，藍藻藻漿用64 μm尼龍網(wǎng)濃縮(經(jīng)鑒定，藍藻的比例占85%以上，且微囊藻占藍藻的絕大部分)，隨后添加適量藍藻藻漿于上述水桶內(nèi)，混勻后測定水桶中的ρ(Chla)，保持各水桶內(nèi)ρ(Chla)初始值在110 mg/L左右. 再向桶中加入氮、磷營養(yǎng)鹽，使所有水桶中ρ(TN)為10 mg/L，ρ(TP)為0.5 mg/L〔模擬了近10年太湖藍藻水華暴發(fā)最嚴重的梅梁灣N/P(氮磷比)的平均值，是梅梁灣2000—2008年ρ(TN)、ρ(TP)平均值的4倍，其中TN和TP分別用NaNO3和K2HPO4·3H2O配制〕. 在擾動組6只水桶的水面下10 cm處固定變頻造浪泵(中山市捷寶電子電器有限公司，型號為WP-60，功率為60 W)，使用W1經(jīng)典造浪模式，擾動時獲得水平方向的波浪，浪高約5 cm，流量約為330 L/min. 水體靜置1 d后開始試驗. 試驗時，3只水桶不擾動(對照組)；3只水桶每天擾動6 h，時間為10:00—13:00及16:00—19:00(間歇擾動組)；其余3只水桶每天擾動24 h(持續(xù)擾動組). 水桶懸掛放在有機玻璃房內(nèi)的大型水池內(nèi)，試驗持續(xù)19 d(2018年7月11—29日).

1.1.2樣品采集

試驗開始第1、4、7、10、13、16、19天，每天08:00左右采集約1 L水樣，用于測定水體中的相關(guān)理化參數(shù)、ρ(EPS)及藻類相關(guān)參數(shù)等.

1.2 理化因子分析

試驗期間，每天08:30使用多參數(shù)水質(zhì)檢測儀(YSI, 6600V2, 美國)測量水溫及ρ(DO).ρ(TDN) (TDN為溶解性總氮)、ρ(TDP)(TDP為溶解性總磷)、ρ(Chla)、ρ(SS)(SS為總懸浮物)等水體中理化因子的測定參考《湖泊富營養(yǎng)化調(diào)查規(guī)范》[26]. 藻細胞密度(algae cell density, ACD)的測定參照李勝男等[27]的方法，利用流式細胞儀(FACSJazz,美國Becton Dickinson公司)進行檢測.

1.3 ρ(EPS)測定

ρ(EPS)的測定參照YANG等[10]的方法，將EPS分為bEPS和sEPS進行分別測定. 用移液管取混勻藻液10 mL，冷凍24 h后取出溶解，用超聲破碎機高頻下破碎15 min，質(zhì)量配平，然后在4 ℃、11 000 r/min 下離心15 min，分離上清液和藻細胞，然后用移液槍吸取上清液用孔徑為0.45 μm的濾膜過濾，濾液加入透析袋(截留分子量為 3 500 u)置于去離子水中透析，用于測定ρ(sEPS). 上述離心后的藻團加去離子水至10 mL搖勻，再加入0.5 mg/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH為10，搖勻后置于45 ℃溫水水浴提取4 h，然后在4 ℃、11 000 r/min下離心15 min，取上清液用孔徑為0.45 μm濾膜過濾后，濾液加入透析袋(截留分子量為 3 500 u)置于去離子水中透析，然后用于測定ρ(bEPS). 把所獲得的兩種濾液各取出1 mL，加入4 mL蒽酮溶液，沸水水浴10 min，冷卻后用分光光度計測量620 nm波長處的吸光值，參照文獻[28]中的方法，根據(jù)標準曲線計算ρ(bEPS)和ρ(sEPS).ρ(EPS)為ρ(bEPS)與ρ(sEPS)之和.

圖1 試驗過程中各處理組ρ(EPS)及單位藻細胞EPS含量的變化趨勢Fig.1 Changes of extracellular polysaccharide concentration and extracellular polysaccharides content of unit algal cells in each group during the experiment

1.4 數(shù)據(jù)分析

該研究所有數(shù)據(jù)通過Microsoft Excel 2016軟件錄入，采用R 3.5.2和Origin 2018軟件進行分析和制圖. 因為數(shù)據(jù)不全是正態(tài)分布數(shù)據(jù)，故使用非參數(shù)Kruskal-Wallis秩和檢驗分析各參數(shù)在不同處理下是否存在顯著性差異(P<0.05為具有顯著性差異).

2 結(jié)果與分析

2.1 擾動方式對藍藻ρ(EPS)的影響

試驗過程中對照組、間歇擾動組和持續(xù)擾動組的ρ(EPS)總體上均呈上升趨勢〔見圖1(a)〕. 試驗第1～7天，3個處理組的ρ(EPS)沒有明顯變化；第7～10天，3個處理組的ρ(sEPS)和ρ(bEPS)均明顯上升；第10～19天，持續(xù)擾動組的ρ(sEPS)和ρ(bEPS)變化趨勢與對照組相似，均呈先降后升的趨勢. 總體而言，對照組、間歇擾動組和持續(xù)擾動組的ρ(EPS)分別由第1天的1.24、1.04和1.24 μg/mL增至第19天的22.01、17.63和25.12 μg/mL，分別增加了約18、17和20倍. 非參數(shù)Kruskal-Wallis秩和檢驗結(jié)果表明，試驗第1～13天，3個處理組之間的ρ(EPS)差異不顯著(P>0.05)；第16～19天，對照組和持續(xù)擾動組的ρ(sEPS)均顯著高于間歇擾動組(P<0.05)，而3個處理組之間的ρ(bEPS)仍無顯著性差異(P>0.05).

擾動會對生物量造成影響，進而影響單位藻細胞EPS含量，因此根據(jù)試驗不同階段每mL水體中藻類的細胞數(shù)，筆者計算了以μg/(105cells)為單位的EPS含量變化趨勢〔見圖1(b)〕. 試驗期間，3個處理組的單位藻細胞EPS含量在第1～7天無明顯變化，第7～19天呈現(xiàn)先升后降的趨勢，至第19天對照組、間歇擾動組和持續(xù)擾動組的單位藻細胞EPS含量分別為4.63、12.03和22.10 μg/(105cells). 非參數(shù)Kruskal-Wallis秩和檢驗結(jié)果表明：第1～7天，3個處理組的單位藻細胞EPS含量差異不顯著(P>0.05)；第10～19天，對照組的單位藻細胞EPS、sEPS和bEPS含量均顯著低于間歇擾動組和持續(xù)擾動組(P<0.05)；至試驗結(jié)束之時(第19天)，持續(xù)擾動組的單位藻細胞sEPS和bEPS含量顯著高于間歇擾動組(P<0.05). 該結(jié)果表明，擾動尤其是持續(xù)擾動能促進藍藻EPS的分泌.

2.2 試驗過程中各處理組ρ(sEPS)和ρ(bEPS)占比的變化

對照組、間歇擾動組和持續(xù)擾動組中ρ(sEPS)和ρ(bEPS)在ρ(EPS)中占比及單位藻細胞EPS含量的變化趨勢見圖2. 非參數(shù)Kruskal-Wallis秩和檢驗結(jié)果表明，3個處理組ρ(sEPS)和ρ(bEPS)占比之間無顯著差異(P>0.05). 3個處理組的ρ(EPS)在1～7 d均處于較低水平，隨后對照組和間歇擾動組的ρ(EPS)在7～13 d呈上升趨勢，在13～19 d呈下降趨勢，持續(xù)擾動組的ρ(EPS)在7～16 d呈上升趨勢，在16～19 d有所下降.

圖2 對照組、間歇擾動組及持續(xù)擾動組的單位藻細胞EPS含量以及ρ(sEPS)和ρ(bEPS)占比隨時間的變化Fig.2 Changes in extracellular polysaccharide content of unit algal cells, and the proportions of sEPS and bEPS with time in control group, intermittent disturbance group and continuous disturbance group

試驗第1～7天，3個處理組ρ(sEPS)占比較高，而在第10～19天有所下降，但仍高于ρ(bEPS)占比. 其中，對照組ρ(sEPS)占比出現(xiàn)了兩次波動，第一次波動(1～10 d)的頂峰為94.9%(第4天)，隨后呈現(xiàn)下降趨勢，在第10天降至70.4%，第二次波動(10～19 d)的最大值為83.1%(第16天)，之后有所下降，到第19天降至73.0%. 間歇擾動組中，ρ(sEPS)占比在第1～7天較高(87.3%～93.8%)，隨后呈現(xiàn)持續(xù)下降趨勢，到第19天降至76.3%. 持續(xù)擾動組中，ρ(sEPS)占比在1～7 d出現(xiàn)了一次小波動，由第1天的86.0%降至第4天的79.0%，隨后在第7天增至92.7%，而在第7～19天基本呈下降趨勢，到第19天降至67.0%.

2.3 理化因子與ρ(EPS)的相關(guān)性

3個處理組ρ(DO)、ρ(TDN)、ρ(TDP)、ρ(Chla)、ρ(SS)和藻細胞密度的變化趨勢見圖3. 由圖3可見：試驗期間，對照組、間歇擾動組和持續(xù)擾動組的ρ(DO)均有所下降，分別由9.06、9.36和9.78 mg/L降至7.86、3.17和7.49 mg/L，對照組的ρ(DO)在1～4 d呈上升趨勢，而間歇擾動組和持續(xù)擾動組的ρ(DO)在1～4 d呈下降趨勢，隨后處于較平穩(wěn)的狀態(tài)(4～19 d)，且間歇擾動組的ρ(DO)始終低于其余兩組；3個處理組的ρ(TDN)和ρ(TDP)在試驗期間均呈下降趨勢；3個處理組的ρ(Chla)在試驗期間出現(xiàn)了一定幅度的波動，但總體上均呈上升趨勢，其中持續(xù)擾動組的ρ(Chla)始終高于其余兩組；3個處理組的藻細胞密度在試驗過程中均出現(xiàn)了較明顯的波動，其中第10～19天間歇擾動組和持續(xù)擾動組的藻細胞密度均低于對照組；對照組和間歇擾動組的ρ(SS)在1～7 d均呈下降趨勢，在7～19 d呈上升趨勢，而持續(xù)擾動組的ρ(SS)在試驗過程中幾乎呈持續(xù)上升趨勢.

圖3 試驗過程中各組主要理化因子的變化趨勢Fig.3 Trends in the main physical and chemical factors in different groups during the experiment

Spearman 相關(guān)性分析結(jié)果(見表1)表明，ρ(DO)、ρ(TDN)、ρ(TDP)、ρ(Chla)、ρ(SS)和藻細胞密度與3個處理組的單位藻細胞EPS含量均具有一定的相關(guān)關(guān)系.ρ(DO)與3個處理組的單位藻細胞EPS含量均呈負相關(guān)，與對照組相關(guān)性最為顯著(R=-0.90，P<0.001)，表明在ρ(DO)較低時，藍藻會分泌較多的EPS.ρ(TDN)、ρ(TDP)與3個處理組的單位藻細胞EPS含量均呈顯著負相關(guān)，其中，ρ(TDN)與持續(xù)擾動組單位藻細胞EPS含量之間的負相關(guān)性最強(R=-0.81，P<0.001)，ρ(TDP)與間歇擾動組單位藻細胞sEPS含量之間的負相關(guān)性最強(R=-0.80，P<0.001)，表明ρ(TDN)、ρ(TDP)較低時有利于藍藻EPS的形成.ρ(Chla)、ρ(SS)與3個處理組的單位藻細胞EPS含量均呈正相關(guān)，其中，ρ(SS)與持續(xù)擾動組的單位藻細胞bEPS含量之間的相關(guān)性最強(R=0.71，P<0.001)，表明ρ(Chla)、ρ(SS)較高時能促進藍藻分泌EPS. 藻細胞密度與3個處理組的單位藻細胞EPS含量均呈負相關(guān)，其中，與間歇擾動組的單位藻細胞sEPS含量呈顯著負相關(guān)(R=-0.88，P<0.001). 綜上，理化因子對藍藻EPS的形成起著非常重要的作用.

表1 理化因子與各處理組水體ρ(EPS)及單位藻細胞EPS含量的相關(guān)性

3 討論

3.1 擾動方式對ρ(EPS)的影響

該研究結(jié)果顯示，在1～7 d，對照組和擾動組之間的ρ(EPS)無顯著差異. 而劉玉等[29]研究發(fā)現(xiàn)，連續(xù)擾動24 h后，100和200 r/min試驗組ρ(EPS)顯著高于對照組，50和400 r/min試驗組與對照組無顯著差異，適度的擾動可以促使藻細胞ρ(sEPS)顯著提高. 試驗設(shè)置的擾動強度大小可能是導致該試驗中1～7 d內(nèi)ρ(EPS)差異不顯著的原因之一. 此外，試驗過程中收集的太湖藻類在試驗大桶中可能都有為期一周的適應(yīng)期. 在10～19 d，對照組的ρ(EPS)、ρ(sEPS)和ρ(bEPS)均顯著低于間歇擾動組和持續(xù)擾動組，這可能是經(jīng)過一段適應(yīng)期后擾動使藻細胞生理特征逐步改變，促進了EPS的分泌[20]，從而使得兩個擾動組單位藻細胞EPS含量較高. 而持續(xù)擾動對藻細胞產(chǎn)生的刺激作用更強烈，導致試驗結(jié)束之時，該組的ρ(EPS)和ρ(bEPS)還顯著高于間歇擾動組.

單位藻細胞EPS含量與生長周期密切相關(guān)，通常認為，藻類在其生長期內(nèi)會不斷地釋放EPS，并且進入靜止期后釋放量增大. 如圖2所示，在1～7 d，3個處理組的單位藻細胞EPS含量沒有明顯變化，可能是因為在培養(yǎng)初期，藻細胞處于適應(yīng)期，且此時水體中的氮、磷質(zhì)量濃度較高，而高濃度的氮、磷營養(yǎng)鹽又會抑制藻細胞EPS的分泌[5]，致使單位藻細胞EPS含量較低. 隨后3個處理組的單位藻細胞EPS含量均出現(xiàn)大幅上升，可能是因為在試驗前期，隨著藻類的生長3個處理組的ρ(TDN)、ρ(TDP)均呈下降趨勢，使得氮、磷質(zhì)量濃度在7 d后處于較低狀態(tài)，而氮、磷質(zhì)量濃度較低會促使藻類產(chǎn)生EPS[12]. 試驗后期3個處理組的單位藻細胞EPS含量呈下降趨勢，可能是因為藻在新環(huán)境中適應(yīng)了一段時間后多糖分泌量會減小[30]. 至試驗結(jié)束之時，3個處理組的單位藻細胞EPS含量均保持在較高水平，浦寅芳等[31]認為，培養(yǎng)時間對EPS產(chǎn)量有顯著影響，藻細胞在生長中后期開始積累多糖，所以生長后期的單位藻細胞EPS含量明顯高于生長前期.

從EPS形成的角度看，ρ(sEPS)和ρ(bEPS)的占比值得關(guān)注. 該試驗結(jié)果顯示，對照組的ρ(sEPS)占比呈現(xiàn)出先升后降的趨勢，但第19天和第1天的ρ(sEPS)占比差別不大；而間歇擾動組和持續(xù)擾動組的ρ(sEPS)占比在試驗過程中分別下降了27%和20%. 這可能是由于擾動刺激改變了藻類EPS在溶解態(tài)和固著態(tài)之間的分配，其具體機制有待進一步研究.

3.2 理化因子的變化對ρ(EPS)的影響

研究[32]表明，藻類在生長堆積或者衰亡腐爛時會消耗大量DO，使水體產(chǎn)生缺氧甚至厭氧條件，而不利的生長條件是藍藻大量分泌EPS的主要原因之一[33]，即當水體處于缺氧或厭氧條件時會促使藍藻分泌較多的EPS，這可能是該研究中ρ(DO)與ρ(EPS)呈負相關(guān)的原因之一. 該研究發(fā)現(xiàn)，ρ(TDN)、ρ(TDP)與3個處理組的ρ(EPS)均呈負相關(guān)，氮、磷濃度較低會導致培養(yǎng)環(huán)境中C/N和C/P升高，進而促進藍藻將多余的碳營養(yǎng)元素合成為EPS分泌到細胞外[34-36]，使得ρ(EPS)上升. 氮、磷限制能顯著提高藍藻碳水化合物的合成，尤其是在氮限制條件下能夠激發(fā)sEPS和bEPS等碳水化合物組分的提高[37]. Granum等[38]也發(fā)現(xiàn)，當?shù)谋M時，藻胞外多聚糖的分泌量增加，而極端的氮限制和磷限制會導致藻產(chǎn)生更多的胞外多聚糖. 代曉炫等[39]發(fā)現(xiàn)，氮、磷的增加造成了多糖含量的降低，這是因為氮、磷充足時光合作用的產(chǎn)物優(yōu)先以蛋白質(zhì)、RNA的形式出現(xiàn)，從而導致多糖含量相對減少，該試驗從另一方面證實了氮、磷質(zhì)量濃度與ρ(EPS)均呈負相關(guān)的觀點. 這種情況在其他藻類中也有發(fā)現(xiàn)，尤珊等[40]發(fā)現(xiàn)，低氮條件有利于微藻EPS的積累，氮缺乏導致光合效率降低，微藻對氮饑餓的反應(yīng)是自身含氮大分子的降解，從而導致細胞氮含量的顯著降低和多糖的積累. 該研究表明，水體中DO、氮、磷質(zhì)量濃度較低時能夠促進藻類EPS的分泌.

ρ(Chla)與ρ(EPS)呈正相關(guān)，藍藻細胞通過光合作用合成碳水化合物，然后根據(jù)生理活動的需要合成核酸、蛋白質(zhì)等，單個細胞中多糖的多少實際上取決于多糖與微囊藻細胞內(nèi)蛋白質(zhì)、核酸等物質(zhì)的比例關(guān)系[39]，Chla是各門藻類中都含有的光合作用色素，其濃度的升高表明藻類光合作用強烈，合成的蛋白質(zhì)、核酸等物質(zhì)增多，從而促使細胞產(chǎn)生更多的EPS. 藻細胞密度與單位藻細胞EPS含量呈顯著負相關(guān)，有研究[10]表明，單位藻細胞sEPS和bEPS含量受藻生長的影響，藻在生長不利的情況下單位藻細胞sEPS和bEPS含量較大，反之，單位藻細胞sEPS和bEPS含量較小，這是因為當生存狀況惡劣時，藍藻會分泌較多的多糖，以作為脅迫環(huán)境下的保護機制，而與此同時藻細胞密度會有所下降，因而導致二者呈負相關(guān).

藍藻EPS的分泌本質(zhì)上是生物應(yīng)對外界不利環(huán)境因素的一種反應(yīng)，這種聚集可能是一種防止被捕食的策略[41]. 此外，當?shù)⒘谞I養(yǎng)鹽等環(huán)境因素呈現(xiàn)不利狀態(tài)時，會誘使藍藻EPS分泌增加，供給藻際微生物以碳源，并通過藻際細菌或真菌等的礦化作用獲得氮、磷營養(yǎng)鹽[42-43]，這種藻菌互利合作對藻類EPS的分泌需要進一步研究.

4 結(jié)論

a) 第1～7天，擾動對ρ(EPS)、ρ(sEPS)和ρ(bEPS)的影響不顯著(P>0.05)；但是第10～19天，對照組的ρ(EPS)、ρ(sEPS)和ρ(bEPS)均顯著低于間歇擾動組和持續(xù)擾動組(P<0.05)；第19天，持續(xù)擾動組的ρ(sEPS)和ρ(bEPS)顯著高于間歇擾動組(P<0.05)，表明擾動尤其是持續(xù)擾動能在一定程度上促進EPS的分泌.

b) 水體中氮、磷和DO質(zhì)量濃度及藻細胞密度較低時能夠促進藍藻EPS的分泌，反之，則會抑制藍藻EPS的分泌.

c) 水體中ρ(Chla)和ρ(SS)較高時能夠促進EPS的分泌，且理化因子對藍藻EPS的形成起著非常重要的作用.