血栓性淺靜脈炎新處方的成分-靶點網絡藥理作用研究

王玉濤，龐 雪，張幼雯，宋奎全，孫 慶

血栓性淺靜脈炎（superficial thrombophlebitis,STP）是常見的外周血管疾病，好發(fā)于四肢及胸腹壁淺靜脈。據統(tǒng)計，STP發(fā)病率約為0.6‰[1]。有證據顯示，STP與下肢深靜脈血栓形成（deep venous thrombosis, DVT）和肺栓塞（pulmonary embolism, PE）發(fā)病關系密切[2]。中醫(yī)藥治療STP歷史悠久，效果顯著且并發(fā)癥少，臨床應用愈加廣泛。筆者[3]前期運用中醫(yī)傳承輔助平臺（V2.5）對近30年中國知網（CNKI）收錄的中醫(yī)藥治療STP的文獻進行數據挖掘，并利用平臺的熵層次聚類[4]等無監(jiān)督數據挖掘方法，將中醫(yī)藥治療STP的藥物之間的關聯(lián)性進行定量描述，并將核心組合進一步演化、提取，總結出治療STP的候選新處方。目前中醫(yī)藥治療STP的基礎研究較少，為進一步明確中醫(yī)藥干預STP的機制，本文以網絡藥理學理論[5]為指導，將新處方中藥物的主要化學成分、關鍵靶點及其干預STP的相關信號通路等進行挖掘篩選，構建“藥物－成分－靶點-疾病”復雜網絡，為中醫(yī)藥治療STP的基礎研究提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 新處方藥物入血活性成分篩選 前期筆者利用中醫(yī)傳承輔助平臺（V2.5）挖掘總結獲得治療STP的新處方——當歸、赤芍、丹參、牛膝[3]。通過檢索西北農林科技大學設計開發(fā)的中藥系統(tǒng)藥理學數據庫和分析平臺（TCMSP），對新處方藥物所有成分數據進行挖掘[6]。以藥代動力學參數（ADME）為依據，將藥物口服生物利用度（oral bioavailability, OB）≥30，藥物相似度(drug-likeness,DL)≥0.18設為條篩選條件[7]，過濾獲得新處方藥物入血活性成分，建立數據庫。

1.2 新處方藥物化學成分靶點的獲取及收集 利用TCMSP數據庫中的“靶點預測”功能，將新處方藥物入血活性成分的作用靶點導出，建立數據庫。UniProt（http://www.uniprot.org/） 是蛋白質序列和注釋數據的綜合數據庫，包含1.2億種蛋白質的序列和注釋信息[8]。登陸UniProt Knowledgebase（UniProt KB），導出物種為“人”的數據，利用perl語言工具（http://www.perl.org/）校正預測的靶點名稱。

1.3 STP靶點的獲取及收集 DisGeNET（http://www.disgenet.org/）數據庫是包含人類疾病及相關基因靶點的數據庫之一，包含17549種基因、24166種疾病以及628685種疾病-基因互作關系[9]。GeneCards（https://www.genecards.org/） 數據庫是一個可以分析人類基因數據的綜合數據庫，其主要功能包括分析基因的表達、功能途徑、蛋白質與蛋白質的相互作用、基因與疾病的關系等[10]。人類在線孟德爾遺傳平臺（OMIM, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim）是一個記錄所有已知疾病的遺傳成分，并預測它們與人類基因組中相關基因的關系的數據庫[11]。使用上述3個數據庫，分別檢索并獲取STP相關靶點，將上述檢索結果去重后取交集，獲得與STP相關的靶點。運用生物信息學與進化基因組學網站的韋恩圖繪制功能（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/），將新處方藥物作用靶點和STP相關靶點取交集，并繪制韋恩圖。

1.4 藥物-成分-靶點-疾病網絡的構建 使用Cytoscape 3.7.2軟 件（http://www.cytoscape.org）構建“藥物-成分-靶點-疾病”關系網絡。網絡中的節(jié)點（Node）代表新處方藥物組成藥物、藥物有效成分、STP及其相關靶點；邊（Edge）代表藥物-成分、成分-靶點、靶點-疾病之間的連接。整個網絡構建并展示了“藥物-成分-靶點-疾病”之間的聯(lián)系，通過這一網絡可以深入分析新處方藥物干預STP的作用機制。以網絡節(jié)點度值（Degree）和中介中心度（Betweenness centrality）為篩選條件，挖掘網絡核心節(jié)點。

1.5 關鍵靶點蛋白相關作用（protein-protein interaction, PPI）網絡的構建 使用STRING數據庫（https://string-db.org）預測蛋白質之間的相互作用。STRING數據庫系統(tǒng)可對通過不同方式獲得的預測結果進行評分，分值越高，表示PPI結果的置信度越高。本研究利用STRING數據庫的“Multiple Proteins”功能，設定“物種”為人類（Homo Sapiens），將新處方藥物干預STP的關鍵靶點導入系統(tǒng)檢索，設定評分分值＞0.9，即可構建PPI網絡，并獲得節(jié)點度值等反映靶標蛋白相互關系的信息。

1.6 關鍵靶點的通路分析 Bioconductor是目前最常用的，以R語言為平臺的高通量基因組數據分析工具之一，可提供包含人類在內的19個物種的GO注釋信息[12]。ClusterProfiler是常用的基因數據分析的R語言工具之一，可利用Bioconductor提供的KEGG pathway數據庫（http://rest.kegg.jp/link/hsa/pathway）進行信號通路富集分析[13]。本研究利用perl語言工具將新處方藥物干預STP的關鍵靶點名稱轉換為entrez ID，運用上述工具，以P＜0.05為條件進行信號通路富集分析，并將富集結果可視化。

2 結果

2.1 新處方藥物入血活性成分篩選 通過TCMSP數據庫檢索新處方藥物有效成分，以OB≥30%和DL≥0.18為條件進一步篩選，得到新處方藥物入血活性成分，見表1。

表1 新處方藥物入血活性成分

藥物 Mol ID Molecule Name OB(%) DL牛膝 MOL002643 delta 7-stigmastenol 37.42 0.75 MOL002714 baicalein 33.52 0.21 MOL002776 Baicalin 40.12 0.75 MOL002897 epiberberine 43.09 0.78 MOL000358 beta-sitosterol 36.91 0.75 MOL003847 Inophyllum E 38.81 0.85 MOL000422 kaempferol 41.88 0.24 MOL004355 Spinasterol 42.98 0.76 MOL000449 Stigmasterol 43.83 0.76 MOL000785 palmatine 64.6 0.65 MOL000085 beta-daucosterol_qt 36.91 0.75 MOL000098 quercetin 46.43 0.28丹參 MOL001601 1,2,5,6-tetrahydrotanshinone 38.75 0.36 MOL001659 Poriferasterol 43.83 0.76 MOL001771 poriferast-5-en-3beta-ol 36.91 0.75 MOL001942 isoimperatorin 45.46 0.23 MOL002222 sugiol 36.11 0.28 MOL002651 Dehydrotanshinone II A 43.76 0.4 MOL002776 Baicalin 40.12 0.75 MOL000569 digallate 61.85 0.26 MOL000006 luteolin 36.16 0.25 MOL006824 α-amyrin 39.51 0.76 MOL007036 5,6-dihydroxy-7-isopropyl-1,1-dimethyl-2,3-dihydrophenanthren-4-one 33.77 0.29 MOL007041 2-isopropyl-8-methylphenanthrene-3,4-dione 40.86 0.23 MOL007045 3α-hydroxytanshinoneⅡa 44.93 0.44 MOL007048 (E)-3-[2-(3,4-dihydroxyphenyl)-7-hydroxy-benzofuran-4-yl]acrylic acid 48.24 0.31 MOL007049 4-methylenemiltirone 34.35 0.23 MOL007050 2-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-5-(3-hydroxypropyl)-7-methoxy-3-benzofurancarboxaldehyde 62.78 0.4 MOL007051 6-o-syringyl-8-o-acetyl shanzhiside methyl ester 46.69 0.71 MOL007058 formyltanshinone 73.44 0.42 MOL007059 3-beta-Hydroxymethyllenetanshiquinone 32.16 0.41 MOL007061 Methylenetanshinquinone 37.07 0.36 MOL007063 przewalskin a 37.11 0.65 MOL007064 przewalskin b 110.32 0.44 MOL007068 Przewaquinone B 62.24 0.41 MOL007069 przewaquinone c 55.74 0.4 MOL007070 (6S,7R)-6,7-dihydroxy-1,6-dimethyl-8,9-dihydro-7H-naphtho[8,7-g]benzofuran-10,11-dione 41.31 0.45 MOL007071 przewaquinone f 40.31 0.46 MOL007077 sclareol 43.67 0.21

2.2 新處方藥物干預STP的作用靶點預測 通過檢索TCMSP數據庫及靶點模型預測，匯總并去重后，得到新處方藥物的作用靶點，其中當歸相關靶點29個，赤芍相關靶點74個，丹參相關靶點60個，牛膝相關靶點96個。通過DisGeNET數據庫、GeneCards平臺和OMIM平臺收集STP相關靶點11984個。運用生物信息學與進化基因組學網站的韋恩圖繪制功能，將新處方藥物作用靶點和STP相關靶點取交集，獲得新處方藥物干預STP的靶點101個，繪制韋恩圖（圖1）。

2.3 藥物-成分-靶點-疾病網絡構建 利用網絡圖形化工具Cytoscape 3.7.2對新處方藥物干預STP的作用靶點進行關系網絡繪制和統(tǒng)計，得到網絡關系圖，見圖2。

2.4 新處方藥物干預STP靶點PPI網絡分析結果 登陸STRING數據庫，上傳新處方藥物干預STP的靶點，設定 置信度評分分值＞0.9，將獨立于網絡之外的蛋白予以排除，得到PPI網絡（圖3）。該網絡共包含節(jié)點100個，邊209條，平均度值為4.18。網絡中的“節(jié)點”代表靶點，“邊”表示靶點間的相互作用關系。Degree和BC反映了節(jié)點在網絡中核心度的高低，度值越高，表 明該節(jié)點在網絡中就越重要。本研究運用Cytoscape軟件中的cytoNCA插件[14]，按Degree值和BC值大小排序篩選新處方藥物干預STP的核心成分和靶點，并構建網絡圖（圖4）。結果表明，槲皮素（MOL000098）、山奈酚（MOL000422）、豆甾醇（MOL000449）等有效成分以及PTGS1、NCOA2、NCOA1等靶點度值較高，說明這些有 效成分和靶點在網絡中的作用顯著，是和其他靶點互通的紐帶。

圖1 新處方藥物作用靶點及STP相關靶點韋恩圖

圖2 新處方藥物干預STP的藥物-成分-靶點-疾病網絡關系

圖4 核心成分及靶點網絡圖

2.5 關鍵靶點基因生物功 能及通路分析以Bioconductor和ClusterProfiler為平臺分析新處方藥物干預STP靶點的KEGG pathway信號通路富集分析。結果表明，KEGG通路富集得出121條結果，有106條通路的P值＜0.01。以P值和基因的數量為篩選條件，取前20位的通路進行分析并可視化，結果表明，基因顯著富集在流體剪切應力與動脈粥樣硬化、TNF、p53、AGE-RAGE等信號通路上（圖5）。

圖5 關鍵靶點KEGG通路富集分析

3 討論

中醫(yī)藥干預STP效果顯著，但基礎研究較少，其具體作用機制尚不完全明確。本研究以網絡藥理學理論為指導分析發(fā)現，新處方中當歸、赤芍、丹參、牛膝4味藥物中的槲皮素、山奈酚、豆甾醇等有效成分可以通過介導PTGS1、NCOA2、NCOA1等靶點，調控流體剪切應力與動脈粥樣硬化、TNF、p53、AGE-RAGE等信號通路發(fā)揮干預STP的作用。

槲皮素是黃酮類化合物，在植物中廣泛存在。國外學者通過實驗發(fā)現[15-16]，槲皮素可以抑制血小板的凝血功能，有效增加小鼠的血液灌注量。孫軍等[17]發(fā)現，槲皮素可通過激活PI3K/Akt信號通路，對過氧化氫（H2O2）誘導的血管內皮祖細胞（endothelial progenitor cells, EPCs）氧化應激損傷起到修復作用。豆甾醇是植物甾醇的一種，化學結構是C29H48O，雙鍵結構使其易于被氧化，可有效降低氧化應激[18]。黃建春等[19]發(fā)現，玉郎傘中的豆甾醇對連苯三酚氧自由化產生氧自由基和鄰二氮菲-Fe2+/H2O2產生羥自由基(OH)有顯著的清除和抑制作用，證實豆甾醇具有體外抗氧化活性。山奈酚是黃酮類化合物，多見于洋蔥、白菜、茶葉等植物中?？倒鹛m等[20]研究發(fā)現，山奈酚可以介導AMPK-Nrf2-HO-1信號通路，發(fā)揮抑制氧化型低密度脂蛋白(oxidized low-density lipopro-tein, ox-LDL)誘導的人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)活力降低作用，抑制細胞凋亡和炎性因子、黏附分子的表達，緩解氧化應激反應。

前列腺素內過氧化物合酶（prostaglandin endoperoxide synthase, PTGS）也稱環(huán)氧合酶（cyclooxygenase, COX），有兩個亞型，即PTGS1（COX-1）和PTGS2（COX-2）。研究發(fā)現，在特定的病理狀態(tài)下，COX-2表達抑制，COX-1表達增多，可導誘導血栓素A2（thromboxane A2, TXA2）合成增多，進而誘發(fā)血管收縮，導致管腔狹窄、血液不正常凝集，形成血栓[21]。類固醇激素受體的輔助激活因子（steroid receptor coactivator,SRC）包含SRC-1（NCOA1）、SRC-2（NCOA2/Tif2）和 SRC-3（NCOA3/RAC3/TRAM-1）3個家族成員。Yu等[22]研究發(fā)現，NCOA2基因的表達可以調控Wnt/β-catenin信號通路激活表達。研究證實Wnt信號參與多種血管疾病的病理生理過程，包括脂質浸潤、炎癥、纖維化、鈣化和血管生成等[23]。上述研究從側面反映了NCOA2可能通過上調Wnt/β-catenin信號通路的表達參與靜脈管壁病理性改變，但NCOA2和循環(huán)系統(tǒng)疾病關系的研究較少，二者的關系還需進一步研究發(fā)掘。

研究證實，病理性剪切力會激活內皮細胞活性，使之由抗栓向促栓轉變，誘導促血小板黏附等病理性改變，誘發(fā)內皮細胞炎性改變[24-26]。糖基化終末產物（advanced glycation end products，AGE）及其受體（receptor for AGE，RAGE）被證實可以引起氧化應激和炎癥反應[27]。Wang等[28]證實，脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）可激活NF-κB信號通路，增加血管內皮細胞通透性，而RAGE在這一過程中起到關鍵作用。Yokoyama等[29]研究發(fā)現，內皮p53可以負反饋條件內皮依賴性血管舒張和缺血誘導的血管生成，介導缺血性內皮損傷。Song等[30]研究證實，p53可介導長鏈非編碼RNA Meg3的信號傳導，調節(jié)VEGF、HIF-1α、CRP和ICAM等p53相關基因的表達，減輕血管緊張素II誘導的人臍靜脈內皮細胞損傷。腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor alpha，TNF-α）是重要的炎癥反應介質，可上調內皮細胞和白細胞中ICAM-1的表達，增強白細胞與血管內皮之間的黏附反應，介導炎癥反應[31]。實驗研究證實，靜脈炎模型兔體內的TNF-α、IL-6、IL-1β等炎性指標顯著高于空白組[32]。Poredo?等[33]通過檢測急性血栓性淺靜脈炎患者血液炎癥指標，如TNF-α等水平發(fā)現，血液炎癥標志物水平與血栓性淺靜脈的再通率呈負相關，表明炎癥可能通過促凝血和抗纖溶作用抑制血栓的溶解，影響靜脈的再通。

綜上所述，本研究在網絡藥理學理論指導下，對新處方藥物干預STP的機制進行預測，結果表明，新處方藥物的槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇等核心成分可能通過調控PTGS1、NCOA1、NCOA2等靶點，介導流體剪切應力與動脈粥樣硬化、AGE-RAGE、p53、TNF-α等信號通路發(fā)揮抑制炎性反應、保護內皮細胞等藥理作用。目前，STP與上述核心成分、關鍵靶點和通路的相關性研究較少，本研究結果可為中醫(yī)藥干預STP的機制研究提供新的思路。本研究存在一定的局限性，一是各大數據庫存儲的資料不完整；二是中藥有效成分復雜，且給藥方式多樣，在體內的代謝過程不能完全明確；三是藥物有效成分及其靶點的篩選過程會受到研究者的主觀態(tài)度影響。因此，中醫(yī)藥治療STP的機制有待進一步實驗驗證。