大承氣湯對腸梗阻解除后大鼠腸機械屏障損傷的保護作用

馬軍宏，李東華，劉晉津，吳 騰，于向陽，周振理

腸梗阻是臨床常見的急腹癥，凡腸內(nèi)容物不能正常運行或通過發(fā)生障礙時稱之為腸梗阻。腸梗阻發(fā)生時出現(xiàn)腸黏膜結構和功能的嚴重損害，引起急性腸黏膜損傷，嚴重時誘發(fā)腸屏障功能障礙，引發(fā)全身感染、內(nèi)毒素血癥、全身炎性反應綜合征（systemic inflammatory response syndrome，SIRS）、多器官功能障礙綜合征（multiple organ dysfuction syndrome ，MODS），導致腸功能障礙甚至衰竭。中醫(yī)藥對恢復腸道功能及保護腸屏障功能有一定的療效。中醫(yī)將腸梗阻歸屬于“關格”“腸結”等，辨證多為陽明腑實證，通里攻下法簡稱“下法”，大承氣湯是其代表方劑，可調(diào)整腸道生理功能，改善腸梗阻腸道通透性，改善胃腸道屏障功能，促進胃腸功能恢復。本研究通過建立可復性腸梗阻模型，檢測D-乳酸及腸上皮緊密連接蛋白（Claudin）-1 mRNA 水平，探討大承氣湯對腸梗阻解除后大鼠腸屏障損傷的保護作用，為臨床應用提供理論根據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物 健康SPF級Wistar大鼠30只，雌雄不限，體重250～270 g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司（SCXK京2019-0008）。實驗前在天津市中西醫(yī)結合急腹癥研究所標準動物實驗中心適應1周，給予標準飼料和水喂養(yǎng)，不限制食水。通風、清潔、20～25 ℃環(huán)境下，相對濕度（50±10）%，明暗交替周期為12/12 h。自由進食、飲水。

1.2 方藥 大承氣湯（選自傷寒論）：由大黃、厚樸、枳實、芒硝按4:3:3:1.5比例配伍，水煎煮，濾液濃縮為100%（生藥含量為1 g/mL）藥液。由天津市南開醫(yī)院急腹癥研究所藥劑科統(tǒng)一制備，滅菌處理，分裝處理，置于4℃保存。待梗阻解除后每日給予大鼠標準飼料喂養(yǎng)，分別給予制備好的大承氣湯（1ml/100g），每日2次灌胃。

1.3 主要試劑 D-乳酸ELISA盒（E02D0015，上海BlueGene Biotech公司）；動物組織總RNA提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司）；反轉錄試劑盒：RevertAid First Strand cDNA Sythesis Kit（美國，Thermo公司）；實時熒光定量PCR（RTPCR） 試 劑 盒：Maxima SYBR Green/Fluorescein qPCR Master Mix(2×) (Thermo，美國 )。

1.4 大鼠可復性腸梗阻模型制備

1.4.1 無損傷腸管阻斷夾制作 將雙扁鐵心扎線（寬3.0 mm，夾心金屬直徑0.3 mm，以下稱為扎線）統(tǒng)一截取長度為16 mm，以一次性使用10 Fr導尿管模擬末段回腸，將扎線圍繞在導尿管外側制作成“Ω”型，即“無損傷腸管阻斷夾”，阻斷夾周長為10 mm，兩端各彎曲3 mm以防刺破腸管，過硅油，制作完成后高壓滅菌備用。

1.4.2 可復性腸梗阻模型制作 大鼠模型制作術前禁食12 h，禁飲6 h，以10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）腹腔注射麻醉。備皮、消毒，取腹中線下1/3作無菌皮膚切口，長約2 cm，逐層分離后進腹腔無菌操作打開腹腔暴露回盲部，用無損傷鑷輕柔將回盲部提出切口外，放于無菌紗布上。自回盲部向回腸末段方向約1 cm處尋找腸管相對較游離且腸系膜較長段，以眼科用止血鉗在該處小腸系膜無血管區(qū)戳孔，將自制無損傷腸管阻斷夾穿過腸系膜套于腸管外并夾閉，以形成“外壓式”梗阻裝置，造成腸腔完全性梗阻。用溫生理鹽水將腸管表面異物沖洗干凈，還納至腹腔原位，術中向腹腔內(nèi)滴注5%左氧氟沙星葡萄糖注射液約1 mL，逐層關閉腹腔。正常對照組不做處理。需要解除梗阻時，麻醉后進腹找到梗阻點將無損傷腸梗阻阻斷夾移除。

1.5 動物分組、給藥及取材 將造模后大鼠分為模型組和中藥組（每組12只），對照組6只為非造模組。中藥組于梗阻解除后開始給予大承氣湯灌胃干預（1 mL/100 g），每日2次灌胃，連續(xù)96 h。模型組給予相同劑量的生理鹽水灌胃干預（1 mL/100 g），每日 2次灌胃，48 h、96 h后麻醉滿意后開腹（每個時間點隨機取6只），經(jīng)腹主動脈取血5 mL，注入預置抗凝劑的試管，3000 r/min×15 min離心后收集血清，取500 μL血清快速分裝后于-20 ℃凍存待測；取梗阻近端1 cm處小腸2 cm，去除腸腔異物，以預冷的生理鹽水反復沖洗干凈，然后用無菌醫(yī)用紗布吸干，分裝并編號立即投入液氮，隨即轉入-70 ℃超低溫冰箱內(nèi)凍存待行RT-PCR。

1.6 檢測指標及方法

1.6.1 血清D-乳酸 采用大鼠D-乳酸ELISA試劑盒檢測。將試劑盒室溫（20～25℃）放置30 min，取酶標板，將標準品各50 μ L依次加入空白微孔中，加入50 μ L的樣本，對照孔則加入50 μL PBS液，各孔加入100 μL的酶標記液后用封板膜密封酶標板，37℃反應60 min，充分清洗酶標板5次，保持各孔有充足的水壓（濃縮洗滌液以1:100的比例與蒸餾水稀釋），酶標板洗滌后以吸水紙徹底拍干，各孔加入準備好的顯色劑A，B各50 μL，37 ℃避光反應10～15 min，各孔加入50 μL終止液以終止反應，檢測450 nm波長處OD值，以標準品的濃度為橫坐標（對數(shù)坐標），OD 值為縱坐標（普通坐標），在半對數(shù)坐標紙上繪出標準曲線，由樣品的OD值標準曲線查出相應的濃度，乘以稀釋倍數(shù)即得血清目標濃度。

1.6.2 腸上皮Claudin-1 mRNA表達測定 采用RT-PCR方法檢測各組大鼠小腸上皮Claudin-1mRNA表達情況。

1.6.2.1 引物設計及合成 引物由上海Invitrogen公司設計并合成，Claudin 1上游引物:5'-TAC ACACATGCCTCCAATGCCGTTC-3'產(chǎn)物大小199 bp。Claudin 1下游引物:5'-CCAAG ATGCAAATCCAGGTCTACCC -3'。β-actin 上游引物:5'-ACAACCTTCTTGCAGCT CCTC-3'產(chǎn)物大小198 bp。β-actin下游引物：5'-GACCCATACCCACCATCACAC-3'。

1.6.2.2 總RNA提取 組織每10～20 mg加入300 μL Trizol裂解液，使用移液槍將混合液吹至澄清，12 000 r/min離心5 min，留取上清液，加入氯仿渦旋混勻，室溫靜置30 min后，在4 ℃下，12 000 r/min離心5 min，取上層上清液，加入等量異丙醇，置于-80 ℃過夜。

1.6.2.3 cDNA的合成 取出總RNA溶液室溫融化，在4 ℃下，12 000 r/min離心5 min，棄上清，管底可見白色或淡黃色RNA。加入75%乙醇，緩慢上下顛倒混勻，在4 ℃下，12 000 r/min離心5 min，棄上清，加入無水乙醇溶解，放置于室溫中晾至溶劑揮干。用10～30 μL DEPC水溶解，瞬時離心洗滌沉淀，使用NanoDrop 2000測定RNA的濃度和純度。反應體系為20 μL，其中RNA模板5μL，5×Reaction buffer 4μL，Oligo dT primer 1μL，dNTP Mix 2μL，RiboLock RNase Inhibitor 1μL，RevertAid M-MuLV RT 1μL，Nuclease-free ddH2O 6μL。反應程序為：42℃60 min, 70℃ 5 min。根據(jù)HiFiScript cDNA合成說明進行反轉錄得到cDNA。

1.6.2.4 RT-PCR檢測Claudin-1mRNA表達水平反應體系為25 μL 其中cDNA模板1 μL，上下游引物（濃度為10 μmol/L）各0.5 μL, Maxima SYBR Green/Fluorescein qPCR Master Mix(2×)12.5 μL，Nuclease-free H2O 10.5 μL。反應程序為：95 ℃10 min熱啟動后開始循環(huán)：95 ℃15 s，60 ℃60 s共45個循環(huán)。熔解曲線的反應條件是起始溫度為55 ℃，每升高0.5 ℃停留20 s，直到95 ℃終止反應。反應結束后，按下列公式進行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析，用相對定量法分析結果，用Claudin1Ct值-β-actin Ct值，得到ΔCt；用處理組的ΔCt -空白組ΔCt的均值，得到ΔΔCt；各組與空白組比較Claudin1 mRNA的相對表達水平=2-ΔΔCt。

1.7 統(tǒng)計學分析 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件對本研究數(shù)據(jù)資料進行統(tǒng)計學比較分析。計量資料以均數(shù)±標準差表示，比較方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 腸梗阻解除后大鼠小腸組織病理學改變 對照組小腸黏膜各層結構完整，上皮排列有序，絨毛結構清晰，腸絨毛排列整齊，未見淋巴細胞增生及炎細胞浸潤。模型組48 h大鼠小腸黏膜和黏膜下層間質水腫、血管充血、黏膜層中性粒細胞浸潤、腸絨毛毛細血管充血、漿膜層明顯炎性滲出；梗阻緩解后96 h可見小腸黏膜微絨毛排列紊亂明顯，絨毛上皮細胞脫落。中藥組經(jīng)大承氣湯干預后與模型組對比，梗阻緩解后48 h未見明顯變化，至中藥干預96 h后，中藥組大鼠腸管微絨毛結構較模型組清晰，小腸黏膜上皮細胞排列有序，脫落壞死的絨毛上皮細胞明顯減少，漿膜層可見炎性滲出，腸絨毛毛細血管充血明顯減輕，見圖1。

2.2 血清D-乳酸含量變化 腸梗阻解除后模型組分別在48 h、96 h血清D-乳酸與對照組相比，無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）；中藥組大鼠在48 h、96 h血清D-乳酸含量明顯降低（P＜0.01），即大承氣湯灌胃后血清D-乳酸水平出現(xiàn)明顯下降，見表1。

圖1 各組小腸組織病理組織學改變（HE 40）

表1 各組大鼠血清D-乳酸比較

2.3 腸上皮Claudin-1mRNA表達水平改變 腸梗阻解除后模型組大鼠腸上皮黏膜Claudin-1mRNA表達降低（P＜0.05），大承氣湯組灌胃后大鼠腸黏膜Claudin-1mRNA水平于48 h、96 h與對照組比顯著提高（P＜0.01），見表 2。

表2 大鼠腸黏膜Claudin-1mRNA相對表達值

3 討論

腸梗阻發(fā)生后腸黏膜結構和功能受到損害，引起急性腸黏膜損傷，進而出現(xiàn)腸屏障功能障礙，誘發(fā)菌群移位、SIRS、MODS等，導致死亡等嚴重后果。腸黏膜屏障主要由機械屏障、生物屏障、免疫屏障及化學屏障構成，其中機械屏障是腸黏膜屏障的根本。腸機械屏障的完整性和連續(xù)性是腸黏膜屏障功能的解剖學基礎，小腸機械屏障損害是腸功能功能障礙最早的病生理改變，也是出現(xiàn)腸源性菌血癥、毒血癥的主要原因，其結構基礎是腸黏膜上皮細胞及細胞與細胞之間完整的連接。細胞之間最主要的連接方式是緊密連接，緊密連接是腸黏膜上皮細胞之間的主要連接方式，對于上皮細胞之間屏障功能及細胞之間穩(wěn)固排列發(fā)揮重要功能，對維持腸黏膜屏障機械結構完整和正常功能發(fā)揮起重要作用，緊密連接的破壞導致腸黏膜屏障受損[1]。

Claudins是緊密連接膜蛋白的家族成員，其表達數(shù)量及分布結構直接影響緊密連接的組織結構和功能[2-3]。Claudin-1基因是構成緊密連接的主要骨架蛋白之一，作為緊密連接蛋白原纖維形成的主要成分，并參與維持上皮細胞極性和調(diào)節(jié)腸屏障的通透性，對于維持腸上皮結構和功能，保護腸道屏障完整性起著重要作用[4-6]。緊密連接在腸腔發(fā)生病理性變化時可迅速發(fā)生動態(tài)改變，腸腔內(nèi)毒素迅速從腸上皮緊密連接處突破腸黏膜屏障[7]。根據(jù)前期實驗積累已經(jīng)確定腸梗阻模型48h后出現(xiàn)腸功能實質損害導致腸功能障礙[8]，本實驗通過建立了大鼠可復性腸梗阻模型，實驗觀察到隨著梗阻時間延長，Claudin-1呈逐漸下降趨勢，提示腸梗阻過程中腸屏障破壞嚴重，恢復腸屏障功能成為梗阻解除后腸功能恢復的治療重點和難點。本實驗觀察到給予大承氣湯干預后的回腸Claudin-1mRNA表達逐漸恢復，優(yōu)于模型組，筆者推測梗阻解除后應用大承氣湯可以明顯減輕腸黏膜上皮之間的緊密連接破壞，使微絨毛增多，從而提高緊密連接蛋白含量，同時可以保護腸黏膜細胞減少凋亡，以防緊密連接結構破壞進一步加重，維護腸黏膜屏障的完整性，進一步證實大承氣湯對腸梗阻解除后腸黏膜屏障損傷具有保護作用[9]，實驗結果表明通里攻下為治則的大承氣湯有助于保護腸道屏障功能，進而促進腸功能恢復。

D-乳酸是細菌發(fā)酵的產(chǎn)物，大腸桿菌、乳酸桿菌及克利伯菌等腸腔內(nèi)菌群均可以分解代謝產(chǎn)生。正常人體內(nèi)D-乳酸含量很少，腸梗阻發(fā)生后腸黏膜絨毛頂端上皮脫落，細胞旁路徑增加而致腸黏膜通透性增加，腸腔菌群大量繁殖，腸黏膜生物屏障被破壞，此時細菌產(chǎn)生的大量D-乳酸即經(jīng)過受損的腸黏膜進入血液系統(tǒng)，出現(xiàn)血中D-乳酸蓄積，血清D-乳酸可以反映腸損傷的程度[10]，臨床上常用作評價腸道損傷的有效標志物。中醫(yī)將腸梗阻辨證為“陽明腑實證”，應用大承氣湯通里攻下、行氣破滯，可清除細菌，中和降解內(nèi)毒素，改善腸道微循環(huán)，降低血管通透性，促進腸管運動，改善MODS時腸管平滑肌功能，具有修復組織的作用。本實驗中腸梗阻造模后血清D-乳酸水平持續(xù)升高，腸梗阻發(fā)生后腸道中細菌產(chǎn)生的大量D－乳酸可通過受損腸道黏膜入血，腸管通透性增加，進一步損傷腸黏膜屏障，因此測定D－乳酸可直接反映腸黏膜損傷程度。解除梗阻后給與大承氣湯干預后，中藥組大鼠血清D-乳酸水平下降明顯優(yōu)于對照組及模型組。中藥干預后96 h，大承氣湯組大鼠D-乳酸水平已接近正常水平，提示腸黏膜屏障已基本恢復，證實通里攻下法正是“陽明腑實證”治療的“金標準”。

大承氣湯出自《傷寒論》，由大黃、厚樸、枳實和芒硝四味藥組成，具有通里攻下，峻下熱結之功，主治大便不通，頻轉矢氣，脘腹痞滿，腹痛拒按，按之硬，甚或潮熱譫語，手足濈然汗出之陽明腑實證，是通里攻下的著名代表方。君藥大黃所含活性化學成分最多,其中蒽醌類化合物能改善腸黏膜血流灌注，對緩解腸黏膜缺血缺氧有重要作用，其主要機制可能是通過維持腸黏膜細胞的正常結構、細胞間連接及絨毛高度，防止或修復腸黏膜萎縮及損傷，保護腸黏膜的完整性[11-12]。在對通里攻下法對MODS腸屏障功能保護作用的研究中，以示蹤劑觀察腸黏膜和腸細胞膜通透性，大承氣湯可以明顯降低細胞間質、腸細胞內(nèi)的鑭顆粒明顯，說明其可有效降低模型動物腸黏膜和腸細胞膜的通透性，有助于減輕腸黏膜組織的病理損害。研究還發(fā)現(xiàn)大黃能興奮腸壁M樣受體，促進腸蠕動，清除腸麻痹，增強腸張力并減少水分的吸收。在對MODS的大鼠腸道運動障礙使用大承氣沖劑治療時可見，大承氣沖劑能明顯提高大鼠傳輸功能及肌電慢波頻率和振幅，證實了大承氣沖劑可明顯促進MODS鼠腸蠕動，保護和增強胃腸運動功能。在缺血-再灌注損傷過程中，大黃還可以下調(diào)腸上皮細胞的凋亡基因ICE mRNA表達，并有效降低腸上皮的凋亡。厚樸酚是從厚樸中提取的一種含有酚羥基的生物活性物質，可以干預休克和感染打擊下的細胞因子調(diào)控，修復胃腸動力障礙的作用[13-14]，同時實驗研究發(fā)現(xiàn)厚樸可改善膿毒癥所致胃腸運動障礙的功能[15]。芒硝在腸內(nèi)不易被吸收, 使腸內(nèi)滲透壓升高, 大量水分保留在腸腔, 機械性刺激腸壁而致瀉。大黃與芒硝配伍有“增水行舟, 潤燥軟堅”之功效, 致瀉作用增強[16]。

為研究清腸化濕方對實驗性大鼠結腸炎結腸組織Claudin-1表達水平的影響，翟金海等[17]用免疫組化觀察結腸上皮Claudin-1蛋白的表達情況，用實時熒光定量PCR法檢測Claudin-1 mRNA相對表達水平，結果發(fā)現(xiàn)清腸化濕方可明顯減輕大鼠結腸炎模型結腸組織Claudin-1蛋白損傷，保護緊密連接，保護腸黏膜屏障，從而達到治療潰瘍性結腸炎的目的。重癥急性胰腺炎時血漿內(nèi)毒素及D-乳酸濃度升高，此時即存在腸黏膜屏障損傷，腸黏膜通透性增加，腸黏膜組織Claudin-1mRNA、蛋白表達顯著降低，表明重癥急性胰腺炎時腸組織緊密連接遭到破壞，給予氧化苦參堿干預治療后，血漿內(nèi)毒素、D-乳酸濃度逐步降低，腸黏膜組織Claudin-1mRNA、蛋白表達逐步提高，說明腸黏膜屏障損傷得到修復，改善了腸黏膜通透性，抑制腸道細菌移位；同時氧化苦參堿通過靶向調(diào)控蛋白Claudin-1限制腸上皮細胞旁間隙通透性的機制，為預防和治療重癥急性胰腺炎繼發(fā)腸黏膜屏障損害提供了新途徑[18-19]。白小武等[20]觀察到大黃素能增加腸缺血再灌注大鼠腸黏膜Claudin-1含量，提示大黃素可以緩解腸缺血再灌注造成的腸道損傷、保護腸上皮細胞間緊密連接，對腸黏膜屏障具有保護作用。

腸梗阻發(fā)生后腸黏膜上皮屏障明顯受損，為防止腸道內(nèi)細菌及其毒素進入機體，保護連續(xù)、完整及正常的黏膜上皮及其連接，本實驗對腸梗阻解除后應用大承氣湯提高Claudin-1mRNA的表達水平，降低大鼠血清D-乳酸水平，證實了大承氣湯可以改善上皮細胞功能，從而維持屏障結構及功能的完整性。