水產用蛭弧菌11問

水產用蛭弧菌近幾年又火了起來，因為化學消毒劑在控菌方面雖然效果來得快，但在控菌時間上面存在著嚴重的缺陷，用后12～24h左右，總菌數就有可能反彈超標，而水產用蛭弧菌在這方面恰恰存在著一定的優(yōu)勢，但是作為一個生物制劑，其不確定性也存在很多方面，為此作者將用11個小問題來圍繞蛭弧菌做一些講解，希望能讓大家更好的了解蛭弧菌產品。

1 蛭弧菌是什么？

在水產養(yǎng)殖技術上，只要你不徹底排斥消毒，那么蛭弧菌就是繞不開的一個產品。

首先要了解什么呢？最簡單的，我們要知道蛭弧菌到底是什么？——蛭弧菌是一種生物消毒劑！

人類目前擁有三種消毒方法：物理消毒法、化學消毒法、生物消毒法。

其中生物消毒法會用到生物消毒劑，它包括：植物提取物、細菌、噬菌體、生物酶、抗菌肽，這其中的的細菌一般就是指蛭弧菌。

蛭弧菌實際是在1962年由Stolp和Petzold首次發(fā)現于菜豆葉燒病假單胞菌體中，隨后從土壤、污水中都分離到了這種細菌。所以蛭弧菌從發(fā)現到現在才不過50多年的時間。

蛭弧菌命名為Bdellovibriobacteriovorus。其中，Bdello一詞來自希臘字，是“水蛭”的意思，“vibrio”意為“弧菌”，而種名“bacteriovorus”是“食細菌”的意思。其命名很有意思，“水蛭”代表了其生理上的一些動作形為，蛭弧菌的捕食生活方式很特殊，它是寄生于其他細菌并能導致其裂解的一類細菌。請注意，蛭弧菌不是從外到內吃掉其他細菌，而是鉆到其他細菌體內，從內到外裂解其它細菌。

另外有，有些人一直分不太清楚噬菌蛭弧菌和噬菌體，實際很簡單，前者是吃細菌的細菌，后者是吃細菌的病毒。

2 蛭弧菌到底長什么樣子

首先蛭弧菌很小，0.3～0.6×0.8～1.2um，1mm的長度可以并排放2,500個左右，長度大概為桿菌的三分之一至五分之一，顯微鏡中至少要用到油鏡才能看得到它，而且要在染色的情況下。因此被稱為“世界上最小的捕食者”之一。

想像一下小蝌蚪，蛭弧菌差不多就是這個外形。它的腦袋呈弧形或者桿狀，有時候也呈螺旋形，外加一個長尾巴鞭毛，與鞭毛相對的一端有釘狀纖毛，被稱為“感染錐子”。它的鞭毛很牛，明明個子比細菌要小不少，但鞭毛卻比一般細菌的粗3～4倍。

3 蛭弧菌有什么獨門絕技？

蛭弧菌有兩個獨門絕技可以打破敵人的防御，一是鐵頭功，二是無敵風火輪。

蛭弧菌入侵細菌的方式非常獨特，首先，它到處游動，實際上一般10min左右它就會找到可以寄生的細菌，也就是宿主菌。然后它就用鐵頭功，猛烈碰撞宿主細胞，速度每秒高達100個細胞長度，如果是人的話，速度就是每秒一百七八十米，瘋狂的撞擊，無鞭毛的那一端附著于宿主細胞壁上，不過100次的碰撞大概只會有3次成功，相當不容易。

吸附成功后，蛭弧菌采用無敵風火輪，開始瘋狂旋轉，每秒幾乎能達到100轉，從鉆孔到進入只需幾秒種。不過進入宿主細胞之后，鞭毛就會不要了。

4 蛭弧菌的繁殖速度快么？

為什么使用蛭弧菌48小時后才能做平板檢測？為什么蛭弧菌的見效時間這么長？

這主要是和蛭弧菌的繁殖速度有關系。實際上蛭弧菌生長速度是很慢的：

4.1 繁殖代時長

蛭弧菌繁殖一代的時間需要大概4h左右，在試驗室狀態(tài)下，大腸桿菌17min一代，枯草芽孢桿菌30min一代，這之間的差距是非常大的。

4.2 蛭弧菌不是指數級增長

蛭弧菌是自我復制式的生殖，一次可以產生6～36個后代。8h的極限數值才不過36×36=1,296個，如果是枯草芽孢在極限狀態(tài)下，8h可產生65,536個后代，相差近51倍。

這就是蛭弧菌一個很大的問題，所以在實際使用的時候，建議加大劑量，或者連續(xù)多天使用。

5 蛭弧菌殺菌有選擇性么？

蛭弧菌能區(qū)分善惡么？——可能么？即便是不做研究，我個人都認為不可能，自然界中會存在這樣一種微生物？它知道我們水產養(yǎng)殖的有益菌有哪些而不進攻它們？

蛭弧菌與宿主細胞之間，常表現出一定的特異性。不過，有的特異性較差，能侵入多種細菌。例如不同的蛭弧菌菌株，能侵入各類不同的植物病原菌。

從這一點上看，其比噬菌體（病毒）、細菌素（蛋白質）的廣譜性要好。實際上蛭弧菌可感染許多不同科屬的菌，但其總體上有一定偏向性，比如其可感染大多數革蘭氏陰性細菌（如志賀氏菌屬、沙門氏菌屬、埃希氏菌屬、歐文氏菌屬、變形桿菌屬、弧菌屬、假單胞菌屬、鉤端螺旋體等微生物），但只對少數的革蘭氏陽性細菌感興趣，同時也有報道指出其對某些真菌和腸道病毒也有一定的裂解活性。

圖1 （出自：孫秋平.蛭弧菌的分離純化及保質期的研究[D].華南理工大學,2014.）

圖2 48,000倍下的蛭弧菌[出自：宋志萍、蔡俊鵬、王志、韓韞，蛭弧菌的分離及其生長條件和裂解能力的研究，微生物學報，2005，45（4）：573.]

圖3 氦離子顯微鏡下的蛭弧菌（像素大小0.75納米）[出自：Said N ,Chatzinotas A ,Schmidt M .Have an Ion on It:The Life-Cycle of Bdellovibrio bacteriovorus Viewed by Helium-Ion Microscopy[J].2018.]

——寄生的特異性也對我們的實際使用方法有很大的影響，即蛭弧菌是不是不管好菌壞菌都會攻擊？如果是這樣的話，那么很難被我們所用了，但實際上，其有一定傾向性，這就給我們實際的應用提供了更多的可能性。

郭衍彪（2016年）的研究指出，蛭弧菌BDW03對試驗組大菱鲆腸道沒有控制作用的菌屬為8個（占53.3%），這8個菌屬中多為革蘭氏陽性菌屬（6/8）。另外，其通過乳酸菌拌食餌料和潑灑BALOs喂食大菱鲆60d后，乳酸菌和BALOs對大菱鲆腸道菌群中革蘭氏陰性菌的控制作用（分別占總菌屬的33.3%和26.7%）優(yōu)于對革蘭氏陽性菌的控制作用（分別占總菌屬的（26.7%和20.0%）。這也間接指出了蛭弧菌對細菌的裂解可能有一定的偏向性。

另外，結合陳家長等人（2003）、徐琴等人（2006）、陳麗蕓（2012）的研究，我們至少可以獲得以下結論。

第一、不同類型的蛭弧菌能裂解的宿主菌是有差異的；

第二、蛭弧菌可以和光合細菌中的球形紅假單胞菌混合使用，也可以間隔7d使用，外潑效果都非常好。蛭弧菌和粘紅酵母混合使用，外沷效果不佳；同時外用蛭弧菌的效果控制時間至少可以達到2周，即14d的時間。而且這還是受限于方案的要求。

第三、蛭弧菌不裂解乳酸桿菌。

第四、在斑節(jié)對蝦的試驗研究中，蛭弧菌和枯草芽孢桿菌混合外沷使用沒有單獨使用蛭弧菌效果好。但混合使用比不使用的對照組在控制總菌上效果要好。

第五、對大菱鲆的內服研究表明，蛭弧菌對腸道內芽孢桿菌屬的增殖影響比較小。

6 蛭弧菌和化學消毒劑的差別在哪里？

化學消毒劑包括抗生素的殺菌都有一個特征，來得快去得快，在達到一定濃度下，化學消毒劑的效力可能會在4個小時左右達到最高峰，細菌總數下降到最低，然后細菌總數會出現反彈，但消毒劑仍有效果，總菌數有可能在12～24h左右反彈超標，超過原來的細菌總數，當然，細菌的種類發(fā)生了變化。

而蛭弧菌可能在前1～2d內看不出來什么效果，但如果其能發(fā)揮效果，那么控菌的時長有可能達到15d以上，甚至20d以上，在此期間，總菌數、弧菌數相對于對照組可能會低1～2個數量級。

比如張呂平等人（2009）的研究指出，對蝦池水體分別潑灑二氯異氰脲酸、季胺鹽絡合碘和蛭弧菌。當每隔20d左右分別進行一次上述水體處理,通過比較體內弧菌感染的對蝦個體數,發(fā)現從肝胰腺分離到弧菌的對蝦數量二者無顯著差異,但從血淋巴分離到弧菌的對蝦數量,蛭弧菌處理組顯著少于化學消毒劑處理組。

能長期控菌，這是蛭弧菌的優(yōu)勢所在，也是與化學消毒劑最大的差異所在。

7 蛭弧菌耗氧么？可以擴培么？

蛭弧菌是嚴格的好氧菌，它的繁殖需要氧氣，但它對池塘的溶氧幾乎又沒有什么干擾，為什么？因為它的繁殖速度太慢了。

有多慢，請參看上第四問。

另外，我們都知道，可以用紅糖等碳源對乳酸菌及EM菌進行擴培，那蛭弧菌可以用這些營養(yǎng)物質擴培么？很明確，不可以。

因為蛭弧菌不利用碳水化合物，所以無法用碳源進行擴培。

實際上從自然界分離得到的蛭弧菌都是依賴寄生型，迄今為止，還沒有直接從自然界分離得到非寄生型。不依賴宿主的蛭弧菌，只能生活在實驗室條件下。

8 蛭弧菌有哪些產品可以選擇？

市面上的蛭弧菌有三種：液體的、粉末狀的、凍干粉。

圖4 氦離子顯微鏡下的大腸桿菌（左）和葡萄球菌（右）細胞被蛭弧菌感染的圖片。像素尺寸為1nm。[出自：Said N ,Chatzinotas A ,Schmidt M .Have an Ion on It:The Life-Cycle of Bdellovibrio bacteriovorus Viewed by Helium-Ion Microscopy[J].2018.]

圖5 蛭弧菌的繁殖周期示意圖[出自：Makowski L ,Trojanowski D ,Till R ,et al.Dynamics of chromosome replication and its relationship to predatory attack lifestyles in Bdellovibrio bacteriovorus[J].Applied and Environmental Microbiology,2019,85(14):-.]

液體使用方便，但菌數容易掉。而且蛭弧菌液體的產品始終面臨保存的問題，實際上也有很多的論文對此做了研究，有的文章指出，大多數的液體蛭弧菌產品在4℃的環(huán)境下，可以保存8個月以上，少數6個月以上。但在25℃的環(huán)境下，蛭弧菌液體產品的保質一般只在4～6個月了。當然隨著保護劑的不斷研發(fā)，隨著添加不同的保護劑，在4℃的環(huán)境下，某些液體產品的保質期可以達到15個月以上，有的可以達到兩年以上，但是所有的保存環(huán)境溫度都指向4℃，這對我們實際的銷售場景是不太相符的。當然，液體也有好處，菌種復蘇時間快，如果從實際銷售出發(fā)，建議在經銷點增設冷藏柜，這樣可以延長液體產品的保持期。

粉末狀有些說是托盤凍干的，有裝到鋁箔袋中的，也有裝到西林瓶中的。

原裝凍干粉則是近幾年推出的產品，菌種的穩(wěn)定性是無與倫比的，只能裝到西林瓶中，而且每一瓶都必需是真空包裝的。在相關的研究中，4℃的環(huán)境下，添加了保護劑的蛭弧菌液體產品在13個月后其復蘇率為100%，而同樣的環(huán)境下，凍干產品在21個月后其復蘇率仍為100%。

而且真正的蛭弧菌原裝凍干產品，具有以下優(yōu)點：

冷凍干燥生產工藝是在低溫下進行的，對于許多熱敏性的物質特別適用。蛭弧菌不會發(fā)生變性或失去生物活力，這一點非常重要。

整個冷凍生產過程基本上是在低溫真空狀態(tài)下完成的，在這種狀態(tài)下，微生物的生長和酶作用是受到抑制的，可以很好的保證蛭弧菌產品的穩(wěn)定性。

因在真空下操作，氧氣極少，因此，一些易氧化的物質（如油脂類）得到保護。

冷凍干燥法能排除95%～99%以上的水分，產品能長期保存而不變質。

以上就是蛭弧菌凍干產品的優(yōu)勢所在，也是其穩(wěn)定性的保障所在。

9 蛭弧菌的凍干粉是如何生產的？

蛭弧菌凍干粉的生產需要兩組機器，一是發(fā)酵罐，二是凍干機，前者幾十萬，后者近百萬，硬件投資算是一個門檻。

9.1 發(fā)酵

蛭弧菌的發(fā)酵和其他產品就差別很大，蛭弧菌的發(fā)酵前后需要一周的時間，在微生物的發(fā)酵時間上，算是最長的一類了，生產起來較為麻煩。

9.2 凍干

凍干則更是一個精細的活了。

其基本流程包括：灌裝、裝蓋、擺盤、凍干、壓蓋。當然可能使用一些自動設備，在具體的步驟上會略有差別。但總體步驟變化不大。

半成品進入凍干機后，通過凍結、升華、再干燥三個過程，通過升華過程將母液中的冰幾乎全部散發(fā)掉后，再由機器統(tǒng)一壓蓋，保證每一瓶產品內均處于“真空”狀態(tài)。

10 蛭弧菌原裝凍干粉有什么特點？

蛭弧菌原裝凍干粉的概念是我在2018年底提出，特指蛭弧菌母液和西林瓶一起在凍干機中完成凍干，每一瓶成品均為真空狀態(tài)的產品。

這種產品有自己非常明顯的一些特點：

第一、每一瓶都是真空，打開蓋子能聽到“嘭”的一聲。

第二、橡膠塞子帶導氣槽，和普通的塞子有明顯差別；

第三、里面的產品不是粉狀的，是塊狀物，左右搖晃很明顯；

第四、里面的塊狀物是速溶的，一秒即溶。

蛭弧菌原裝凍干粉最大的特點就是產品的質量穩(wěn)定性非常好。

圖6 在不同時間點掃描蛭弧菌與大腸桿菌。蛭弧菌附著其獵物（10min≤t≤30min）、蛭質體的形成和演化（t＞20min）、蛭質體的溶解（t=3h）清晰可見 [出自：Said N ,Chatzinotas A ,Schmidt M .Have an Ion on It:The Life-Cycle of Bdellovibrio bacteriovorus Viewed by Helium-Ion Microscopy[J].2018.]

11 蛭弧菌如何使用？

首先，購買幾瓶產品，使用前檢測一次弧菌平板，使用48h后再檢測一次平板，至少2～3個試驗組，同時一定要有對照組，通過試驗看效果，如果有效，則建議再行使用。之所以要劃平板，因為蛭弧菌不是萬能的，也不是在所有水體都可以存活的。

建議使用方法有這樣幾種：

一、在某些疾病發(fā)病高峰前的5～10d進行使用，加大2～3倍劑量使用效果更好。

二、在蝦、蟹等甲殼類動物脫殼前5～10d使用，保護脆弱的脫殼期水產養(yǎng)殖動物。

三、在較長陰雨天前5～10d使用，防止陰雨天滋生大量有害細菌。

四、某些養(yǎng)殖動物剛發(fā)疾病，可以試著連用2d，每天1瓶凍干粉用2畝。

五、疾病已發(fā)，動物開始死亡，肯定首先要使用化學消毒劑，比如找到保真的過硫酸氫鉀，先消毒，間隔24h后再使用蛭弧菌進行長期控制。

六、可以和光合細菌進行配合使用。

使用蛭弧菌的核心要求很清晰：一定要能長期的幫助我們水產養(yǎng)殖控制總菌數、異養(yǎng)菌數甚至弧菌數的繁殖，將異養(yǎng)菌或者弧菌的生長壓制到一定數量之下，防止它們達到暴發(fā)疾病的臨界值。

蛭弧菌雖然表達了很好的效果，但還要看一些公司的產品質量，因此建議大家要會初步的使用平板，并且通過對比和多試驗組判定效果。另外使用蛭弧菌也要記準一點，不會有萬能的產品，只會有合適的產品，多種方法、多種產品的配合可能會達到更好的效果。