非諾貝特微球?qū)Ω哐Ｐ痛笫蠼抵饔醚芯?

付 琳，蘇 瑾，楊春榮，孫維彤，張向宇，孟祥祎，張 杰

(佳木斯大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007)

非諾貝特緩控釋是目前臨床上常用的一種降高血脂癥的藥物[1]。目前市面常見(jiàn)的劑型均為口服緩控釋制劑，口服緩控釋制劑多具有明顯的生物化學(xué)利用度相對(duì)較低、代謝緩慢和失活速度快的重要生理缺陷[2-4]。聚乳酸-羥基乙酸共聚物是一種高分子載體材料，具有良好的成囊性和生物相溶性，并能在體內(nèi)降解為乳酸和α羥基乙酸[5-7]。因此，制備非諾貝特PLGA微球新藥物有重要的臨床意義。通過(guò)對(duì)非諾貝特緩釋微球的研究[8-9]，將非諾貝特制成安全、穩(wěn)定、高效的注射緩釋微球制劑，減少患者用藥次數(shù)，使藥物在體內(nèi)緩慢釋放，為非諾貝特新劑型的臨床研究和應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材 料

1.1 儀 器

Guardcolumn C18色譜柱，日本島津；Agilent1100高效液相色譜儀，美國(guó)安捷倫公司； ZSM-6360LV掃描電鏡，南京大學(xué)儀器廠；SALD-2201激光粒度分布儀，蘇州島津儀器有限公司；UV765紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海精科公司；HE3100紅外光譜測(cè)定儀器，德國(guó)SPECTRO；JY92-2D超聲波細(xì)胞破碎機(jī)，南京舜瑪儀器設(shè)備有限公司。

1.2 藥品與試劑

非諾貝特微球，佳木斯大學(xué)藥劑實(shí)驗(yàn)室自制；非諾貝特(純度99%)，武漢宏信康精細(xì)化工有限公司；PLGA(PLA/PGA=50∶50，分子量10000)，山東濟(jì)南岱罡生物科技公司；非諾貝特對(duì)照品(純度99.9%)，中國(guó)食品藥品檢定研究所；磷酸鹽緩沖溶液(PBS7.4)，REBIO瑞楚生物；透析袋(36 mm，分子量8000～14000)，美國(guó)Viskase Size5。

1.3 動(dòng) 物

SPF級(jí)雄性SD大鼠60只，哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。合格證編號(hào)scxk(黑)2013001。

2 方 法

2.1 非諾貝特微球的形態(tài)學(xué)考察

通過(guò)光學(xué)顯微鏡觀察載藥微球形態(tài)特征，通過(guò)掃描電子顯微鏡觀察微球形貌。

2.2 非諾貝特微球粒徑及粒度分布

精密稱取適量微球進(jìn)行溶解，超聲2 min使其分散均勻，激光粒度分布儀準(zhǔn)確測(cè)定粒徑及粒度分布情況。

2.3 非諾貝特微球的紫外光譜掃描

使用容量瓶精密配置非諾貝特標(biāo)準(zhǔn)品和空白輔料溶液濃度10 μg·mL-1。以甲醇溶液為空白對(duì)照進(jìn)行掃描，范圍200～400 nm。選擇合適的高效液相色譜檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.4 載藥微球體外釋放及穩(wěn)定性研究

采用C18柱(250 mm×4.5 mm，5 μm)；以85∶15的乙腈、磷酸溶液混合溶液作為流動(dòng)相；流速1.0 mL·min-1；紫外分光光度法測(cè)得檢測(cè)波長(zhǎng)286 nm[10-11]。

精密配置10 μg·mL-1的非諾貝特對(duì)照品溶液，以甲醇為溶劑配置梯度濃度5、10、20、30、40、60、90 μg·mL-1在286 nm處進(jìn)樣，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.4.1 透析法體外藥物釋放試驗(yàn)

試驗(yàn)采用透析袋原理。將微球注入5 mL生理鹽水的PBS 7.4介質(zhì)中；在每個(gè)設(shè)定的取樣時(shí)間取樣量。釋放樣品的濃度用HPLC測(cè)定，代入體外釋放標(biāo)曲計(jì)算非諾貝特的累積釋放量。

2.4.2 專屬性試驗(yàn)

在不受其他雜質(zhì)和輔料的干擾的條件下利用高效液相色譜檢測(cè)樣品特性。

2.4.3 精密度實(shí)驗(yàn)

分別配置五個(gè)梯度濃度的樣品溶液，計(jì)算日內(nèi)日間精密度。

2.4.4 穩(wěn)定性檢測(cè)

每日取樣五次，測(cè)定樣品濃度計(jì)算峰面積?；厥章剩喝「咧械腿齻€(gè)濃度樣品，每天測(cè)三次，連續(xù)測(cè)五天。

2.5 非諾貝特微球?qū)Ω哐Ｐ痛笫蠼抵饔醚芯?/h3>

2.5.1 動(dòng)物分組與造模

分為正常組、高血脂疾病模型組、陽(yáng)性對(duì)照組、非諾貝特微球高、中、低劑量組六組。造模期間正常組灌服等劑量的蒸餾水，其余5組灌服自制高脂乳劑。灌胃兩周后抽樣取血，測(cè)總膽固醇水平以證實(shí)高血脂疾病模型造模成功[12]。證實(shí)造模成功后大鼠開(kāi)始藥物治療，非諾貝特緩釋微球高中低劑量組分別給予18、9、4.5 mg·kg-1濃度藥物。陽(yáng)性對(duì)照組尾靜脈注射等劑量藻酸雙酯鈉，連續(xù)6 d，非諾貝特組三天注射一次，持續(xù)15 d。

2.5.2 檢查指標(biāo)

大鼠給藥結(jié)束禁食24 h，將各組大鼠麻醉固定于鼠板上，腹部刨開(kāi)進(jìn)行腹主動(dòng)脈血取，取肝臟、附睪脂肪和腎周脂肪，分別稱重記錄。計(jì)算體脂比和Lee’s指數(shù)。使用酶標(biāo)儀測(cè)定血清的TG、TC、HDL、LDL水平和肝臟TC，TG水平。

3 結(jié) 果

3.1 非諾貝特微球的表征結(jié)果

在光學(xué)顯微鏡下觀察，載藥微球整體形態(tài)規(guī)整，無(wú)粘連。掃描電子顯微鏡觀察結(jié)果如圖1(a)所示，微球分布均勻，外觀呈完整球形，表面光整。激光粒度分布儀測(cè)定結(jié)果如圖1(b)所示，粒徑大小呈正態(tài)分布，平均粒徑為(1.16±0.14)μm。

圖1 微球SEM表面形貌(a)；微球的粒度分布(b)

3.2 非諾貝特紫外吸收波長(zhǎng)測(cè)定

非諾貝特在286 nm處出現(xiàn)最大吸收峰，且與輔料的吸收峰的位置有明顯差異如圖2所示，因此在高效液相測(cè)定時(shí)選擇286 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

圖2 紫外吸收波長(zhǎng)

3.3 非諾貝特PLGA微球體外釋放及穩(wěn)定性研究

3.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以286 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線A=25.18C+26.75，r=0.9996，如圖3所示在5～90 μg·mL-1線性關(guān)系良好。

圖3 非諾貝特標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.3.2 體外釋放考察

如圖4所示，經(jīng)高分子材料修飾的載藥微球釋放時(shí)間得到顯著延長(zhǎng)，非諾貝特微球達(dá)到了緩釋的效果。

圖4 非諾貝特微球釋放曲線

3.3.3 專屬性試驗(yàn)

非諾貝對(duì)照品、原料藥、空白輔料和載藥微球的專屬性考察結(jié)果顯示輔料對(duì)原料藥出峰無(wú)影響。

3.3.4 精密度計(jì)算

平均日內(nèi)精密度為RSD=1.601%，平均日間精密度RSD=1.348%，均小于2%，精密度結(jié)果良好，可以測(cè)定樣品。

3.3.5 穩(wěn)定性

分別于0、1、2、4、8、12、16、24 h測(cè)定同一樣品濃度，計(jì)算峰面積分別為2018.56、2030.28、1985.42、2023.69、2039.6、2057.39、2069.45、2048.69 μg·mL-1。RSD為1.16%，小于2%，樣品溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.3.6 回收率

測(cè)30、60、90 μg·mL-1高中低三個(gè)濃度溶液的平均回收率分別為98.55%、97.64%、96.92%。其RSD值分別為1.94%、1.7%、1.79%均小于2%，該方法準(zhǔn)確度良好。

3.4 非諾貝特微球?qū)Ω哐Ｐ痛笫蠼抵饔醚芯?/h3>

3.4.1 各組大鼠腎周、睪周脂肪和體脂比的變化

結(jié)果如圖5所示，疾病模型組和各治療組動(dòng)物的腎周、睪周脂肪，體脂比較空白組具有明顯區(qū)別。高血脂造模各組脂肪量均有增加，且給藥大鼠未顯示副作用。

圖5 腎周脂肪、睪周脂肪和體脂比的變化

3.4.2 各組大鼠對(duì)血清指標(biāo)水平的影響

各組大鼠血清指標(biāo)變化如圖6所示，模型組和空白組相比各水平指數(shù)均有顯著提高，高血脂癥造模成功。各治療組與模型組相比各指標(biāo)均有下降，說(shuō)明藥物可以對(duì)高血脂癥產(chǎn)生一定程度的治療作用，其中非諾貝特載藥微球高劑量組的治療效果最為顯著。

圖6 各組動(dòng)物對(duì)血清TG、TC、LDL-C、HDL-C的影響

降低TNF-α可減少動(dòng)脈粥樣硬化和血栓。如圖7所示，與模型組相比各治療組均可降低TNF-α水平，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。各組大鼠對(duì)血清FIB的影響：降低FIB可促進(jìn)血液中纖維蛋白原的溶解與釋放，降低纖溶。如圖7所示，陽(yáng)性對(duì)照組和非諾貝特各劑量組均可降低血清FIB水平，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖7 各組動(dòng)物對(duì)血清TNF-α和各組動(dòng)物對(duì)血清FIB的影響

3.4.3 大鼠肝臟外觀形態(tài)觀察

各組大鼠肝臟形態(tài)如圖8所示。非諾貝特微球高中劑量組肝臟狀態(tài)較接近于正常組，表面呈紅褐色堅(jiān)挺且有光澤。模型組大鼠肝臟顏色暗淡，體積偏大質(zhì)地柔軟，肝緣頓且表面油膩。非諾貝特微球低劑量組與模型組十分相似，但低劑量組肝臟質(zhì)地更硬。

圖8 各組肝臟外觀形態(tài)

4 結(jié) 論

高血脂癥是常見(jiàn)的中老年疾病，并與血壓血糖的異常息息相關(guān)，嚴(yán)重者還易導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化，冠心病等。目前市場(chǎng)上的口服制劑生物利用度低，將非諾貝特制成緩釋微球制劑新藥物可以有效的提高其生物利用度，減少給藥次數(shù)。

實(shí)驗(yàn)室制備非諾貝特微球。通過(guò)掃描電鏡、紅外光譜分析、差示量熱儀對(duì)載藥微球進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)。成功制備交聯(lián)微球，表面光滑，形態(tài)均一完整，體外釋放效果良好。高效液相色譜在5～90 μg·mL-1范圍內(nèi)測(cè)定載藥微球的藥物含量，線性關(guān)系良好。對(duì)大鼠進(jìn)行體內(nèi)的藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)，治療組TG、TC、LDL-C、TNF-α、FIB水平下降，HDLC和肝指數(shù)升高。非諾貝特微球具有緩釋的降脂作用，為非諾貝特新劑型開(kāi)發(fā)提供了良好的理論依據(jù)。