木質(zhì)素還原制備納米硒及抑菌活性的研究

張 波，孫愛(ài)青，李培培，時(shí)偉杰

(1 山東省寧陽(yáng)縣第一中學(xué)，山東 寧陽(yáng) 271400；2 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，山東 泰安 271018)

硒是人體和動(dòng)物體內(nèi)必需的一種微量元素，與機(jī)體的免疫能力、抗氧化能力、抗癌抗病毒能力有著非常重要的聯(lián)系[1]。納米硒在養(yǎng)殖業(yè)中有著重要應(yīng)用，家畜被喂食含納米硒的飼料后，免疫力和抗應(yīng)激能力都顯著增強(qiáng)，同時(shí)提高了其生產(chǎn)性能。實(shí)踐證明納米硒比常用的氨基酸硒與亞硒酸鈉在提升肉食雞生長(zhǎng)性能方面有著絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。納米硒在醫(yī)療領(lǐng)域也有著重要作用，人體內(nèi)所含硒的總量大約為14～21 mg，大部分通過(guò)消化道和呼吸道吸收，主要通過(guò)尿液排出體外，正常尿硒的濃度范圍為0～0.15 mg/L，過(guò)量的硒具有毒性，作為藥物硒的用量范圍大約每天為50～200 μg。納米硒相對(duì)于硒化合物發(fā)生了理化性質(zhì)的變化，能夠直接并高效的消除自由基，因此納米硒具有低毒性的特點(diǎn)，在醫(yī)藥領(lǐng)域?qū)⒂兄鴱V闊的應(yīng)用前景，對(duì)人類的健康具有深遠(yuǎn)意義[2]。

木質(zhì)素是一種廣泛存在于植物體中的無(wú)定形的、含有氧代苯丙醇或其衍生物結(jié)構(gòu)單元的芳香性高聚物[3]。木質(zhì)素大分子結(jié)構(gòu)含有大量功能基團(tuán)，包括甲氧基、羰基、羥基等，所含有的官能團(tuán)決定了木質(zhì)素的理化性質(zhì)。羥基是木質(zhì)素生物大分子中的一種重要官能團(tuán)，按存在形式分為兩種類型，分別為苯環(huán)上的酚羥基和側(cè)鏈上的脂肪族羥基，因此木質(zhì)素具有很強(qiáng)的還原性[4]。

本文采用水熱合成法，以木質(zhì)素為還原劑、穩(wěn)定劑和保護(hù)劑，成功的制備了納米硒，并研究了其抑菌活性。該研究為納米硒的制備提供了一種廉價(jià)、方便的方法，有利于納米硒的實(shí)際應(yīng)用。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 實(shí)驗(yàn)原料與儀器

堿木素，山東泉林紙業(yè)有限責(zé)任公司提供；大腸桿菌和金黃色葡萄球菌，山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院提供；營(yíng)養(yǎng)肉湯(BR)，購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司；營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(BR)，購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司;二氧化硒(AR)，購(gòu)自天津市凱通化學(xué)試劑有限公司；實(shí)驗(yàn)所用的化學(xué)藥品均為分析純。

Nicolet 380傅立葉變換紅外分光度計(jì)，熱電公司；ESCALAB 250XI型X射線光電子能譜儀，Thermo Fisher Scientific公司；D8 Advance X 射線粉末衍射儀，Bruck公司；JEM-200CX透射電子顯微鏡，JEOL 公司。

1.2 木質(zhì)素的提純

準(zhǔn)確稱取粗堿木素50.0 g，溶于250.0 mL去離子水中，攪拌均勻，用高速離心機(jī)12000 r/min室溫離心5 min，去除沉淀后得堿木素液，加入濃鹽酸調(diào)pH至2～3，使堿木素以沉淀形式析出。再次用高速離心機(jī)12000 r/min室溫離心8 min，去除上清液，得沉淀形式的堿木素。用去離子水將所得沉淀重溶，12000 r/min離心8 min，使堿木素沉淀得以洗滌，如此再重復(fù)洗滌步驟兩次。將洗滌后的沉淀溶于100.0 mL去離子水中，用氫氧化鈉溶液調(diào)pH至10，干燥后制得純凈的木質(zhì)素，密封置于冰箱中備用。

1.3 納米硒的制備及表征

以二氧化硒、葡萄糖和精制木質(zhì)素為原料，分別配制2 mol/L亞硒酸溶液、100 g/L葡萄糖溶液和30 g/L木質(zhì)素溶液。在25 mL圓底燒瓶中加入5 mL配制的30 g/L pH為10的木質(zhì)素溶液，恒溫水浴(磁力攪拌)90 ℃情況下慢慢滴加5 mL 0.2 mol/L亞硒酸溶液，再慢慢滴加5 mL 100 g/L葡萄糖溶液，體系反應(yīng)2 h。反應(yīng)完成后，產(chǎn)物自然冷卻至室溫。取反應(yīng)后的溶液用離心機(jī)12000 r/min離心5 min，倒掉上清液，將所得沉淀洗滌置于真空干燥箱中干燥。所制備的材料通過(guò)TEM、XRD、XPS等方法進(jìn)行表征。

1.4 細(xì)菌的培養(yǎng)

在無(wú)菌的15 mL離心管中加入5 mL無(wú)菌營(yíng)養(yǎng)肉湯，取冷凍保存的菌種100 μL加入離心管。將離心管置于水浴恒溫振蕩器中，37 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)12 h，使細(xì)菌復(fù)蘇。

在無(wú)菌的15 mL離心管中加入5 mL無(wú)菌營(yíng)養(yǎng)肉湯，取已復(fù)蘇好的菌液50 μL加入離心管中，置于水浴恒溫振蕩器中，37 ℃恒溫震蕩培養(yǎng)4 h，將細(xì)菌培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。

采用平板計(jì)數(shù)法估算實(shí)驗(yàn)菌液的濃度，將上述所得的實(shí)驗(yàn)菌液用營(yíng)養(yǎng)肉湯分別稀釋1000倍、1萬(wàn)倍、5萬(wàn)倍、10萬(wàn)倍、50萬(wàn)倍、100萬(wàn)倍、150萬(wàn)倍、500萬(wàn)倍。稀釋后的實(shí)驗(yàn)菌液均為1 mL。分別取50 μL稀釋后的實(shí)驗(yàn)菌液涂板，每組涂板兩個(gè)。將涂板后的培養(yǎng)皿密封標(biāo)記后放入生化培養(yǎng)箱，15小時(shí)后取出觀察菌落生長(zhǎng)情況。實(shí)驗(yàn)表明，稀釋50萬(wàn)倍的實(shí)驗(yàn)菌液菌落生長(zhǎng)情況符合實(shí)驗(yàn)要求。

1.5 不同濃度的納米硒的抑菌性能

配制濃度分別為1 g/L、2 g/L、3 g/L、4 g/L、5 g/L的納米硒溶液，分別取190 μL于0.5 mL離心管中，加入10 μL稀釋50萬(wàn)倍的上述實(shí)驗(yàn)菌液，用漩渦混合器混合均勻，抑菌1 h后，分別取50 μL混合液涂板，每組平行涂板2個(gè)。將10 μL稀釋50萬(wàn)倍的菌液加入190 μL營(yíng)養(yǎng)肉湯混合均勻，分別取50 μL涂板作為對(duì)照試驗(yàn)。用平板計(jì)數(shù)法計(jì)算活體的細(xì)菌數(shù)目，對(duì)抑菌效果進(jìn)行測(cè)試。

1.6 不同抑菌時(shí)間納米硒的抑菌性能

取190 μL 5 g/L 納米硒溶液于0.5 mL離心管中，加入10 μL稀釋50萬(wàn)倍的實(shí)驗(yàn)菌液，用漩渦混合器混合均勻，抑菌一定時(shí)間后，分別取50 μL混合液涂板。每組平行涂板2個(gè)。按此方法分別將抑菌時(shí)間為30 min、35 min、40 min、45 min、50 min、55 min、60 min溶液涂板。將10 μL稀釋50萬(wàn)倍的菌液加入190 μL營(yíng)養(yǎng)肉湯混合均勻，分別取50 μL涂板作為對(duì)照試驗(yàn)。用平板計(jì)數(shù)法計(jì)算活體的細(xì)菌數(shù)目，對(duì)抑菌效果進(jìn)行測(cè)試。

2 結(jié)果與討論

2.1 納米硒的表征

圖1 納米硒的透射電鏡圖譜(a～c)和X射線衍射圖譜(d)

圖1為納米硒的高倍透射電鏡(TEM)圖和X射線衍射(XRD)圖譜。圖1(a)可顯示出納米硒粒子分布均勻，沒(méi)有聚集和粘連現(xiàn)象。圖1(b)中可以清晰的看出納米硒粒子形貌為非常規(guī)則的球形，粒徑在200 nm左右。圖1(c)通過(guò)進(jìn)一步放大倍數(shù)，可看到納米硒粒子表面包裹著一層木質(zhì)素，因此木質(zhì)素在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中不僅起到了還原作用還起到了保護(hù)和穩(wěn)定作用。圖1(d)為納米硒的XRD圖譜，圖譜中的主要衍射峰與標(biāo)準(zhǔn)卡片(JCPDS，No. 06-0362)衍射峰(100)、(101)晶面相吻合，并且圖中兩個(gè)峰的峰形尖銳。以上結(jié)果說(shuō)明實(shí)驗(yàn)已成功合成納米硒[5-6]。

圖2為納米硒的XPS光譜圖。從圖2(a)可以看出，所制備的材料主要含有Se、O和C三種元素。對(duì)C 1s進(jìn)行分峰處理，結(jié)果如圖2(b)所示，其中最強(qiáng)的峰位于284.8 eV，對(duì)應(yīng)C-H和C-C的結(jié)合能[7]。圖2(c)為對(duì)O 1s的分峰處理，531 eV、531.9 eV、532.6 eV和533.2 eV分別對(duì)應(yīng)O-C, OH, O-C-O和-C=O的結(jié)合能[8]。對(duì)Se 3d進(jìn)行分峰處理，結(jié)果如圖2(d)所示，位于55.1 eV的峰對(duì)應(yīng)的是Se，位于55.5 eV和56.2 eV的峰對(duì)應(yīng)的是氧化物[9]。以上結(jié)果表明，在納米硒的合成過(guò)程中，木質(zhì)素不僅起到了還原作用還起到了穩(wěn)定劑和保護(hù)劑的作用。

圖2 納米硒的XPS譜圖

2.2 納米硒抑菌活性的測(cè)試

圖3 不同抑菌時(shí)間的抑菌效果(a)；不同納米硒濃度的抑菌效果(b)

圖3為不同時(shí)間、不同濃度納米硒抑菌活性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖3(a)顯示，納米硒的抑菌效果隨抑菌時(shí)間的增加而提高，在60 min時(shí)，5 g/L的納米硒溶液對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果均達(dá)到了100%。納米硒溶液濃度對(duì)抑菌效果的影響如圖3(b)所示，納米硒的抑菌效果隨著納米硒濃度的增加而提高，在抑菌時(shí)間為60 min，納米硒濃度為5 g/L時(shí)，納米硒溶液對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果均達(dá)到了100%。以上結(jié)果表明，納米硒具有有效的抑菌活性，在農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥等領(lǐng)域應(yīng)用前景非常廣闊。

3 結(jié) 論

采用木質(zhì)素為還原劑和保護(hù)劑，利用水熱合成法制備了納米硒粒子，并研究了納米硒的抑菌活性。結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)所制備的納米硒粒子為非常規(guī)則的球形，粒徑為200 nm左右，并且納米粒子分布均勻。通過(guò)采用菌落計(jì)數(shù)法對(duì)納米硒的抑菌活性進(jìn)行了研究，研究結(jié)果證明納米硒具有良好的抑菌效果，抑菌效率隨納米硒濃度的升高和抑菌時(shí)間的增加而提高。在60 min時(shí)，5 g/L的納米硒溶液對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果均達(dá)到了100%。本文利用木質(zhì)素成功的還原制備了高度分散的納米硒粒子，表現(xiàn)出了良好的抑菌活性，在農(nóng)業(yè)、醫(yī)療等領(lǐng)域應(yīng)用前景廣闊。