神經(jīng)炎癥顯像劑18F-PBR06的自動化制備

喬洪文 李 則 陳樹安 梁志剛,2 盧 潔,3

1（首都醫(yī)科大學宣武醫(yī)院核醫(yī)學科 北京 100053）

2（首都醫(yī)科大學宣武醫(yī)院信息中心 北京 100053）

3（首都醫(yī)科大學宣武醫(yī)院放射科 北京 100053）

神經(jīng)炎癥（neuroinflammation）是中樞神經(jīng)系統(tǒng)應對損傷的炎癥樣膠質(zhì)細胞應答，在自身免疫病、神經(jīng)退行性疾病、腦卒中等多種疾病中均有發(fā)生。神經(jīng)炎癥一方面有利于腦組織和退行神經(jīng)的修復而具有保護作用，另一方面也可能導致附帶腦組織損傷、神經(jīng)元缺失和失能而具有神經(jīng)毒性［1-2］。正電子發(fā)射斷層成像（PositronEmissioncomputed Tomography，PET）能夠在體檢測腦中神經(jīng)炎癥情況，最常用的顯像劑為18 kDa轉位蛋白（18 kDa Translocator Protein，TSPO）靶向分子探針。TSPO主要位于線粒體內(nèi)外膜的接觸點上，病理研究證明TSPO表達數(shù)量同小膠質(zhì)細胞的狀態(tài)相關。在健康腦組織中，處于休眠狀態(tài)的小膠質(zhì)細胞中TSPO表達較少；當小膠質(zhì)細胞被激活時，TSPO的表達顯著升高。小膠質(zhì)細胞激活是神經(jīng)炎癥的主要表現(xiàn)之一，因此TSPO可以作為神經(jīng)炎癥PET顯像的生物標志物［3］。

11C-PK11195是使用較多的第一代TSPO PET顯像示蹤劑，但是其存在以下缺點：第一、進腦量相對較低，非特異性攝取和血漿蛋白結合較高，導致PET圖像信噪比和特異性較低，難以發(fā)現(xiàn)腦中神經(jīng)炎癥的微小改變；第二、標記放射性核素11C半衰期短（20 min），只能在有加速器的單位使用［4］。在過去的十幾年中，第二代TSPO顯像劑被開發(fā)并用于動物模型和人體的神經(jīng)炎癥顯像研究。第二代顯像劑根據(jù)結構的不同可以分為兩類：第一類是N-苯甲基-N-（2-苯氧基芳基）-乙酰胺衍生物，包括11CDAA1106、11C-PBR28、18F-PBR06、18F-FEPPA等化合物；第二類是2-苯基吡唑-［1，5］嘧啶乙酰胺衍生物，包括11C-DPA-713、18F-DPA-714、18F-PBR111等化合物。評價研究表明第二代TSPO靶向分子探針的親和性更高：相對于PK11195，11C-PBR28的靶向親和性高5～6倍、18F-PBR06高11倍、11C-DPA-713高2倍、18F-DPA-714高1.5倍，高親和性有利于改善PET圖像信噪比［4-8］。第二代顯像劑的藥物動力學性質(zhì)也有所提升，11C-PBR28人腦顯像研究表明，小腦可作為該顯像劑定量計算的參比區(qū)域。另一對比研究表明，11C-PBR28和18F-PBR06具有類似的體內(nèi)動力學性質(zhì)［9］。

為了推動神經(jīng)炎癥PET顯像臨床研究，本研究開展了二代TSPO分子探針18F-PBR06自動化制備工藝研究：開發(fā)Neptis Perform型合成儀適用的一次性管路系統(tǒng)及配套流程，實現(xiàn)穩(wěn)定、高效生產(chǎn)18FPBR06制劑；參考中國藥典2015年版，制定了18FPBR06注射液的質(zhì)量標準及檢驗方法；通過異常毒性檢查考察了制劑的安全性；通過正常小鼠實驗考察了制劑的體內(nèi)生物分布情況。在以上工作的基礎上，本研究開展了PET/CT顯像預試驗。以上研究為18F-PBR06在科研和臨床中的進一步應用奠定了基礎。

1 材料

1.1 試劑

前體和標準品按照文獻合成［10］，色譜純度大于99%。氨基聚醚222 mL、250 mL軟包注射用水、一次性管路組裝耗和注射器材購于德國ABX公司。固相萃取柱購于美國Waters公司。無菌濾膜購于美國默克密理博（Merck Millipore）公司。細菌內(nèi)毒素檢測卡（靈敏度5～0.05 EU?mL-1）購于湛江安度斯生物有限公司，其余試劑均購于美國Simga-Aldrich試劑公司。

1.2 儀器

加速器為德國西門子公司RDS-111型。放射性藥物合成儀為比利時ORA公司Neptis Perform型，配備美國安捷倫公司C18色譜柱（250 mm×9.6 mm，5 μm）。分析型高效液相色譜（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）為安捷倫公司1260型，配備美國菲羅門C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）和Bioscan公司在線放射性檢測器。氣相色譜為安捷倫公司7890型，配備Restek氣相色譜柱（0.53 mm內(nèi)徑，1 μm聚乙烯醇涂層）和氫火焰檢測器。pH為美國Fisher公司Onion型，配備微型探頭。內(nèi)毒素檢測儀為美國查爾斯河實驗室公司PTSEndotoxin型。活度計為美國CAPINTEC INC公司CRC-25R型。

1.3 實驗動物

昆明小鼠購于北京市海淀區(qū)興隆實驗動物養(yǎng)殖場，共20只，雄性，體重19.0～22.3 g。動物實驗已通過首都醫(yī)科大學倫理委員會批準。

2 方法

2.1 18F-PBR06自動化合成

用于18F-PBR06制備的一次性管路結構如圖1所示，制備所需溶液通過注射器加載到一次性管路上：在淋洗液位置加載0.6 mL氨基聚醚222（K222）/K2CO3溶液（10 mg K222和 2 mg K2CO3溶解于0.3 mL乙腈和0.3 mL水）；第一個五聯(lián)閥3位置加載2.5 mL無水乙腈；第一個五聯(lián)閥5位置加載含有2 mg標記前體化合物的1.5 mL無水DMSO溶液；第二個五聯(lián)閥3位置加載6 mL注射用水；第二個五聯(lián)閥5位置加載10 mL注射用水。在制劑化五聯(lián)閥的2位置加載250 mL注射用水；4位置加載含有1.5 mL無水乙醇；在5位置加載3.5 mL含有0.5%抗壞血酸鈉的生理鹽水溶液；Oasis固相萃取柱后三通閥常閉端通過注射針頭加載含有10 mL 0.5%抗壞血酸鈉-生理鹽水溶液的制劑化瓶。制劑化瓶上加載長穿刺針頭，然后通過一次性管路連接0.22 μm無菌濾膜，通入到最終產(chǎn)品瓶中。在半制備HPLC系統(tǒng)處加載流動相（乙腈/20 nmol?L-1pH 6.7磷酸鹽緩沖溶液=70/30），設置流速3 mL?min-1，UV檢測器設置檢測波長230 nm。

圖1 適用于Neptis Perform型合成儀器的18F-PBR06制備一次性管路結構和加載的試劑Fig.1 Schematic of the disposable cassette for18F-PBR06 preparation with Neptis Perform synthesizers and reagents

18F-PBR06制備程序通過預設時間控制儀器運行：含18F離子的加速器靶水在負壓作用下通過離子交換QMA柱（說明：QMA柱為生產(chǎn)商Waters公司的商品名）柱，然后用K222/K2CO3溶液將放射性活度從QMA柱上淋洗并加入到反應瓶中，加熱至95℃并蒸發(fā)干燥；抽取約0.6 mL無水乙腈并加入到反應瓶中，再次蒸發(fā)干燥；反應瓶減壓，將前體溶液加入到反應瓶中，加熱至140℃反應15 min，放射化學反應式如圖2所示；反應溶液冷卻至60℃，然后加入第二個五聯(lián)閥5位置上的10 mL水進行稀釋；所得溶液通過30 mg Oasis HLB固相萃取小柱；用第一個五聯(lián)閥3位置上剩余的乙腈將粗產(chǎn)品洗脫，并加入到第三個五聯(lián)閥4位置的30 mL注射器中，用6 mL水沖洗Oasis小柱，并稀釋粗產(chǎn)品溶液；將粗產(chǎn)品溶液進樣到HPLC系統(tǒng)中進行純化，監(jiān)測放射性和紫外吸收色譜圖，根據(jù)放射性信號收集含有目標產(chǎn)物的流動相（目標產(chǎn)物峰保留時間約為14 min）。收集的流動相加入到制劑化五聯(lián)閥3位置的儲液罐中；從2位置抽取30 mL注射用水稀釋上述流動相，所得溶液通過1 mL Oasis HLB固相萃取柱；再次從2位置抽取30 mL注射用水，沖洗1 mL Oasis HLB柱；用1.5 mL乙醇將目標化合物從1 mL Oasis HLB柱上洗脫并加入到產(chǎn)品制劑化瓶中；用5位置上的3.5 mL生理鹽水溶液沖洗1 mL Oasis柱，并加入到制劑化瓶中；在儀器氮氣壓力推動下，制劑化瓶中溶液通過無菌濾膜進入最終產(chǎn)品瓶，制得18F-PBR06注射液。

圖2 制備18F-PBR06的化學反應式Fig.2 Chemical reaction formula of18F-PBR06 preparation

2.2 18F-PBR06注射液質(zhì)量控制分析

18F-PBR06注射液的質(zhì)量控制標準參考中國藥典2015年版相關規(guī)定及已收錄品種制定［11］，檢驗內(nèi)容表1。合成結束后，首先用注射用水沖洗生產(chǎn)中使用的0.22 μm無菌濾膜，然后通過起泡點檢測考察濾膜完整性，然后從產(chǎn)品瓶中抽取2 mL制劑溶液用于質(zhì)量控制分析：將1 mL質(zhì)控樣品加入到無菌瓶中，待衰變后進行無菌檢測。將剩余1 mL樣品加入到無菌試管中，用于其他項目質(zhì)控分析：首先在明亮的燈光下于鉛玻璃后目視進行外觀檢查；移取20 μL樣品用細菌內(nèi)毒素檢測用水稀釋50倍，用于進行內(nèi)毒檢測；移取500 μL樣品，通過活度計測定放射性濃度和半衰期；移取100 μL樣品，用色譜級水稀釋50倍，進行氣相色譜分析檢測殘留溶劑（色譜條件為：柱溫200℃，進樣口溫度跟隨柱溫，檢測器溫度240 ℃，氫氣流速 30 mL?min-1，進樣量 1 μL）；取100 μL樣品，通過pH計測定pH值；取20 μL樣品進行HPLC分析（流動相為：含氟化鉀1 g?L-1的乙腈/pH 6.7磷酸鹽緩沖溶液=70/30，流速1 mL?min-1，檢測波長230 nm），進行放射化學鑒別、放射化學純度、化學雜質(zhì)和18F-PBR06含量測定；取2 μL樣品，通過比色法進行K222限量檢查。

2.3 18F-PBR06注射液異常毒性檢查

取雄性昆明小鼠5只（體重19.0～20.6 g），通過尾靜脈注射在5 s內(nèi)勻速注射0.5 mL采用上述工藝制備的18F-PBR06注射液，注射液的放射性活度為22.94～19.62 MBq。注射完成后將小鼠置于安靜環(huán)境，保證充足食物和飲水供應，并按照12 h節(jié)律提供照明。每隔12 h觀察小鼠生存狀態(tài)，共觀察48 h。

2.4 18F-PBR06在正常小鼠體內(nèi)分布研究

取雄性昆明小鼠15只（體重19.7～22.3 g），隨機分為3組，每組5只。通過尾靜脈向小鼠體內(nèi)注射放射性活度為0.74 MBq的18F-PBR06注射液。注射后將小鼠置于安靜環(huán)境并保證食水供應，然后在不同時間點（5 min、30 min、60 min）斷頸處死，解剖提取血液、心臟、肺、脾、肝、腎、肌肉、股骨、腦，用天平稱重，并用γ計數(shù)器測量放射性計數(shù)。通過與注射劑量的1%對照樣品比較，計算單位質(zhì)量組織中的放射性攝取量（%ID/g）。

2.5 18F-PBR06 PET/CT顯像預試驗

本研究經(jīng)首都醫(yī)科大學宣武醫(yī)院倫理委員會審查，獲得批準后實施，納入臨床診斷為正常的志愿者一名（女性，39歲），多發(fā)性硬化患者一名（女性，35歲），受試者簽署知情同意書后進行試驗。入組的多發(fā)性硬化患者病史7年余，依據(jù)2017年版McDonald診斷標準確診為繼發(fā)進展型多發(fā)性硬化。受試者經(jīng)肘靜脈彈丸式注射18F-PBR06制劑370 MBq，然后于低刺激環(huán)境中休息；60 min后以動態(tài)模式采集頭部PET數(shù)據(jù)30 min。PET數(shù)據(jù)采用OSEM方法重建（子集4，迭代24，矩陣256×256）。在PET圖像上勾畫皮層、白質(zhì)、丘腦、中腦、小腦等感興趣區(qū)，并以小腦為參考區(qū)計算標準攝取比（Standardized Uptake Value ratio，SUVr）。

3 結果與討論

3.1 18F-PBR06自動化合成

神經(jīng)炎癥PET顯像在過去的10年中發(fā)展迅速，并在多發(fā)性硬化和阿爾茲海默病等疾病研究中已有較多應用，在帕金森病和腦卒中的研究中也取得了一些成果［12］。性質(zhì)優(yōu)良的顯像劑是開展PET研究的必要條件。本研究選擇具有較好生物性質(zhì)的神經(jīng)炎癥顯像劑18F-PBR06，利用Neptis Perform型合成儀開展了該顯像劑的制備研究。使用本研究開發(fā)的一次性管路系統(tǒng)和流程，18F-PBR06注射液制備總耗時為50～58 min（n=20），其中18F離子純化和干燥耗時約9 min，氟化反應耗時約16 min，HPLC純化耗時約15 min，制劑化過程約10 min，18F-PBR06放射化學產(chǎn)率為（32±5）%（經(jīng)衰減校正，n=20）。2009年Briard等［13］首次報道了18F-PBR06的制備，使用以溴基為離去基團的前體化合物和TRACERlab FXF-N型合成裝置，制備18F-PBR06的放射化學產(chǎn)率為12.2%（n=6）。在同年的報導中該方法被用于18F-PBR06人體顯像研究。在2014和2015年報道的評價研究中，使用以溴基為離去基團的前體化合物制備18FPBR06的產(chǎn)率較低，僅為（2.1±0.7）%（n=10）和（2.17±0.38）%（經(jīng)衰減校正）［14-15］。2011年Wang等設計合成了以對甲苯磺酰基為離去基團的前體化合物，使該組研制的合成儀器，18F-PBR06制備產(chǎn)率提高至30%～60%（經(jīng)衰減校正），而且改善了產(chǎn)品制劑的化學純度。本研究使用一次性管路系統(tǒng)制備18FPBR06的產(chǎn)率同已報道結果具有可比性［9，16］。

本研究優(yōu)化18F-PBR06半制備色譜純化條件：采用乙腈/20 nmol?L-1pH 6.7磷酸鹽緩沖溶液=70/30流動相，目標化合物保留時間約為14 min，與非放射性雜質(zhì)有較好分離度。當采用乙腈/磷酸鹽緩沖溶液=75/25流動相時，目標化合物保留時間為11 min，由于雜質(zhì)UV色譜峰拖尾，導致目標化合物放射性色譜峰同雜質(zhì)峰有部分重疊。降低流動相中乙腈含量可使目標化合物保留時間進一步延長，且獲得較好分離度，但是會導致總合成時間延長，因此本研究采用乙腈/20 nmol?L-1pH6.7磷酸鹽緩沖溶液=70/30作為產(chǎn)品純化流動相。本研究采用的反應時間為15 min，未作進一步優(yōu)化，計劃在后續(xù)工作中予以改進，從而減少制備時間。

3.2 18F-PBR06注射液質(zhì)量控制分析

18F-PBR06注射液的生產(chǎn)工藝通過連續(xù)生產(chǎn)的三個批次進行驗證，制劑質(zhì)量控制分析結果均合格，具體結果如表1所示。穩(wěn)定性研究表明：將三個驗證批次產(chǎn)品溶液置于室溫下6 h，然后進行第二次質(zhì)量檢測，產(chǎn)品的放射化學純度、化學雜質(zhì)和19FPBR06含量均未發(fā)生明顯變化，這表明18F-PBR06注射液在室溫下6 h內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性。工藝驗證完成后，本研究進行了17次18F-PBR06注射液的生產(chǎn)，質(zhì)量控制分析結果均為合格，因此使用一次性管路系統(tǒng)及其流程生產(chǎn)的18F-PBR06制劑能夠滿足臨床顯像研究和應用的要求。

3.3 18F-PBR06注射液異常毒性檢查

根據(jù)中國藥典2015年版通則1141“異常毒性檢測法”，對采用本工藝生產(chǎn)的18F-PBR06注射液進行了異常毒性檢查，結果表明：給藥48 h后5只小鼠均存活，且狀態(tài)未見異常；解剖分析可見，受試小鼠臟器未發(fā)生明顯改變。以上結果證明本研究工藝在制備18F-PBR06注射液過程中未引入外源性毒性物質(zhì)及不安全因素。

圖3 18F-PBR06產(chǎn)品制劑質(zhì)量控制分析HPLC色譜圖(a)產(chǎn)品制劑放射性色譜圖，18F-PBR06保留時間為10.394 min，(b)產(chǎn)品制劑UV色譜圖，(c)對照化合物PBR06的分析HPLC色譜圖，PBR06保留時間為10.221 minFig.3 18F-PBR06 product HPLC chromatograms for quality control analysis(a)Radioactive chromatogram of product,retention time of 18F-PBR06 is 10.394 min,(b)UV chromatogram of product,(c)UV chromatogram of reference compound,the retention time of PBR06 is 10.221 min

3.4 18F-PBR06在正常小鼠體內(nèi)的生物分布研究

18F-PBR06在小鼠各器官中的分布見表2。肺中初始攝取最高，然后以較快速度洗脫，這可能是由于肺中TSPO表達較高，在初始階段合并血液中的放射性活度，因此表觀攝取最高，隨后放射性攝取隨血液洗脫。腎、心臟、脾等器官放射性攝取較高，這與以上器官中TSPO高表達的生物學特性一致。18FPBR06在血液中清除速度快，在肌肉和骨中有一定攝取。腦中攝取的放射性較低，而且以較快速度洗脫，這可能與正常小鼠腦中膠質(zhì)細胞處于休眠狀態(tài)和TSPO表達較少有關。18F-PBR06在正常小鼠體內(nèi)的分布與文獻報道的在猴和正常人體內(nèi)的分布趨勢一致［8］。

3.5 18F-PBR06 PET/CT顯像預試驗

健康受試者頭部PET/CT顯像圖像如圖4（a）所示，皮質(zhì)區(qū)域可見輕度放射性攝取，額葉、頂葉、顳葉、枕葉相對小腦的SUVr分別為1.06、0.95、1.02、1.01；楔葉區(qū)域攝取略高，SUVr為1.06；丘腦和腦橋區(qū)域攝取最高，SUVr分別為1.16和1.17；腦白質(zhì)區(qū)域放射性攝取最低，SUVr為0.65，以上放射性攝取同TSPO在正常人腦中的自然分布情況相符［3，8］。此外，受試者顱骨區(qū)域有高放射性濃集，說明18FPBR06在人體內(nèi)可能發(fā)生了脫氟代謝。多發(fā)性硬化患者頭部PET/CT顯像圖像如圖4（b）所示，可見患者丘腦、橋腦和白質(zhì)區(qū)域放射性攝取升高（見B圖中箭頭標注），丘腦區(qū)域的放射性攝取較正常人明顯增加，SUVr為1.50，且兩側攝取不對稱，這與右側軀體癥狀較重對應；腦橋和白質(zhì)攝取也有明顯升高，SUVr分別為1.39和0.79；額葉、頂葉、顳葉、枕葉以及楔葉皮質(zhì)中的放射性攝取略有上升，SUVr分別為1.12、1.01、1.10、0.99和1.16。

表1 18F-PBR06注射液的質(zhì)量控制標準及檢驗方法Table 1 [18F]PBR06 injection quality control standards and methods

表2 18F-PBR06在正常小鼠體內(nèi)的生物分布（n=5，%ID/g）Table 2 The biodistribution of18F-PBR06 in normal mice(n=5,%ID/g)

健康受試者腦中放射性活度分布與文獻報道的在國外進行的PET顯像一致［17-18］。多發(fā)性硬化患者腦中放射性攝取升高區(qū)域，同核磁共振成像檢查提示的丘腦、橋腦、側腦室旁區(qū)域存在病灶的發(fā)現(xiàn)一致。需要注意的是18F-PBR06在腦中攝取絕對值比較低，而且不同患者病灶區(qū)分布不同，因此PET圖像視覺分析和手動勾畫感興趣區(qū)的難度較大，需要進一步建立基于全腦的圖像自動化分析方法，提高圖像評判的準確性。

圖4 18F-PBR06在健康對照(a)和多發(fā)性硬化患者(b)腦中的PET/CT顯像結果Fig.4 The PET/CT imaging of18F-PBR06 in health control(a)and multiple sclerosis patient(b)

4 結語

本研究開發(fā)了適用于Neptis Perform型合成儀的一次性管路系統(tǒng)及相應控制流程，實現(xiàn)了TSPO顯像劑18F-PBR06自動化制備；根據(jù)中國藥典2015年版中的相關規(guī)定及收錄的正電子核素標記放射性藥物，制定了18F-PBR06產(chǎn)品制劑的質(zhì)量標準及檢驗方法。20次制備產(chǎn)品制劑的檢驗結果表明，采用一次性管路系統(tǒng)制備的18F-PBR06滿足質(zhì)量標準要求。異常毒性檢查結果表明，在使用本工藝制備18FPBR06注射液的過程中未引入不安全因素。綜合動物分布研究和PET/CT顯像預試驗結果可知，采用本研究制備的18F-PBR06注射液可用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)炎癥PET顯像研究。