螺旋篩板氣升式反應(yīng)器在真菌發(fā)酵中的應(yīng)用

李想，陳瑜琦，王子凡，鄭志永,2*，陳海琴，高敏杰*，詹曉北

1(糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(江南大學(xué))，江蘇 無錫，214122) 2(江南大學(xué) 環(huán)境與土木工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122)3(江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫，214122)

螺旋篩板氣升式反應(yīng)器(airlift reactor with helical sieve plate,ALR-HSP)是本研究室在經(jīng)典氣升式反應(yīng)器(conventional airlift reactor,CALR)的基礎(chǔ)上研發(fā)出來的，靠導(dǎo)流筒裝置的引導(dǎo)使多相進(jìn)行循環(huán)混合的反應(yīng)器，它與CALR的主要區(qū)別在于其導(dǎo)流筒上升段安裝有螺旋上升的多孔篩板[1-2]。在空氣-水試驗(yàn)中，ALR-HSP展現(xiàn)出比CALR更好的傳質(zhì)性能和節(jié)能的特性，裝有螺旋篩板的這種結(jié)構(gòu)能夠有效阻止氣泡聚并，增大氣液比表面積從而提高傳質(zhì)效率，在相同通風(fēng)量條件下氣含率和體積傳質(zhì)系數(shù)分別增加38%～53%和76%～144%[3]。

氣升式反應(yīng)器雖然具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、剪切力小和能耗低的特性，但由于其能調(diào)控的參數(shù)較少，操作魯棒性差，傳質(zhì)效率較低，因此工業(yè)上只有少量菌株能夠用氣升式反應(yīng)器來培養(yǎng)。導(dǎo)流筒上安裝螺旋篩板后，反應(yīng)器的傳質(zhì)性能得到提高，操作魯棒性明顯改善，這增加了工業(yè)菌株用氣升式反應(yīng)器來培養(yǎng)的適用性。真菌具有生長(zhǎng)速度較慢、耗氧量較少和對(duì)剪切力比較敏感的特性，是潛在的可以使用氣升式反應(yīng)器來進(jìn)行培養(yǎng)的菌株。

高山被孢霉(Mortierellaalpine)是1株生產(chǎn)多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids,PUFAs)的絲狀真菌[4-5]。其對(duì)剪切力敏感[6]，但由于CALR不能滿足其耗氧需求，因此高山被孢霉的培養(yǎng)依舊選擇機(jī)械攪拌式反應(yīng)器。在采用機(jī)械攪拌式反應(yīng)器培養(yǎng)時(shí)轉(zhuǎn)速不宜過高，這在一定程度上減弱了機(jī)械攪拌罐在操作魯棒性上較強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)，使用ALR-HSP有望解決這個(gè)問題。另外畢赤酵母是一種應(yīng)用廣泛的外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)，也是一種在工業(yè)發(fā)酵中常用的菌株，能生產(chǎn)出大量的重組蛋白質(zhì)[7-8]。同樣因CALR的供氧能力有限，不能滿足菌株的耗氧需求，因而使用機(jī)械攪拌罐[9-10]。本文采用傳統(tǒng)氣升式反應(yīng)器和帶有螺旋篩板氣升式反應(yīng)器，對(duì)高山被孢霉和畢赤酵母進(jìn)行培養(yǎng)，分別考察這2株菌的發(fā)酵過程參數(shù)，分析螺旋篩板在耗氧微生物發(fā)酵中產(chǎn)生的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)裝置

發(fā)酵用ALR-HSP是以比歐SSTC型65 L氣升式反應(yīng)器(瑞士比歐生物工程公司)作為改造對(duì)象，在反應(yīng)器內(nèi)安裝自行設(shè)計(jì)的導(dǎo)流筒、開孔率61%的螺旋篩板與圓錐面形的氣體分布器，具體樣式如圖1所示。本實(shí)驗(yàn)的反應(yīng)器有2個(gè)，一個(gè)是導(dǎo)流筒上有螺旋篩板的反應(yīng)器ALR-HSP，作為實(shí)驗(yàn)組；另一個(gè)是導(dǎo)流筒上沒有螺旋篩板的反應(yīng)器CALR，作為對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)裝置主要結(jié)構(gòu)參數(shù)如表1所示。

1-出氣口;2-氣液分離區(qū);3-導(dǎo)流筒;4-螺旋篩板;5-夾套;6-溶氧電極;7-圓錐形氣體分布器;8-進(jìn)氣口圖1 螺旋篩板氣升式反應(yīng)器Fig.1 Experimental device of helical sieve airlift

表1 實(shí)驗(yàn)氣升式反應(yīng)器的結(jié)構(gòu)參數(shù)Table 1 Structure parameters of airlift experiment reactor

1.1.2 菌株與試劑

高山被孢霉(MortierellaalpineATUS2222)由江南大學(xué)食品學(xué)院贈(zèng)送。畢赤酵母(PichiapastorisKM71)購于Invitrogen公司。

酵母粉，北京索萊寶科技有限公司；甘油、K2SO4、KH2PO4、MgSO4、KOH、磷酸等，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

1.1.3.1 高山被孢霉培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖 20，酵母提取物 5，KH2PO41，MgSO4·7H2O 0.51，KNO310。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖 30，酵母提取物 1.5，酒石酸銨 2.0，KH2PO47，MgSO4·7H2O 1.5，Na2HPO410，無水CaCl20.1，F(xiàn)eCl3·6H2O 8 mg/L，ZnSO4·7H2O 1 mg/L，CuSO4·5H2O、Co(NO3)2·6H2O、MnSO4·5H2O 0.1 mg/L。

1.1.3.2 畢赤酵母培養(yǎng)基

酵母浸出粉胨葡萄糖(YPD)種子培養(yǎng)基(g/L)：酵母粉 10.0，葡萄糖 20.0，蛋白胨 20.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：甘油 26.0，K2SO41.0，MgSO41.0，CaSO40.1，KOH 20.0，(NH4)2SO45.0，PTM1 10 mL，H3PO420 mL/L，pH 6.0。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)方法

1.2.1.1 高山被孢霉

種子液制備：從斜面上挑取活化后的菌種接種至裝有100 mL種子培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，200 r/min、28 ℃培養(yǎng)48 h后，按體積分?jǐn)?shù)1%的接種量接種，使用分散器打散的菌絲體片段，并傳代2次，每次均在200 r/min、28 ℃條件下培養(yǎng)36 h，即得到種子液。

發(fā)酵罐培養(yǎng)：將36 L的初始發(fā)酵培養(yǎng)基置于65 L的氣升式反應(yīng)器內(nèi)，滅菌，接種前調(diào)節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基維持在28 ℃、pH 6.0。加入4 L的種子液，在恒定通氣量10 L/min條件下進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.1.2 畢赤酵母

種子液制備：將保存在甘油管中的菌體接種到斜面培養(yǎng)基上，放入30 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 d。將單個(gè)菌落接入裝有50 mL培養(yǎng)基的500 mL三角瓶，溫度30 ℃，轉(zhuǎn)速220 r/min，培養(yǎng)18 h，直至OD600達(dá)到2.0。

發(fā)酵罐培養(yǎng)：將28.5 L的初始發(fā)酵培養(yǎng)基置于65 L的氣升式反應(yīng)器內(nèi)，滅菌，接種前調(diào)節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基維持在30 ℃、pH 6.0。加入1.5 L的種子液，在恒定通氣量40 L/min條件下進(jìn)行培養(yǎng)，待甘油耗盡后停止培養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)胞濃度測(cè)定

將用去離子水洗滌過的高山被孢霉進(jìn)行冷凍干燥，采用干重法測(cè)定菌體濃度[11]，采用濁度法測(cè)定畢赤酵母菌體濃度[12]。

1.2.3 碳源質(zhì)量濃度測(cè)定

1.2.3.1 葡萄糖質(zhì)量濃度測(cè)定

采用SBA-40E型生物傳感儀(山東省科學(xué)院生物研究所)測(cè)定[13]。

1.2.3.2 甘油質(zhì)量濃度測(cè)定

發(fā)酵液中殘余甘油濃度通過HPLC法測(cè)定[12]。

1.2.4 NH4-N含量測(cè)定

采用水楊酸鈉-次氯酸鈉比色法[14]。

1.2.5 發(fā)酵過程中OUR及kLa測(cè)定

通過LKM2000A型尾氣分析儀(韓國(guó) LOKAS)記錄發(fā)酵尾氣中O2的分壓，按照公式(1)和(2)分別計(jì)算O2消耗速率(oxygen uptake rate,OUR)，體積傳質(zhì)系數(shù)(kLa)，計(jì)算公式如下：

(1)

(2)

式中：OUR,O2消耗速率，mmol/(L·h)；Qg,通氣流量，m3/s；φO2,氧氣的體積分?jǐn)?shù)，%；V,裝液體積，m3；ρ*,飽和氧質(zhì)量濃度，mg/L；ρL,實(shí)際溶氧質(zhì)量濃度，mg/L。

1.2.6 脂質(zhì)含量測(cè)定

樣品制備方法如下：將冷凍干燥的菌絲體碾碎，精密稱取約50 mg置于樣品瓶中，提取脂肪酸及甲酯化具體操作見文獻(xiàn)[15]。

采用QP2010型氣相色譜-質(zhì)譜(日本 Shimadzu公司)分析脂肪酸。色譜柱為DB-WAXetr(30 m×0.32 mm，0.25 μm)。柱箱溫度在150 ℃下保持3 min，然后以10 ℃/min升至190 ℃，隨后以5 ℃/min升至220 ℃持續(xù)16 min。質(zhì)譜在m/z50～550的掃描范圍內(nèi)運(yùn)行，離子源溫度為220 ℃，電子轟擊源能量為70 eV，進(jìn)樣量為1 μL。按照上述分析方法得到不飽和脂肪酸甲酯的總離子流圖，如圖2所示。并通過與商業(yè)脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)(GLC.463，Nu-Chek，Elysian，MN，美國(guó))進(jìn)行比較,鑒定脂肪酸甲酯，鑒定結(jié)果如表2所示。

圖2 高山被孢霉產(chǎn)油脂的總離子流圖Fig.2 Total ion chromatograms of lipids produced byM. alpine

表2 高山被孢霉合成的油脂組分分析Table 2 Components of lipids produced by M. alpine

2 結(jié)果與討論

2.1 發(fā)酵過程曲線

高山被孢霉和畢赤酵母的發(fā)酵過程曲線如圖3所示。高山被孢霉的生長(zhǎng)可以分為延滯期、對(duì)數(shù)期(8～40 h)、穩(wěn)定期3個(gè)階段(圖3-a，b)。反應(yīng)器在對(duì)數(shù)期，菌體量增多代謝加快，導(dǎo)致2個(gè)反應(yīng)器的溶解氧(dissolved oxygen,DO)濃度均迅速下降，培養(yǎng)基中的底物濃度迅速降低。在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期，2反應(yīng)器的DO值差別顯著，ALR-HSP和CALR的DO值分別在35%和10%左右后趨于穩(wěn)定。在培養(yǎng)40 h后，培養(yǎng)基中氮源的耗盡限制了菌體生長(zhǎng)，菌體濃度趨于穩(wěn)定，菌體生長(zhǎng)進(jìn)入穩(wěn)定期。培養(yǎng)結(jié)束后，ALR-HSP中的菌體濃度比CALR增加約10%。菌體濃度增加可能是在ALR-HSP中氧氣供應(yīng)更為充足，更適合高山被孢霉的生長(zhǎng)[16]。

畢赤酵母生長(zhǎng)過程可分為延滯期、對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期3個(gè)階段(圖3-c，d)。菌體進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(12～32 h)后，代謝加快，耗氧量增加，2個(gè)反應(yīng)器的DO值均開始下降，并出現(xiàn)明顯差異。菌體在此階段耗氧量大，而氣升式反應(yīng)器的供氧能力有限，致使2反應(yīng)器的溶氧先后降為0。直到36 h后，ALR-HSP和CALR的DO值開始上升，此時(shí)甘油質(zhì)量濃度過低限制了菌體的生長(zhǎng)，菌體進(jìn)入穩(wěn)定期(36～48 h)。最終ALR-HSP中菌體的濃度比CALR增長(zhǎng)約20%。其原因可能是CALR中菌體在溶氧限制條件下產(chǎn)生了大量副產(chǎn)物導(dǎo)致細(xì)胞對(duì)底物的得率系數(shù)較低[7,17-18]。

a-高山被孢霉溶解氧體積分?jǐn)?shù)和生物量曲線;b-高山被孢霉葡萄糖質(zhì)量濃度和NH4-N質(zhì)量濃度曲線;c-畢赤酵母溶解氧體積分?jǐn)?shù)和生物量曲線;d-畢赤酵母甘油質(zhì)量濃度和NH4-N質(zhì)量濃度曲線實(shí)心-ALR-HSP;空心-CALR；三角形-菌體濃度;菱形-溶解氧體積分?jǐn)?shù);圓形-NH4-N質(zhì)量濃度;正方形-葡萄糖/甘油質(zhì)量濃度圖3 高山被孢霉和畢赤酵母在ALR-HSP和CALR中的發(fā)酵過程曲線Fig.3 Process curves for the M. alpine and P. pastoris cultivation in the ALR-HSP and CALR

2.2 生長(zhǎng)速率與比生長(zhǎng)速率

高山被孢霉在2種反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)的生長(zhǎng)速率曲線和比生長(zhǎng)速率分別如圖4-a，b所示。菌體進(jìn)入對(duì)數(shù)期后，生長(zhǎng)速率迅速增加，并在28 h達(dá)到峰值后開始變慢。根據(jù)測(cè)定溶氧生長(zhǎng)極限值(當(dāng)DO值低于生長(zhǎng)限制值時(shí)，菌體生長(zhǎng)受到限制)的方法[16]測(cè)得本實(shí)驗(yàn)所用菌體的生長(zhǎng)極限值約為30%。在營(yíng)養(yǎng)物充足的情況下，菌體生長(zhǎng)速率和比生長(zhǎng)速率降低是由于DO限制造成[19]。ALR-HSP培養(yǎng)菌體的最大生長(zhǎng)速率和最大比生長(zhǎng)速率分別比CALR提高25%和30%，這說明了ALR-HSP在氧傳遞性能上的優(yōu)越性。圖4-c，d為畢赤酵母在兩種反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)的生長(zhǎng)速率曲線和比生長(zhǎng)速率曲線。菌體生長(zhǎng)到12 h后開始進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，此時(shí)生長(zhǎng)速率迅速增加，到20 h后，設(shè)備的最大供氧能力限制著菌體的生長(zhǎng)速率。由于ALR-HSP在供氧能力優(yōu)越性，使得ALR-HSP的細(xì)胞生長(zhǎng)速率和比生長(zhǎng)速率分別比CALR提高40%和20%。

a-高山被孢霉生長(zhǎng)速率曲線;b-高山被孢霉比生長(zhǎng)速率曲線;c-畢赤酵母生長(zhǎng)速率曲線;d-畢赤酵母比生長(zhǎng)速率曲線圖4 高山被孢霉和畢赤酵母在ALR-HSP和CALR中培養(yǎng)的生長(zhǎng)速率與比生長(zhǎng)速率Fig.4 Growth rate and specific growth rate for the M. alpine and P. pastoris cultivation in the ALR-HSP and CALR

2.3 高山被孢霉單位菌體脂肪酸組成分析

各脂肪酸的量隨著發(fā)酵時(shí)間不同而發(fā)生變化，脂肪酸總量隨發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)增多，最后趨于恒定(圖5)。相同培養(yǎng)時(shí)間下(發(fā)酵時(shí)間大于48 h)，ALR-HSP中高山被孢霉的脂肪酸總含量明顯高于CALR。2個(gè)反應(yīng)器對(duì)高山被孢霉中脂肪酸組成的影響如表3所示。從表3中可知，ALR-HSP中的菌體產(chǎn)油脂的總量比CALR提高40%，菌體對(duì)碳源的得率提高了6%，總油脂量對(duì)碳源的得率提高了45%。菌體中產(chǎn)生幾種主要脂肪酸含量存在顯著差異，對(duì)比脂肪酸種類發(fā)現(xiàn)，ALR-HSP中菌體產(chǎn)生的脂肪酸的不飽和度比CALR中的高。其原因可能是在供氧充足時(shí)，菌體更容易合成不飽和度高的脂肪酸[20-21]，這說明ALR-HSP的供氧能力強(qiáng)于CALR。

1-ALR-HSP;2-CALR圖5 不同培養(yǎng)時(shí)間下，在ALR-HSP和CALR中培養(yǎng)的高山被孢霉的單位菌體中脂肪酸組成變化Fig.5 Fatty acid composition changes of M. alpine plantscultivated in ALR-HSP and CALR under differentculture time

表3 兩反應(yīng)器對(duì)高山被孢霉中脂肪酸組成的影響Table 3 Effects of two reactors on fatty acid composition by M. alpine

2.4 氧氣消耗速率(OUR)和體積傳質(zhì)系數(shù)(kLa)

從圖6中可以看出，2個(gè)反應(yīng)器中菌體的OUR均在短時(shí)間內(nèi)迅速上升，并在36 h左右開始達(dá)到最大，之后由于反應(yīng)器供氧有限和氮源匱乏等問題，使得菌體生長(zhǎng)受限，致使OUR迅速下降。通風(fēng)發(fā)酵過程中的DO同時(shí)取決于傳氧速率(oxygen transfer rate,OTR)和OUR。其中OUR取決于細(xì)胞密度、代謝活力和營(yíng)養(yǎng)條件,OTR取決于設(shè)備性能、操作條件和發(fā)酵液性質(zhì)。在恒定通風(fēng)條件下，可近似地認(rèn)為OTR主要與設(shè)備性能有關(guān)。又在穩(wěn)態(tài)條件下，有OTR=OUR。因此在穩(wěn)態(tài)條件下，微生物的OUR越高，其對(duì)應(yīng)反應(yīng)器的性能越好。在48～96 h期間DO值無明顯變化，此時(shí)發(fā)酵過程達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)，有OTR=OUR。從圖6-a中可得出有篩板反應(yīng)器中菌體的OUR比無篩板反應(yīng)器中的菌體的OUR高21%～36%。

a-高山被孢霉培養(yǎng)過程中氧氣消耗速率變化;b-高山被孢霉培養(yǎng)過程中體積傳質(zhì)系數(shù)變化圖6 使用ALR-HSP 和 CALR培養(yǎng)高山被孢霉過程中的氧氣消耗速率和體積傳質(zhì)系數(shù)Fig.6 The comparison of OUR and kLa forM. alpine in the ALR-HSP and CALR

圖6-b為培養(yǎng)體系在穩(wěn)態(tài)條件下，根據(jù)公式(2)計(jì)算出來的對(duì)應(yīng)發(fā)酵時(shí)間的體積傳質(zhì)系數(shù)(kLa)。在通氣量為10 L/min條件下，ALR-HSP和CALR的kLa值分別為(0.023 2±0.002 1) s-1和(0.011 5±0.001 3) s-1。ALR-HSP的kLa比CALR提高1倍多，這進(jìn)一步說明了ALR-HSP的優(yōu)勢(shì)。在進(jìn)行通風(fēng)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)前，對(duì)反應(yīng)器進(jìn)行空氣-水實(shí)驗(yàn)，采用動(dòng)態(tài)驅(qū)趕法[22]測(cè)得在通氣量10 L/min條件下，ALR-HSP和CALR的kLa分別為(0.017 3±0.001 6) s-1和(0.009 1±0.000 6) s-1。與使用尾氣分析儀測(cè)出來的kLa數(shù)值接近，但也存在差異，其原因可能是測(cè)定方法和測(cè)量介質(zhì)不同[23]。

氣升式反應(yīng)器的主要能量消耗來源于空壓機(jī)，通風(fēng)量越大，能耗越大。在氣升式反應(yīng)器中，牛頓流體常用公式(3)[23]估算kLa，同理也可以使用此公式計(jì)算kLa對(duì)應(yīng)的表觀氣速(Ug)，公式(4)[24]可用來計(jì)算通氣過程的功率消耗。

(3)

(4)

式中：C和a,常數(shù)，在純水條件下C=0.47，a=0.82；Ug,表觀氣速，m/s；P,空壓機(jī)功率，kW；pi,空壓機(jī)進(jìn)口壓力，bar；po,空壓機(jī)出口壓力，bar；Qg,通氣流量，m3/s。

根據(jù)公式(3)和(4)計(jì)算得出，CALR要達(dá)到ALR-HSP的kLa需要多消耗1倍的功率，這說明ALR-HSP的能量利用效率更高。

培養(yǎng)過程中現(xiàn)場(chǎng)觀察發(fā)現(xiàn)，ALR-HSP中液面以上的泡沫數(shù)量明顯比CALR多。在有篩板條件下，大氣泡被分割為更多的小氣泡，小氣泡的熱力學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，不容易破碎，不斷在液面上方累積。這是今后需要研究者解決的問題，為解決氣泡過多問題，可以與其他消泡設(shè)備同時(shí)使用，例如：離心消泡[25]和旋擊分離器[26]。另外在滅菌結(jié)束后高山被孢霉的絲狀菌株會(huì)附著在篩孔板上，使清洗變得復(fù)雜。但總體上，ALR-HSP相比于CALR，其傳質(zhì)效率和能量利用率上均得到提高，這在提升氣升式反應(yīng)器應(yīng)用范圍方面具有顯著的工業(yè)價(jià)值。

3 結(jié)論

螺旋篩板氣升式反應(yīng)器(ALR-HSP)在畢赤酵母和高山被孢霉的培養(yǎng)過程中表現(xiàn)出了比經(jīng)典氣升式反應(yīng)器(CALR)更加優(yōu)良的傳質(zhì)特性和節(jié)能特性。在高山被孢霉的培養(yǎng)中，在相同功率消耗條件下，ALR-HSP內(nèi)菌體的最大生長(zhǎng)速率和最大比生長(zhǎng)速率分別比CALR提高25%和30%，菌體量增長(zhǎng)約10%，脂肪酸總量提高約40%；在畢赤酵母培養(yǎng)中，在相同功率消耗條件下，ALR-HSP內(nèi)的菌體濃度增長(zhǎng)20%，最大生長(zhǎng)速率和最大比生長(zhǎng)速率分別比CALR提高40%和20%。在低通風(fēng)量條件下，ALR-HSP的傳質(zhì)效率比CALR提高了1倍多。但在培養(yǎng)過程中ALR-HSP也存在一些問題，如在液面上泡沫更多和滅菌后的清洗更為復(fù)雜。這些問題有待進(jìn)一步的研究和解決，以期待這種新型的氣升式反應(yīng)器能夠在工業(yè)上取得廣泛應(yīng)用。