阿拉伯呋喃糖苷酶的重組表達(dá)及其發(fā)酵工藝優(yōu)化

李鴻雁，陸健，李曉敏*

1(工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(江南大學(xué))，江蘇 無錫，214122) 2(糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實(shí)驗(yàn)室(江南大學(xué))，江蘇 無錫，214122) 3(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫，214122) 4(江蘇省生物活性制品加工工程技術(shù)研究中心，江蘇 無錫，214122)

阿拉伯木聚糖(arabinoxylan)是谷物中最主要的非淀粉多糖[1]，基本結(jié)構(gòu)是以β-1,4糖苷鍵連接的D-吡喃木糖線型主鏈，通過C(O)-2、C(O)-3或C(O)-2,3糖苷鍵連接α-L-阿拉伯呋喃糖基取代物，側(cè)鏈C(O)-5位上存在以酯鍵相連的阿魏酸[2]。在大米和高粱中阿拉伯木聚糖結(jié)構(gòu)相對(duì)簡(jiǎn)單，而在大麥、小麥、燕麥、黑小麥、玉米等谷物中相對(duì)復(fù)雜。阿拉伯呋喃糖苷酶(EC 3.2.1.55)可以特異性水解阿拉伯木聚糖側(cè)鏈上的α-1,2、α-1,3和α-1,5糖苷鍵[3]，從而協(xié)同木聚糖酶促進(jìn)阿拉伯木聚糖水解為寡糖。阿拉伯呋喃糖苷酶被歸類于糖基水解酶GH3、GH43、GH51、GH54和GH62家族[5]，不同家族水解酶表現(xiàn)出不同的底物特異性，如GH43家族成員傾向于水解寡糖中的側(cè)鏈，GH51和GH54家族成員可水解阿拉伯聚糖和木聚糖的側(cè)鏈，僅GH62家族成員特異性水解阿拉伯木聚糖側(cè)鏈[6]。其中來源于草酸青霉菌(Penicilliumoxalicumsp.68)的阿拉伯呋喃糖苷酶PoAbf62A即屬于GH62家族，且研究表明，PoAbf62A僅有α-1,3-阿拉伯呋喃糖苷酶活性[7]，具有特殊的研究和應(yīng)用價(jià)值。

目前，已有利用酵母、大腸桿菌、芽孢桿菌等表達(dá)宿主進(jìn)行阿拉伯呋喃糖苷酶的重組表達(dá)的研究[8-10]。相較于其他系統(tǒng)，畢赤酵母具有能夠?qū)⑼庠椿蚍€(wěn)定地同源重組至基因組；胞外分泌蛋白種類少，易于分離純化目的蛋白；便于高密度發(fā)酵等優(yōu)勢(shì)[11]。因此，本研究選取畢赤酵母GS115重組表達(dá)PoAbf62A，并對(duì)酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究，優(yōu)化重組菌株的發(fā)酵條件，為糖苷水解酶家族的研究提供參考，并為開發(fā)以阿拉伯木聚糖為代表的半纖維素資源利用的新方法提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

大腸桿菌(Escherichiacoli) DH5α，畢赤酵母(Pichiapastoris) GS115和pPIC9K質(zhì)粒，本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 試劑

限制性內(nèi)切酶SalⅠ、NotⅠ和EcoRⅠ、rTaq酶、質(zhì)粒提取試劑盒和膠回收試劑盒，TaKaRa公司；對(duì)硝基苯-α-L-阿拉伯呋喃糖苷(p-nitrobenzene-L-arabinofuranoside，pNPAF)、抗生素G418，上海索萊寶生物科技有限公司；低分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker，BBI生命科學(xué)有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

YPD培養(yǎng)基(g/L)：酵母提取物10，蛋白胨20，葡萄糖20；

MD固體培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20，YNB (無氨基酵母氮源)13.4，生物素0.000 4，瓊脂20；

BMGY培養(yǎng)基(g/L)：酵母提取物10，蛋白胨20，YNB 13.4，甘油的體積分?jǐn)?shù)為1.0%，1 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 6.0),體積分?jǐn)?shù)為10%；

BMMY培養(yǎng)基(g/L)：酵母提取物10，蛋白胨20，YNB 13.4，甲醇的體積分?jǐn)?shù)為1.0%，1 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 6.0),體積分?jǐn)?shù)為10%。

1.1.4 主要儀器

瓊脂糖凝膠電泳儀，美國Bio-Rad公司；JD-801凝膠成像儀，江蘇省捷達(dá)科技發(fā)展有限公司；Spectra Max Plus 384酶標(biāo)儀，美國MDC公司；HisTrapTMexcel (1 mL)色譜柱，GE Healthcare公司；Mastercycler pro PCR儀，德國Eppendorf公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1poabf62a基因的克隆和重組表達(dá)

參照GenBank中poabf62a基因序列(GenBank ID：MG874674)，設(shè)計(jì)重組蛋白序列：根據(jù)畢赤酵母密碼子偏好性優(yōu)化poabf62a序列，在其3’端添加His-tag序列，并在其5’和3’端分別添加NotⅠ和EcoR I酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基，由金唯智生物科技(蘇州)有限公司合成，獲得的基因片段經(jīng)NotⅠ和EcoR I雙酶切后，與表達(dá)載體pPIC9K連接，獲得重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K-poabf62a，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α，測(cè)序正確后備用。

表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K-poabf62a經(jīng)SalⅠ酶切線性化后電轉(zhuǎn)入畢赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于含有G418的MD平板篩選轉(zhuǎn)化子，30 ℃培養(yǎng)48 h；待長(zhǎng)出菌落后，隨機(jī)挑取轉(zhuǎn)化子于3 mL YPD培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)36 h，提取基因組作為PCR模板鑒定陽性轉(zhuǎn)化子，所用上下游引物序列為GAGGTCTCCTATCTCTAACTTGGACC/TGGTGGTGATGGTGGTG-CTT。

挑取陽性轉(zhuǎn)化子單克隆至50 mL BMGY培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)24 h后8 000 r/min離心5 min收集菌體，加入50 mL BMMY培養(yǎng)基，每24 h加入500 μL甲醇，30 ℃培養(yǎng)5 d誘導(dǎo)目的基因表達(dá)，8 000 r/min離心5 min收集上清液，SDS-PAGE電泳檢測(cè)重組酶，篩選表達(dá)量較高的轉(zhuǎn)化子。

將篩選獲得的重組酶表達(dá)量最高的轉(zhuǎn)化子接種于50 mL BMGY培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)24 h后，8 000 r/min離心5 min，收集菌體重懸于50 mL BMMY培養(yǎng)基，進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)，甲醇初始體積分?jǐn)?shù)為1.0%，每24 h補(bǔ)加500 μL甲醇進(jìn)行持續(xù)誘導(dǎo)，5 d后于8 000 r/min離心5 min收集上清液，利用Ni-NTA鎳親和層析柱純化重組阿拉伯呋喃糖苷酶，利用SDS-PAGE檢測(cè)純度。

1.2.2 重組PoAbf62A的酶活力測(cè)定

參照HU等[7]的方法，以pNPAF為底物檢測(cè)酶活力，標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系200 μL，其中含150 μL 20 mmol/L pH 4.5醋酸鈉緩沖液，25 μL 0.5 mg/mLpNPAF，純化的酶液25 μL；空白對(duì)照中含有等量沸水浴滅活的酶液。37 ℃反應(yīng)30 min，加入50 μL 0.5 mol/L Na2CO3終止反應(yīng)，靜置30 min，用酶標(biāo)儀測(cè)定OD405，根據(jù)對(duì)硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算反應(yīng)體系中對(duì)硝基苯酚的生成量。37 ℃下1 mg固體酶(或1 mL液體酶)每1 min釋放1 μmol/L對(duì)硝基苯酚所需的酶量定義為1個(gè)酶活力單位(U/mg或U/mL)。

1.2.3 重組PoAbf62A的酶學(xué)性質(zhì)研究

1.2.3.1 酶的最適溫度及其熱穩(wěn)定性

將標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系(見1.2.2)分別于30、35、40、45、50、55和60 ℃水浴反應(yīng)30 min，測(cè)定PoAbf62A酶活力，以其中測(cè)得的最高酶活力設(shè)為100%。將適量純化后的酶液分別置于40、45和50 ℃恒溫水浴保溫90 min，每間隔15 min取樣1次，于最適反應(yīng)條件下測(cè)定殘余酶活力，以保溫0 min時(shí)的酶活力設(shè)為100%。

1.2.3.2 酶的最適pH及其pH穩(wěn)定性

配制20 mmol/L pH 2.5～7.0的醋酸-醋酸鈉緩沖液，分別取150 μL不同pH的緩沖液與25 μL純化的酶液和25 μL 0.5 mg/mLpNPAF混合，37 ℃反應(yīng)30 min后，測(cè)定PoAbf62A酶活力，以其中測(cè)得的最高酶活力設(shè)為100%。將適量純化后的酶液置于上述不同pH緩沖液中，4 ℃放置24 h后，于最適反應(yīng)條件下測(cè)定其殘余酶活力，其中酶活力最高的設(shè)為100%。

1.2.3.3 金屬離子對(duì)重組PoAbf62A活性的影響

在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系(見1.2.2)中加入終濃度為1 mmol/L的金屬離子(K+、Ca2+、Fe2+、Mn2+、Fe3+、Ni2+、Ba2+、Mg2+、Co2+、Zn2+、Cu2+、Al3+)，以不加金屬離子的反應(yīng)體系作為對(duì)照(酶活力設(shè)為100%)，測(cè)定各金屬離子對(duì)PoAbf62A活性的影響。

1.2.3.4 重組PoAbf62A的動(dòng)力學(xué)研究

在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系(見1.2.2)中加入不同濃度pNPAF (0.16～2.60 mmol/L)，在最適條件下測(cè)定酶活力，利用米氏方程雙倒數(shù)法(Lineweavere-Burk)作圖并繪制曲線，計(jì)算Km、vmax和kcat值。

1.2.4 重組PoAbf62A表達(dá)條件優(yōu)化

1.2.4.1 誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間

將BMGY培養(yǎng)基中酵母菌離心后，接種至BMMY培養(yǎng)基，使OD600值為1.0，甲醇初始體積分?jǐn)?shù)為1.0%，30 ℃ 250 r/min發(fā)酵7 d，每24 h補(bǔ)加甲醇使甲醇的體積分?jǐn)?shù)為1.0%，并取1 mL發(fā)酵液離心取上清液，以pNPAF為底物測(cè)定發(fā)酵液酶活力。

1.2.4.2 誘導(dǎo)溫度

將BMGY培養(yǎng)基中酵母菌離心后，分別接種至BMMY培養(yǎng)基，使OD600值為1.0，甲醇初始體積分?jǐn)?shù)為1.0%，分別置于26、28、30、32和34 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，調(diào)整轉(zhuǎn)速為250 r/min，發(fā)酵5 d，每24 h補(bǔ)加甲醇使甲醇體積分?jǐn)?shù)為1.0%，發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵液離心取上清液，以pNPAF為底物測(cè)定發(fā)酵液酶活力。

1.2.4.3 甲醇誘導(dǎo)體積分?jǐn)?shù)

將BMGY培養(yǎng)基中酵母菌離心后，接種至BMMY培養(yǎng)基，使OD600值為1.0，分別添加甲醇使甲醇的體積分?jǐn)?shù)為0.25%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%和2.5%，30 ℃ 250 r/min發(fā)酵5 d，每24 h補(bǔ)加1次相應(yīng)體積分?jǐn)?shù)的甲醇，發(fā)酵結(jié)束后，分別取發(fā)酵液離心，以pNPAF為底物測(cè)定發(fā)酵液酶活力。

1.2.4.4 BMMY培養(yǎng)基的接種量

將含有pPIC9K-poabf62a的轉(zhuǎn)化子在BMGY培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(30 ℃培養(yǎng)24 h)，8 000 r/min離心收集菌體，接種至BMMY培養(yǎng)基，使菌體濃度(OD600)分別為1.0、3.0、5.0、7.0和9.0，甲醇初始體積分?jǐn)?shù)為1.0%，30 ℃ 250 r/min發(fā)酵5 d，每24 h補(bǔ)加甲醇使甲醇的體積分?jǐn)?shù)為1.0%并進(jìn)行持續(xù)誘導(dǎo)，發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵液離心取上清液，以pNPAF為底物測(cè)定發(fā)酵液酶活力。

1.2.4.5 響應(yīng)面試驗(yàn)

根據(jù)以上單因素試驗(yàn)結(jié)果，選出3個(gè)顯著性較明顯的因素：甲醇體積分?jǐn)?shù)(A)、溫度(B)、接種量OD600(C)3個(gè)因素為自變量，發(fā)酵液酶活力為因變量，利用Design Expert 8.0.6軟件設(shè)計(jì)Box-Behnken實(shí)驗(yàn)，確定最佳發(fā)酵工藝參數(shù)組合并進(jìn)行驗(yàn)證。

2 結(jié)果與分析

2.1 PoAbf62A的克隆和表達(dá)純化

GenBank數(shù)據(jù)庫中poabf62a基因全長(zhǎng)996 bp，編碼332個(gè)氨基酸殘基，預(yù)測(cè)蛋白分子質(zhì)量為33 kDa。根據(jù)畢赤酵母密碼子偏好性，優(yōu)化poabf62a序列，通過化學(xué)合成方法合成優(yōu)化的poabf62a基因，并在3’端添加His-tag序列，在其5’和3’端分別加入限制性酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基，以構(gòu)建pPIC9K-poabf62a表達(dá)質(zhì)粒。pPIC9K-poabf62a線性化后電轉(zhuǎn)化至畢赤酵母GS115，經(jīng)PCR驗(yàn)證(圖1-a)及表達(dá)量篩選(圖1-b)，挑選表達(dá)量最高的陽性轉(zhuǎn)化子表達(dá)重組酶，并利用Ni-NTA鎳親和層析柱分離純化，SDS-PAGE電泳顯示重組酶分子質(zhì)量與預(yù)測(cè)結(jié)果基本一致(圖1-c)。

a-PCR鑒定；b-篩選；c-純化蛋白a：M-15 000 bp Marker;1-質(zhì)粒為模板的PCR;2-重組菌株基因組為模板的PCR；b：M-標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker，1、2-轉(zhuǎn)化子發(fā)酵上清液；c：M-標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker；1-純化的酶液圖1 重組子的PCR鑒定和篩選及純化蛋白的SDS-PAGE鑒定Fig.1 Identification and screening of recombinantsand the purified PoAbf62A in SDS-PAGE

2.2 重組PoAbf62A的酶學(xué)性質(zhì)

2.2.1 重組PoAbf62A的最適反應(yīng)溫度和pH

不同反應(yīng)溫度下測(cè)定重組PoAbf62A的酶活力，結(jié)果表明，重組酶最適反應(yīng)溫度為40 ℃，當(dāng)反應(yīng)溫度在30～45 ℃時(shí)，相對(duì)酶活力>80%；當(dāng)反應(yīng)溫度為50 ℃，相對(duì)酶活力約為50%；當(dāng)反應(yīng)溫度>55 ℃，相對(duì)酶活力<20% (圖2-a)。在不同pH緩沖液(pH 2.5～7.0)下測(cè)定重組PoAbf62A的酶活力，結(jié)果表明,重組酶的最適pH值為4.5，在pH 4.0～5.0的范圍內(nèi)相對(duì)酶活力均在80%左右；在pH 5.5時(shí)相對(duì)酶活力約為40%；緩沖液pH<4.0或>6.0，相對(duì)酶活力<40% (圖2-b)。

a-溫度;b-pH圖2 溫度和pH對(duì)重組PoAbf62A活力的影響Fig.2 Effects of temperature and pH on the activity ofrecombinant PoAbf62A

將適量酶液分別在40、45、50 ℃溫度下恒溫水浴90 min，每間隔15 min取酶液于最適反應(yīng)條件下測(cè)定殘余酶活力，將保溫0 min時(shí)的酶活力設(shè)為100%。由圖3-a可知，該酶在40、45、50 ℃條件下較穩(wěn)定，其中40 ℃時(shí)最穩(wěn)定，90 min后酶活力仍保留初始酶活力的50%左右，45 ℃和50 ℃為其次，90 min后分別能剩余20%左右的酶活力。

取適量酶液分別置于pH 2.5～7.0的緩沖液中，4 ℃放置24 h，于最適反應(yīng)條件下測(cè)定殘余酶活力，其中酶活力最高的設(shè)為100%。由圖3-b可知，重組酶在pH 4.5比較穩(wěn)定，處理24 h酶活力最高；在pH 5.0～7.0條件下處理24 h后，殘余酶活力為20%左右；在pH 2.5～4.0條件下處理24 h后，基本喪失活性。

a-溫度;b-pH圖3 溫度和pH對(duì)重組PoAbf62A穩(wěn)定性的影響Fig.3 Effects of temperature and pH on the stability ofrecombinant PoAbf62A

2.2.2 金屬離子對(duì)重組PoAbf62A活性的影響

在以終濃度為1 mmol/L金屬離子的標(biāo)準(zhǔn)體系(見1.2.2)中反應(yīng)測(cè)量純化后重組PoAbf62A酶活力， Fe3+、Mn2+、Cu2+和Fe2+對(duì)重組PoAbf62A的酶活力有強(qiáng)烈的抑制作用，使其幾乎沒有酶活力；Ni2+和Ba2+對(duì)重組PoAbf62A的酶活力有微弱的抑制作用，酶活力分別為對(duì)照的90.3%、79.8%；Zn2 +、Co2+、Mg2+和Al3+對(duì)重組PoAbf62A的酶活力有不同程度的促進(jìn)作用；K+、Ca2+對(duì)其酶活力幾乎沒有影響(表1)。

表1 金屬離子對(duì)重組PoAbf62A酶活力的影響Table 1 Effects of metal ions on the activity ofrecombinant PoAbf62A

2.2.3 重組PoAbf62A的動(dòng)力學(xué)

純化后重組PoAbf62A的酶活力為0.67 U/mg，利用Lineweavere-Burk雙倒數(shù)作圖，分別求取以pNPAF為底物，重組PoAbf62A的Km、Vmax和kcat值。所得米氏方程為y=0.271 3x+0.110 5 (R2=0.997)，重組PoAbf62A的動(dòng)力學(xué)常數(shù)Km、Vmax和kcat值分別為2.46 mmol/L、9.05 μmol/(min·g)和0.22 s-1。

2.3 重組PoAbf62A的發(fā)酵優(yōu)化

2.3.1 單因素實(shí)驗(yàn)

如圖4-a所示，重組菌株在BMMY培養(yǎng)基中培養(yǎng)到120 h時(shí)，發(fā)酵液酶活力最高，為0.12 U/mL。因此，本研究將誘導(dǎo)表達(dá)重組酶的時(shí)間定為120 h。

在不同誘導(dǎo)溫度下發(fā)酵，當(dāng)發(fā)酵溫度為30 ℃時(shí)發(fā)酵液酶活力最高，26和34 ℃時(shí)發(fā)酵液酶活力分別只有最優(yōu)發(fā)酵溫度時(shí)的20%和10%(圖4-b)。當(dāng)溫度過低時(shí)，微生物的代謝緩慢，也不利于營養(yǎng)物質(zhì)的運(yùn)輸，而溫度過高時(shí)，蛋白質(zhì)變性降解，因此溫度過高或過低都不利于重組酶的表達(dá)。

a-誘導(dǎo)時(shí)間；b-誘導(dǎo)溫度;c-甲醇體積分?jǐn)?shù)；d-接種量圖4 誘導(dǎo)時(shí)間、誘導(dǎo)溫度、甲醇體積分?jǐn)?shù)和接種量對(duì)重組菌株產(chǎn)酶的影響Fig.4 The effects of induction period,temperature,methanol volume fraction and inoculation size on theyield of recombinant PoAbf62A

在BMMY培養(yǎng)基中添加誘導(dǎo)劑甲醇使初始體積分?jǐn)?shù)分別為0.25%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%和2.5%，且每隔24 h添加1次甲醇，如圖4-c所示，當(dāng)添加甲醇的體積分?jǐn)?shù)為1.0%時(shí)，發(fā)酵5 d后發(fā)酵液酶活力最高。

比較BMMY培養(yǎng)基中初始菌體濃度(OD600)分別為1.0、3.0、5.0、7.0和9.0時(shí)，發(fā)酵完成后發(fā)酵液酶活力結(jié)果如圖4-d所示，當(dāng)初始OD600值為3.0時(shí)，發(fā)酵5 d后發(fā)酵液酶活力最高。

2.3.2 響應(yīng)面分析

根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，設(shè)計(jì)了17個(gè)實(shí)驗(yàn)的響應(yīng)分析實(shí)驗(yàn)，以甲醇體積分?jǐn)?shù)(A)、溫度(B)、接種量OD600(C)3個(gè)因素為自變量，發(fā)酵液酶活力為因變量，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表2。

表2 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Box-Behnken test design and results

運(yùn)用軟件Design-Expert 8.0.6進(jìn)行回歸分析，獲得二次擬合回歸方程：Y=0.57-0.018A-0.003B-0.006 7C-0.001 3AB-0.038AC-0.003 8BC-0.11A2-0.12B2-0.17C2(R2=0.998 1),對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析模型P>F<0.000 1，失擬項(xiàng)的P>F>0.05表明回歸方程極顯著，該方程為重組菌株發(fā)酵產(chǎn)酶提供了一個(gè)合適的模型，因此可用此模型代替實(shí)際實(shí)驗(yàn)對(duì)重組菌株發(fā)酵產(chǎn)酶進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。根據(jù)軟件計(jì)算回歸模型存在的最大點(diǎn)為：A=1.05，B=30.49，C=2.36，根據(jù)實(shí)際情況將參數(shù)修改為：A=1.05，B=30.5，C=2.4。即得最佳發(fā)酵條件為：添加誘導(dǎo)劑甲醇的體積分?jǐn)?shù)為1.05%，誘導(dǎo)表達(dá)溫度為30.5 ℃，BMMY培養(yǎng)基中接種量OD600值為2.4，在此條件下預(yù)測(cè)發(fā)酵液酶活力為0.55 U/mL，實(shí)驗(yàn)實(shí)際值為0.51 U/mL，與預(yù)測(cè)結(jié)果基本接近，說明所建模型擬合度良好且可靠。

3 結(jié)論與討論

本研究將來源于草酸青霉菌P.oxalicumsp.68的阿拉伯呋喃糖苷酶PoAbf62A在畢赤酵母GS115中重組表達(dá)，具有較好的溫度穩(wěn)定性，對(duì)pH較敏感，在40 ℃和pH 4.5的條件下具有最優(yōu)水解活性。此前報(bào)道的來自稻平臍蠕孢、特異腐質(zhì)霉和青春雙歧桿菌的阿拉伯呋喃糖苷酶，其最適pH值分別為5.0、6.7和6.0，最適溫度分別為50、53和40 ℃[12]，PoAbf62A在酸性環(huán)境中表現(xiàn)出更好的活性和穩(wěn)定性，使得該酶在果汁、酒類等食品加工領(lǐng)域具有更大的優(yōu)勢(shì)。

為了獲得更多的重組酶，本研究結(jié)合單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面分析對(duì)發(fā)酵誘導(dǎo)條件進(jìn)行了優(yōu)化，即BMMY培養(yǎng)基中畢赤酵母工程菌接種量為OD600值為2.4，添加誘導(dǎo)劑甲醇的體積分?jǐn)?shù)為1.05%，且每24 h補(bǔ)加1次，30.5 ℃ 250 r/min誘導(dǎo)120 h，獲得的發(fā)酵液中酶活力為0.51 U/mL。以pNPAF為底物測(cè)得純化后酶的Km值為2.46 mmol/L，最大反應(yīng)速度Vmax值為9.05 μmol/(min·g)，kcat值為0.22 s-1。

研究表明，草酸青霉菌P.oxalicumsp.68的阿拉伯呋喃糖苷酶PoAbf62A屬于可特異性水解阿拉伯木聚糖側(cè)鏈的GH62水解酶家族[12]，但不同于其他GH62家族成員，該酶僅具有α-1,3-阿拉伯呋喃糖苷酶活性[11]。目前，對(duì)GH62家族的阿拉伯呋喃糖苷酶研究顯示，大多數(shù)酶僅能降解單取代的阿拉伯糖側(cè)鏈[13]，能降解雙取代阿拉伯糖側(cè)鏈的阿拉伯呋喃糖苷酶大多來自于GH43家族，但對(duì)α-1,2和α-1,3糖苷鍵無選擇性[14]。PoAbf62A對(duì)取代阿拉伯糖側(cè)鏈和糖苷鍵的特異選擇性，使其在生物技術(shù)和多糖結(jié)構(gòu)研究中具有較大的應(yīng)用潛力。

近年來，隨著能源問題的日益突出，半纖維素資源利用價(jià)值逐漸受到人們的重視。半纖維素是由戊碳糖和(或)己碳糖及其衍生物通過糖苷鍵形成的不均一的帶有支鏈的混合聚糖[15]，其最主要的成分是由β-1,4糖苷鍵連接的D-吡喃木糖主鏈及連接了阿拉伯糖、阿魏酸酯基、葡萄糖醛酸、乙酰基等不同取代基的側(cè)鏈構(gòu)成的阿拉伯木聚糖[16]。阿拉伯木聚糖需要多種酶的參與才能完全水解，木聚糖酶、木糖苷酶水解主鏈[17-18]，水解側(cè)鏈的輔助酶如阿拉伯呋喃糖苷酶可協(xié)助阿拉伯木聚糖的水解，提高阿拉伯木聚糖的降解效率，使底物更徹底地水解，得到阿魏酸、低聚糖阿魏酸酯等產(chǎn)物[19]。研究表明，阿魏酸、低聚糖阿魏酸酯都具有抗氧化、抗輻射、抗菌、抗病毒、抗腫瘤等生理活性[4,20]，因此，阿拉伯呋喃糖苷酶在水解以阿拉伯木聚糖為原料的生物活性物質(zhì)制備中具有廣闊的應(yīng)用前景，對(duì)PoAbf62A的研究將為發(fā)展阿拉伯木聚糖水解酶復(fù)合物制備阿拉伯糖基寡糖提供新的工具，同時(shí)為將草酸青霉菌P.oxalicumsp.68應(yīng)用于其他谷物原材料的再利用提供理論參考。