微囊化釀酒酵母FMS115的高密度培養(yǎng)

,3,*

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院,江蘇南京 210095;2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工所,江蘇南京 210014;3.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院,上海 201306)

釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)是一種真核模式生物,在發(fā)酵、醫(yī)藥、食品和生物等領(lǐng)域均具有十分廣泛的應(yīng)用[1-3],因可以通過無氧呼吸將葡萄糖轉(zhuǎn)化為酒精,且耐高滲性能良好,尤其廣泛應(yīng)用于發(fā)酵和釀造工業(yè)中[4],是人類最早利用的一類微生物。其營養(yǎng)成分十分豐富,含有菌體蛋白質(zhì)、多種氨基酸、維生素、脂肪、食物纖維、礦物元素、微量元素等生理活性物質(zhì)[5]。不僅活的酵母細胞可以發(fā)酵產(chǎn)酒精等香氣物質(zhì),為人類提供各色各樣的食品,死亡的酵母菌體內(nèi)也因豐富的營養(yǎng)物質(zhì)可用來做培養(yǎng)基等生物材料。在實際生產(chǎn)中,由于體積的限制和營養(yǎng)物質(zhì)的消耗,酵母在培養(yǎng)一代左右即停止生長,因此解決酵母高密度培養(yǎng)的問題有助于實現(xiàn)以最少的投入獲得最大的利益。

細胞高密度培養(yǎng)(high-cell density cultivation,HCDC)是指在一定的培養(yǎng)條件下,在不影響胞內(nèi)產(chǎn)物積累的基礎(chǔ)上,盡可能多地積累生物量[6]。常用的微生物高密度培養(yǎng)方法有恒定分批培養(yǎng)、補料流加培養(yǎng)、連續(xù)培養(yǎng)和細胞循環(huán)培養(yǎng)[7]。Eugene等[8]以補料分批培養(yǎng)的方式,采用合成培養(yǎng)基,獲得了140 g/L的最大干細胞生物量。王穎等[9]優(yōu)化的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件最終使釀酒酵母細胞密度提高了22.0%。目前許多研究主要集中在培養(yǎng)條件的優(yōu)化,無法解決代謝產(chǎn)物的抑制,由于發(fā)酵產(chǎn)業(yè)規(guī)模擴大,傳統(tǒng)菌體培養(yǎng)方式的缺陷凸顯,解決代謝產(chǎn)物的抑制比解決菌體生長的營養(yǎng)需求更加迫切[10]。本文擬對培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進行優(yōu)化,在條件優(yōu)化的基礎(chǔ)上,結(jié)合微膠囊技術(shù)和半連續(xù)補料培養(yǎng)方法,以解決產(chǎn)物的抑制作用,達到高密度培養(yǎng)的目的。

微膠囊是一種允許小分子營養(yǎng)物質(zhì)自由進入和囊內(nèi)代謝產(chǎn)物自由排出,同時阻止囊外生物大分子進入的物質(zhì),曾作為基因重組細胞的免疫隔離和運載工具[11-12]。早期研究是將海藻酸鈉滴入氯化鈣溶液中,形成海藻酸鈣固芯含菌膠囊,這種膠囊密度高,菌體主要生長在空隙和表面,空間效應(yīng)不佳,生長量不高[13-14]。液芯膠囊在物質(zhì)運輸方面更容易,細胞生長均勻,密度大[15],多用于乳酸菌的增殖培養(yǎng)[16]。酵母體積大,無氧呼吸產(chǎn)CO2,生長速度快,微膠囊易破裂,只能靜置培養(yǎng),微膠囊化酵母培養(yǎng)的研究甚少。因此,本實驗擬將菌液與氯化鈣混合滴入海藻酸鈉溶液中,聚合形成液芯微膠囊,通過更換培養(yǎng)基,增加菌體密度。

酵母菌株FM-S-115發(fā)酵性能良好,耐糖性和耐酒精性強,是一株較為優(yōu)質(zhì)的釀酒酵母[17-18]。本實驗在培養(yǎng)基YPDB基礎(chǔ)上,將優(yōu)化碳源及碳源含量、氮源及氮源含量四個因素;在培養(yǎng)條件上,將優(yōu)化溫度、菌液接種量和培養(yǎng)基初始pH三個因素,確定影響最顯著的三個因素,設(shè)計正交試驗得出最適培養(yǎng)條件,最后將合適海藻酸鈉和氯化鈣質(zhì)量濃度下制得的微膠囊包裹酵母在最適條件下靜置培養(yǎng)4代,達到高密度培養(yǎng)的目的,以期為酵母的高密度培養(yǎng)相關(guān)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

釀酒酵母FM-S-115 保存于江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所食品生物工程研究室;馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA):0.3%馬鈴薯浸粉、2.0%葡萄糖、1.4%瓊脂;酵母浸出粉胨葡萄糖肉湯培養(yǎng)基(YPDB):1.0%蛋白胨、0.5%酵母浸出粉、2.0%葡萄糖;葡萄糖、蔗糖、果糖、麥芽糖、乳糖 分析純,西隴科學(xué)股份有限公司;蛋白胨、胰蛋白胨、酪蛋白胨、酵母浸粉、牛肉膏 分析純,北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司;海藻酸鈉、氯化鈣、黃原膠、殼聚糖 食品級,南京松冠生物科技有限公司。

UV-1600PC紫外分光光度計 上海美普達儀器有限公司;SW-CJ-1C型雙人單面凈化工作臺 蘇州凈化設(shè)備有限公司;TOMYSX500自動滅菌鍋 日本Tomy Digital Biology公司;FE28pH計 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;DHZ-DA冷凍恒溫振蕩器 蘇州培英實驗設(shè)備有限公司;JB-10磁力攪拌器 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種活化 將甘油管保存的菌種在無菌條件下接種到Y(jié)PDB培養(yǎng)基中,28 ℃,150 r/min搖床培養(yǎng);活化2～3代后作為菌液使用。

1.2.2 生長曲線測定 將預(yù)先活化好的菌液以3%的接種量接入YPDB培養(yǎng)基中,28 ℃,150 r/min搖床培養(yǎng),培養(yǎng)時間為24 h。每隔2 h取一次樣,三組平行試驗,測定菌體的OD600,以時間為橫坐標(biāo),OD值為縱坐標(biāo),繪制生長曲線。

1.2.3 單因素實驗 分別優(yōu)化碳源及含量、氮源及含量、溫度、培養(yǎng)基pH和菌液接種量七個條件,每組實驗3個平行。由于處理條件不同,培養(yǎng)液的顏色有差別,為了減小培養(yǎng)液顏色的誤差,取1 mL菌液離心去上清液,加5 mL蒸餾水,測量稀釋5 倍下OD600,以菌體稀釋5倍下的OD600表示菌體密度,下同。

1.2.3.1 培養(yǎng)基優(yōu)化 以YPDB為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,分別以乳糖、果糖、麥芽糖、葡萄糖和蔗糖取代碳源,含量2%,其余培養(yǎng)基成分不變,28 ℃,150 r/min,培養(yǎng)16 h,確定最適碳源;預(yù)實驗中,將碳源含量持續(xù)增加至14%,菌株生長量持續(xù)增加,參考此結(jié)果,設(shè)置碳源含量為14%、16%、18%、20%以及培養(yǎng)基本身的碳源含量2%,優(yōu)化碳源含量。以蛋白胨、胰蛋白胨、酪蛋白胨、酵母粉和牛肉膏取代培養(yǎng)基中的氮源,含量1%,其余培養(yǎng)基成分不變,28 ℃,150 r/min,培養(yǎng)16 h,確定最適氮源;設(shè)置最適氮源含量為0%、1%、3%、5%和7%,優(yōu)化氮源含量。

1.2.3.2 培養(yǎng)條件優(yōu)化 以YPDB為培養(yǎng)基，分別設(shè)置溫度20、25、30、35 ℃，此時培養(yǎng)基初始pH6.7(pH自然)，菌液接種量為3%，優(yōu)化培養(yǎng)溫度。設(shè)置培養(yǎng)液初始pH2.0、3.0、4.0、5.0、6.0和pH6.7(pH自然)，此時溫度為28 ℃，菌液接種量為3%，優(yōu)化培養(yǎng)基初始pH。設(shè)置菌液接種量1%、3%、5%、7%、9%、11%，此時培養(yǎng)基初始pH6.7(pH自然)，溫度為28 ℃，優(yōu)化菌液接種量。

1.2.4 正交試驗 單因素實驗結(jié)果得出,溫度、培養(yǎng)液初始pH和碳源含量三個因素影響最顯著,借助正交設(shè)計助手Ⅱ軟件,采用三因素三水平L9(34)的正交設(shè)計實驗,確定最適合菌株生長的條件。正交試驗的因素和水平設(shè)計如表1所示。

表1 正交試驗的因素水平Table 1 Factors and levels of orthogonal test

1.2.5 液芯微膠囊化酵母的制備

1.2.5.1 微膠囊制備 具體制備方法參考文獻[19],略作修改。將培養(yǎng)至對數(shù)期的酵母菌懸液8000 r/min,離心3 min取菌體,將菌體加入到0.3%黃原膠和氯化鈣的混合液中,混合均勻后,逐滴滴入勻速攪拌的海藻酸鈉溶液中,立即收集預(yù)膠囊,用無菌水沖洗數(shù)次后,轉(zhuǎn)入0.1%的殼聚糖溶液中成膜30 min,收集微膠囊,用無菌水徹底洗去殘留的殼聚糖,即制備完成。

1.2.5.2 海藻酸鈉質(zhì)量濃度的確定 參考同類研究[20],配制質(zhì)量濃度分別為0.8%、1.0%、1.2%和1.5%的海藻酸鈉溶液,此時氯化鈣質(zhì)量濃度保持在7.0%,選擇破囊率最小時的濃度為合適的海藻酸鈉質(zhì)量濃度。

1.2.5.3 氯化鈣質(zhì)量濃度的確定 配制質(zhì)量濃度分別為3.0%、5.0%、7.0%和9.0%的氯化鈣溶液,此時海藻酸鈉質(zhì)量濃度保持在1.2%,選擇破囊率最小時的濃度為合適的氯化鈣質(zhì)量濃度。

1.2.5.4 破囊率的計算

式(1)

1.2.6 微囊化酵母高密度培養(yǎng) 將合適的海藻酸鈉和氯化鈣質(zhì)量濃度下制得的微囊化酵母置于最適培養(yǎng)條件下靜置培養(yǎng),16 h后將膠囊過濾轉(zhuǎn)移到無菌新鮮培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng),取膠囊計活菌數(shù),如此延續(xù)培養(yǎng)幾代,直至膠囊中活菌數(shù)不再升高時即為培養(yǎng)結(jié)束。

1.2.7 活菌總數(shù)的測定 培養(yǎng)基菌液活菌計數(shù):用無菌生理鹽水梯度稀釋菌液,選擇10-4、10-5和10-6三個稀釋度的菌懸液100 μL于無菌培養(yǎng)皿中,再及時倒入融化且冷卻至45 ℃左右的YPDB培養(yǎng)基,立即充分搖勻,30 ℃條件下,培養(yǎng)24 h后菌落計數(shù),將各平板中計得的菌落數(shù)的平均值換成單位容積的含菌量,再乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù),得出每毫升菌液的活菌數(shù)[22],即菌體密度,單位為CFU/mL。

囊內(nèi)活菌計數(shù):取培養(yǎng)結(jié)束的完整膠囊,微膠囊與破囊液1∶10搖晃至完全破碎,用無菌生理鹽水梯度稀釋,以下操作步驟同菌液活菌計數(shù),單位為CFU/g。

破囊液[23]的制備方法:由0.20 mol/L NaHCO3和0.06 mol/L Na3C6H507·2H2O混合而成。

1.3 數(shù)據(jù)分析

實驗中的數(shù)據(jù)均為三組重復(fù),用SAS V8分析顯著性差異,正交設(shè)計助手Ⅱ設(shè)計正交試驗,Origin 8.5繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 釀酒酵母FM-S-115的生長曲線

釀酒酵母FM-S-115以YPDB為培養(yǎng)基,30 ℃,150 r/min培養(yǎng)24 h,其生長情況見圖1。由圖1可知,前8 h增長速度快,細胞活力高。在8～16 h內(nèi),增長速度降低,菌體密度逐步趨于穩(wěn)定。16 h時菌體密度達到最高且不再增加,進入平穩(wěn)期。對比竇冰然等[24]得出的面包酵母的生長曲線在24 h之后達到平穩(wěn)期,此株釀酒酵母生長時間更短,在實際生產(chǎn)中優(yōu)勢明顯?？紤]到穩(wěn)定期內(nèi)菌體互相競爭導(dǎo)致活性下降,選擇16 h為最佳培養(yǎng)時間。

圖1 菌株FM-S-115的生長曲線Fig.1 Growth curve of FM-S-115

2.2 培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件優(yōu)化

2.2.1 碳源種類對菌株FM-S-115生長量的影響 以乳糖、果糖、麥芽糖、葡萄糖和蔗糖作為培養(yǎng)基碳源,考察不同碳源對菌體的生長情況的影響,結(jié)果見圖2?？梢钥闯?蔗糖和果糖均是優(yōu)質(zhì)的碳源,其中蔗糖的利用率最高(OD600=1.115)且差異顯著(P<0.05),其次是葡萄糖和麥芽糖,與朱作華等[25]對耐高溫、耐高糖的酒精酵母的條件優(yōu)化中得出的實驗結(jié)果相同,實驗中選擇蔗糖為最適碳源。

圖2 碳源種類對菌株FM-S-115生長量的影響Fig.2 Effect of carbon source on growth of FM-S-115注:圖中不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05),圖3～圖10同。

2.2.2 碳源含量對菌株FM-S-115生長量的影響 為考察菌株FM-S-115對碳源含量的耐受性,改變蔗糖含量為2%、14%、16%、18%和20%,結(jié)果如圖3。由圖3可知,蔗糖含量2%～20%的范圍內(nèi),OD值先升高后趨于平穩(wěn),在16%時最高,達到1.843,比2%蔗糖添加量對應(yīng)的OD值1.142提高了40%,對比李飛龍等[26]研究得出的布拉氏酵母的最適葡萄糖含量在0.5 g/L的結(jié)果來說,此株酵母更耐糖且嗜糖。隨著蔗糖含量繼續(xù)增加,菌體密度呈現(xiàn)下降的趨勢,原因可能是細胞膜內(nèi)外滲透壓不平衡,抑制了細胞的生長?？紤]到生產(chǎn)中碳源含量過高還會加速菌體生長,過早到達穩(wěn)定期,不利于生產(chǎn)發(fā)酵,經(jīng)方差分析蔗糖含量在16%、18%和20%下的結(jié)果無顯著性差異(P>0.05)的情況下,選擇16%為FM-S-115最適碳源含量。

圖3 碳源含量對菌株FM-S-115生長量的影響Fig.3 Effect of carbon source contenton growth of FM-S-115

2.2.3 氮源種類對菌株FM-S-115生長量的影響 為考察不同氮源對酵母FM-S-115生長量的影響,選擇了蛋白胨、胰蛋白胨、酪蛋白胨、酵母粉和牛肉膏五種常見的有機氮源取代YPDB中的氮源培養(yǎng)酵母,結(jié)果見圖4?？梢钥闯?酵母FM-S-115對五種氮源均有較高的利用率,尤其是蛋白胨、胰蛋白胨、酪蛋白胨和酵母粉,稀釋五倍下的OD值均大于1.1,且無顯著性差異(P>0.05),由于蛋白胨最為便宜易得,選為最適氮源。

圖4 氮源種類對菌株FM-S-115生長量的影響Fig.4 Effect of nitrogen sourceon growth of FM-S-115

2.2.4 氮源含量對菌株FM-S-115生長量的影響 上述實驗得出最適氮源是蛋白胨,以YPDB為培養(yǎng)基,改變蛋白胨的含量為0%、1%、3%、5%和7%,觀察不同的蛋白胨含量對菌體生長的影響,結(jié)果見圖5?？梢钥闯?蛋白胨含量對菌體OD值的影響表現(xiàn)為先升高后減少,1%時OD值最大為1.057,濃度繼續(xù)增大OD值明顯降低,原因在于不適宜的氮源含量對菌體的生長和產(chǎn)物的表達合成都可能產(chǎn)生負面影響[27]?？紤]到實際發(fā)酵中會影響產(chǎn)物的合成,選擇1%為最適氮源含量。

圖5 氮源含量對菌株FM-S-115生長量的影響Fig.5 Effect of nitrogen source contenton growth of FM-S-115

2.2.5 溫度對菌株FM-S-115生長量的影響 通過考察20、25、30、35 ℃四個溫度下菌株的長勢,選擇合適的發(fā)酵溫度,結(jié)果見圖6。由圖6可知,當(dāng)培養(yǎng)溫度逐漸提高時,菌體的生長量先增加后降低,在30 ℃時達到最高,與趙小麗等[28]對釀酒酵母的高密度培養(yǎng)條件優(yōu)化得出的最適培養(yǎng)溫度在30 ℃的研究結(jié)果一致。分析可知溫度的提高會加速細胞代謝,從而加速菌體生長,但是過高會降低酶活性,因此溫度高于30 ℃時,菌體密度逐漸降低。故實驗中選擇30 ℃為最適培養(yǎng)溫度。

圖6 溫度對菌株FM-S-115生長量的影響Fig.6 Effect of temperature on growth of FM-S-115

2.2.6 培養(yǎng)液初始pH對菌株FM-S-115生長量的影響 菌株在培養(yǎng)基pH2～6.7范圍內(nèi)的生長情況結(jié)果見圖7。如圖7所示,pH2.0～4.0時,酵母的生長量隨之增加,pH4.0時達到最高(OD600=0.941),大于4.0時對菌體的生長顯示出抑制作用,原因在于不適宜的pH環(huán)境影響菌體的生長代謝。此外,菌株在pH4.0～6.7的范圍OD值變化不大,說明此菌株有較寬廣的pH適應(yīng)范圍。實驗中選擇菌體密度最大時的pH4.0為適宜培養(yǎng)基pH。

圖7 培養(yǎng)液初始pH對菌株FM-S-115生長量的影響Fig.7 Effect of initial pH of mediumon growth of FM-S-115

2.2.7 菌液接種量對菌株FM-S-115生長量的影響 接種量大小對菌體生長的影響如圖8所示。可以看出,接種量1%～7%范圍內(nèi),菌體密度隨之增加,在7%時最大(OD600=1.155),繼續(xù)增加接種量菌體密度下降,原因是接種量過低會延長發(fā)酵時間,過高會使得酵母之間互相競爭養(yǎng)分,過早到達衰退期。對比鄭苗等[29]對東方伊薩酵母研究得出2%接種量時菌體生長效果最佳的結(jié)果,此株釀酒酵母更能耐受較高的接種量。實驗中在5%～9%的范圍內(nèi)無顯著差異(P>0.05)的情況下,為了菌體的活性以及發(fā)酵產(chǎn)物的積累考慮,選擇5%為該菌株的最適接種量。

圖8 菌液接種量對菌株FM-S-115生長量的影響Fig.8 Effect of inoculation amounton growth of FM-S-115

2.2.8 正交試驗結(jié)果 通過對比各個單因素實驗結(jié)果的菌體OD值增長幅度以及結(jié)合數(shù)據(jù)顯著性差異分析,可以得出三個影響最大的因素:溫度、培養(yǎng)液初始pH和碳源含量。正交試驗結(jié)果如表2所示。根據(jù)極差分析結(jié)果看出,三個因素之間影響最大的是溫度,其次是培養(yǎng)液初始pH,碳源含量影響最小。最優(yōu)組合為A3B3C2,即溫度為32 ℃,pH為4.5,碳源含量為16%時,菌體稀釋5倍下的OD值最大,為1.471。對OD值分析,試驗號8和試驗號9的結(jié)果沒有顯著性差異(P>0.05),為選出最優(yōu)組合對兩組培養(yǎng)基進行菌落計數(shù)。試驗號8的菌落總數(shù)為1.51×108CFU/mL,試驗號9為1.79×108CFU/mL,因此選擇試驗號9,即溫度為32 ℃,pH為4.5,蔗糖含量為16%為最佳培養(yǎng)條件,此條件下的菌落總數(shù)是優(yōu)化之前液體培養(yǎng)(YPDB培養(yǎng)基,28 ℃、150 r/min,培養(yǎng)16 h,下同)菌落總數(shù)1.02×108CFU/mL的1.75倍。

表2 FM-S-115菌株條件優(yōu)化正交試驗結(jié)果Table 2 Results of orthogonal test foroptimization of FM-S-115 cultivation conditions

2.3 微囊化酵母FM-S-115高密度培養(yǎng)結(jié)果

2.3.1 海藻酸鈉質(zhì)量濃度的確定 海藻酸鈉質(zhì)量濃度對培養(yǎng)一代后的膠囊破囊率的影響如圖9所示?？梢钥闯?在0.8%～1.5%的范圍內(nèi),破囊率先降低后升高,在1.2%時,破囊率最低,為14.89%。繼續(xù)升高海藻酸鈉質(zhì)量濃度,破囊率升高,原因可能是海藻酸鈉濃度過低時,不能滿足鈣離子的配位需求,造成微膠囊孔隙過大,通透性大大增加,濃度過高時,配位數(shù)增加,空隙減小,膠囊的囊壁增厚,通透性降低,導(dǎo)致破囊率升高[19]。實驗中選擇制備微膠囊的海藻酸鈉質(zhì)量濃度為1.2%。

圖9 海藻酸鈉質(zhì)量濃度對破囊率的影響Fig.9 Effect of sodium alginateconcentration on capsule damage rate

圖10 氯化鈣質(zhì)量濃度對破囊率的影響Fig.10 Effect of calcium chlorideconcentration on capsule damage rate

2.3.2 氯化鈣質(zhì)量濃度的確定 氯化鈣質(zhì)量濃度對培養(yǎng)一代后的破囊率的影響如圖10所示?？梢钥闯?3.0%～9.0%的范圍內(nèi),破囊率先降低后升高,7%時破囊率最低,為13%左右,濃度繼續(xù)增加,形成的膠囊通透性低,酵母的生長空間狹窄,導(dǎo)致破囊率升高。此外,酵母發(fā)酵過程中產(chǎn)氣也是一個重要原因。實驗中選擇制備微膠囊的氯化鈣質(zhì)量濃度為7.0%。

2.3.3 微囊化酵母活菌計數(shù)結(jié)果 隨著更換培養(yǎng)基次數(shù)的增加,囊內(nèi)活菌數(shù)的變化如圖11?？芍?培養(yǎng)至第4代菌落總數(shù)最大,到第5代時密度略降低,因為更換囊內(nèi)菌體培養(yǎng)基次數(shù)增加,酵母老化,膠囊破碎,菌體流出,故確定培養(yǎng)代數(shù)為4代。培養(yǎng)結(jié)束時破囊計得囊內(nèi)活菌總數(shù)為8.10×108CFU/g,是在優(yōu)化前液體培養(yǎng)1.02×108CFU/mL的7.94倍,是優(yōu)化后液體培養(yǎng)1.79×108CFU/mL的4.53倍,菌體密度得到大幅提升,達到了酵母高密度培養(yǎng)的目的。

圖11 培養(yǎng)代數(shù)對活菌計數(shù)的影響Fig.11 Influence of culture generations on colony count

3 結(jié)論

通過單因素和正交試驗實驗得出最適培養(yǎng)基為:1.0%蛋白胨,0.5%酵母浸出粉,16%蔗糖;最適培養(yǎng)條件為:溫度32 ℃、培養(yǎng)基初始pH4.5、菌液接種量5%,150 r/min培養(yǎng)16 h。在此條件下培養(yǎng),酵母FM-S-115的活菌數(shù)為1.79×108CFU/mL,是優(yōu)化前1.02×108CFU/mL的1.75倍。通過對液芯微膠囊制備過程海藻酸鈉和氯化鈣濃度優(yōu)化,海藻酸鈉質(zhì)量濃度為1.2%,氯化鈣質(zhì)量濃度為7.0%時,破囊率最低。微囊化酵母在最適條件下連續(xù)培養(yǎng),最終囊內(nèi)活菌總數(shù)為8.10×108CFU/g,是培養(yǎng)條件優(yōu)化前液體培養(yǎng)的7.94倍,是優(yōu)化后液體培養(yǎng)的4.53倍,可見將微生物微膠囊化包埋后培養(yǎng)對提高生長量方面有很大意義。