析因設計探究溫度與水分活度對美拉德反應模型的影響

黃楊斌,杜卿卿,任曉鏷,彭增起,張雅瑋

(南京農業(yè)大學食品科技學院,江蘇南京 210095)

美拉德反應是廣泛存在于食品加工與貯藏中的一類羰氨縮合反應[1],不僅能夠應用于食品加工中影響產品的色澤和風味,還可作為加工食品中的抗氧化劑和抗褐變劑[2]、評估食品貯藏期間的營養(yǎng)品質[3]以及熱反應香精的制作與利用等。隨著人們對美拉德反應機理的研究深入以及應用技術的日益成熟,美拉德反應在食品加工中越來越受到重視。

美拉德反應的定向控制一直備受研究者們關注,然而美拉德反應過程十分復雜,受到諸多因素影響,反應底物氨基酸及糖的種類、結構都對反應劇烈程度和反應產物風味有較大的影響[4-7]。而反應過程中的外界條件特別是溫度[8]和水分活度[9]也不容忽視,Lan等[10]研究了大豆肽-木糖美拉德模型在80～130 ℃下反應2 h的變化,肽段降解速率從臨界溫度100 ℃升高到120 ℃時會顯著加快,苦味氨基酸和低分子肽會減少,Eric等[11]的研究表明溫度的改變會使向日葵水解物美拉德反應產物色澤發(fā)生改變,并產生不同的揮發(fā)性風味物質,造成感官特性的變化;Cuzzoni等[12]的研究結果也表明溫度的升高和水分活度的降低都會使核糖-賴氨酸和葡萄糖-賴氨酸美拉德模型產物褐變程度加深,這些研究都表明溫度和水分活度在美拉德反應模型中的重要性。盡管早前有較多的美拉德反應條件相關研究文獻,但水分活度對美拉德反應模型的影響研究較少,且溫度和水分活度對美拉德反應的影響并非是獨立作用的,應結合兩者共同探究其影響,然而,水分活度對美拉德模型風味的作用以及水分活度和溫度對美拉德反應的協(xié)同作用研究在國內卻鮮有報道。

本研究采用析因試驗設計,著重于美拉德反應的溫度和水分活度兩大因素,以豬肉酶解物和半胱氨酸、葡萄糖、六磷酸葡萄糖、硫胺素作為反應底物建立美拉德反應模型體系,研究反應溫度和水分活度及協(xié)同交互作用對美拉德反應模型的影響,通過反應模型感官評分、褐變程度、電子鼻信號等指標進行探討分析,并闡述其對模型色澤、氣味的影響,為研究豬肉風味美拉德反應提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮豬里脊肉 江蘇省蘇食肉品有限公司;半胱氨酸鹽酸鹽、葡萄糖、硫胺素、六磷酸葡萄糖二鈉、丙三醇、小蘇打、復合蛋白酶(酶活≥120000 U/mg)、風味蛋白酶(酶活≥20000 U/mg) 上海瀚鴻科技股份有限公司;所有試劑及材料均為食品級。

便攜式移液槍 德國EPPENDORF公司;D-1-70型高壓蒸氣滅菌鍋 北京發(fā)恩科貿有限公司;PEN3型便攜式電子鼻 德國AIRSENSE公司;DGG-9240A型電熱恒溫鼓風干燥箱 上海森信實驗儀器有限公司;CP522C型電子天平 上海奧豪斯儀器有限公司;Bante221型便攜式pH計 上海般特儀器制造有限公司;MUL-9000型全自動純水系統(tǒng) 南京總馨純水設備有限公司;DU 730型紫外-可見分光光度計 美國Beckman Coulter有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 豬肉提取液的制備 豬肉提取液的制備參考文獻[13]的方法并做修改。選取適量豬里脊肉,剔除可見脂肪及結締組織并切成肉糜,稱取肉樣(100±0.5) g加入400 mL蒸餾水,于90 ℃水浴處理10 min,待冷卻至室溫用食用小蘇打調節(jié)pH至中性,加入復合蛋白酶和風味蛋白酶(酶總量4%,比例1∶1)于50 ℃下酶解4 h,酶解完成后升溫至95 ℃滅酶10 min,用砂布濾去肉渣得初濾液,于4000 r/min離心15 min,取上清液即為制備的豬肉提取液,待用。

1.2.2 美拉德反應模型體系的建立 實驗選取2 mmol葡萄糖、1 mmol六磷酸葡萄糖二鈉、1 mmol半胱氨酸、1 mmol硫胺素作為反應底物,添加水分活度αw為0.85、0.80、0.75(丙三醇添加量分別為4.00、5.40、7.11 g)的豬肉提取液5 mL溶解,添加小蘇打調節(jié)pH至中性,建立美拉德反應模型體系,密封后置于高壓滅菌鍋中反應,設定反應時間70 min和溫度為115、120、125 ℃,反應結束后冷卻至室溫,進行美拉德反應產物的色澤、氣味評定分析。

1.2.3 析因實驗設計 經過前期實驗和文獻參考[14-15]選取四種底物摩爾質量比即葡萄糖∶六磷酸葡萄糖二鈉∶半胱氨酸∶硫胺素=2∶1∶1∶1溶于丙三醇與豬肉提取液混溶的混合液進行反應,以美拉德反應模型水分活度和溫度分別設定3個水平,反應產物OD值、產物感官評分值以及電子鼻響應值為指標設計兩因素三水平的3×3析因試驗,因素水平組合表見表1。每組實驗3次重復,3個平行。

表1 析因設計水平組合表Table 1 Combination table of factorial design

1.2.4 感官評定 本實驗感官評定對該美拉德反應模型進行反應后色澤及風味評定,將美拉德反應模型風味細分為肉香味、焦糊味、硫刺激味和其他異味四種,先由經過培訓的15名評定人員分別進行反應模型色澤、肉香味、焦糊味、硫刺激味和其他異味的強弱辨別評定實驗,之后再依據(jù)感官評分標準進行嗜好程度感官評定,評定人員間獨立進行不互相交流,各項評定分數(shù)結果取平均值。感官評定標準見表2。

表2 美拉德反應產物風味感官評定標準Table 2 Standard of sensory evaluation for the flavor Maillard reaction product

表3 PEN3電子鼻的標準傳感器陣列Table 3 Details of 10 sensors for PEN3 portable electric nose

1.2.5 褐變程度的測定 由于420 nm處的紫外吸光度OD值可以用來檢測美拉德反應褐變產物,以此來表示產物的褐變程度[16]。對反應完成的美拉德反應液取樣,稀釋30倍,于420 nm處測定產物吸光度,取平均值。

1.2.6 電子鼻檢測 稱取所需測定的各組樣品0.8 mL置于10 mL頂空瓶中,加蓋密封。置于30 ℃下加熱10 min,依次用PN3型電子鼻進行上機檢測。PN3電子鼻檢測參數(shù)設置:傳感器清洗時間100 s,歸零時間10 s,樣品準備時間5 s,樣品測試時間120 s,初始注射流量80 mL/min,內部流量100 mL/min。為保證數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性和精確性,經實驗選取測定過程中117～120 s的數(shù)據(jù)用于后續(xù)分析。表3為該型號電子鼻各傳感器對應的檢測對象及范圍。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計使用IBM SPSS 22.0統(tǒng)計軟件在顯著性水平P=0.05下進行方差分析(ANOVA),用鄧肯多重比較法(Duncan’s檢驗)進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 溫度和水分活度對美拉德反應模型感官風味的影響

從表4析因結果分析,在115和125 ℃時,美拉德反應模型色澤評分值隨水分活度降低而無顯著變化(P>0.05);但120 ℃時,隨著水分活度降低,模型色澤評分值升高(P<0.05)且水分活度為0.80試驗組評分值最高。當水分活度為0.85時,模型色澤評分值隨著溫度的升高也無明顯變化;但水分活度為0.80和0.75時,模型色澤評分值是隨溫度的升高而先升高后降低且120 ℃實驗組評分值最高(P<0.05);當溫度為120 ℃和水分活度為0.75或0.80時色澤感官評分最優(yōu)。從主效應及方差分析結果得知,溫度和水分活度都對美拉德反應模型色澤評分值有極顯著影響(P<0.01),且溫度與水分活度的相互作用對美拉德反應模型色澤評分值有顯著性影響(P<0.05)。

在各水分活度(0.75、0.80、0.85)下,肉香風味感官評分值都隨著溫度的升高無明顯變化;在各溫度(115、120、125 ℃)下,肉香風味感官評分值隨水分活度的升高而也無明顯變化。且主效應和方差分析結果也表明,溫度和水分活度都對美拉德反應肉香風味無顯著性影響(P>0.05);溫度和水分活度對美拉德反應肉香風味無顯著性交互作用(P>0.05)。肉香味的產生主要是美拉德反應模型中常見的吡嗪類風味物質作用的結果,當100 ℃以下時吡嗪類物質產生較少,只有較為清淡的肉湯風味,而當溫度達到100 ℃以上時吡嗪類物質會隨反應時間的增加而增加,并產生較為強烈的烤肉香味[17]。吡嗪類風味物質主要是α-二羰基化合物和氨基酸通過Strecker降解反應產生[18],溫度115～125 ℃和水分活度0.75～0.85反應條件可能沒有明顯地限制氨基酸的Strecker降解過程。

當美拉德反應溫度為115和120 ℃時,水分活度對美拉德反應焦糊風味無顯著性影響(P>0.05);而當溫度為125 ℃時,0.85水分活度實驗組焦糊風味感官評分值最高,比0.80水分活度實驗組焦糊風味感官評分值高1.11(P<0.05),比0.75水分活度實驗評分值高1.22(P<0.05),且該溫度下焦糊風味感官評分值和水分活度呈正相關。當水分活度為0.85時,美拉德反應焦糊風味評分值隨著溫度的升高而先升高后降低(P<0.05),120 ℃實驗組評分值最高,較于其他兩溫度組評分值高1.22;而水分活度為0.80和0.75時,美拉德反應焦糊風味評分值隨著溫度的升高而降低(P<0.05),125 ℃實驗組評分值較于115、120 ℃組分別低了1.44和1.89、1.89和2.33。當溫度為120 ℃時,美拉德反應焦糊風味評分值最優(yōu)。從主效應分析來看,溫度對美拉德反應焦糊風味評分值的影響大于水分活度。方差分析結果表明溫度對美拉德反應焦糊風味有極顯著性影響(P<0.01);水分活度對美拉德反應焦糊風味無顯著性影響(P>0.05);溫度和水分活度對美拉德反應焦糊風味有顯著的交互作用(P<0.05)。焦糊風味是高溫條件下美拉德反應中常見的帶有焦糖及苦味的風味,焦糊風味主要是由呋喃和呋喃酮類風味物質作用產生,溫度的升高會加速呋喃和呋喃酮類風味物質的生成,進而產生更濃厚的焦糊風味[19]。呋喃類風味物質主要來源于糖的焦糖化反應和碳水化合物的降解,而隨著溫度的升高呋喃類物質會顯著增加[11],因此溫度對焦糊風味的產生有較大的影響。

表4 美拉德反應模型感官評定結果分析Table 4 Analysis of sensory evaluation results of Maillard reaction model

當美拉德反應溫度為115和120 ℃時,隨著水分活度的降低,美拉德反應硫刺激風味評分值并未有顯著的變化(P>0.05);而當溫度為125 ℃時,美拉德反應硫刺激風味評分值隨水分活度的降低而顯著降低(P<0.05),水分活度為0.85時評分值為6.78最高,高出水分活度為0.75實驗組1.22評分值(P<0.05)。當水分活度為0.85和0.80時,硫刺激風味感官評分值隨溫度的升高而無顯著影響(P>0.05);而當水分活度為0.75時,拉德反應硫刺激風味評分值隨溫度的升高而降低(P<0.05),120 ℃實驗組評分值最高且比125 ℃高1.33(P<0.05)。當溫度為120 ℃和水分活度為0.75時,美拉德反應硫刺激風味評分值最高。再從主效應和方差結果分析,溫度和水分活度對美拉德反應硫刺激風味無顯著性影響(P>0.05),但溫度和水分活度對美拉德反應硫刺激風味有顯著的交互作用(P<0.05)。美拉德反應模型中的硫刺激風味可能來源于含硫底物半胱氨酸、硫胺素,Zhang等[20]研究溫度和半胱氨酸對大豆蛋白美拉德反應產物的影響,發(fā)現(xiàn)添加半胱氨酸組比未添加組有更強的硫刺激肉香味。Eric等[11]也考察了溫度和半胱氨酸對向日葵水解物美拉德反應產物感官特性的影響,結果表明半胱氨酸添加組隨著溫度的升高而噻吩類物質升高,而噻吩類風味物質是產生硫刺激氣味的重要物質。然而,本研究結果表明單獨的溫度和水分活度的改變對于硫刺激風味的形成無明顯影響(P>0.05),反映了盡管是較為極端的反應條件,硫化物前體物半胱氨酸和硫胺素的反應仍然不會太劇烈[17]。

在各水分活度(0.75、0.80、0.85)下,異味感官評分值都隨著溫度的升高無明顯變化;在各溫度(115、120、125 ℃)下,異味感官評分值隨水分活度的升高而也無明顯變化。方差分析結果也表明,溫度和水分活度都對美拉德反應其他異味無顯著性影響(P>0.05);溫度和水分活度對美拉德反應其他異味無顯著性交互作用(P>0.05)。美拉德反應模型中除產生一些比較明顯的氣味如肉香味、焦糊味、硫刺激味之外,還會生成較多的低閾值風味物質,由于這些風味較雜,故本研究中將其統(tǒng)稱為其他異味。且本研究結果表明溫度和水分活度改變并未對美拉德反應模型造成比較嚴重的異味影響。

由美拉德反應模型色澤風味的5組感官評定分析,綜合情況下,9組實驗組中溫度為120 ℃、水分活度為0.75實驗組無論色澤和風味感官評分都是最優(yōu)的。

2.2 溫度和水分活度對美拉德反應模型褐變程度的影響

從表5析因結果進行分析,當115和120 ℃時,隨著水分活度的降低,美拉德反應產物OD值升高,水分活度為0.85和0.75的試驗組產物OD值有顯著變化(P<0.05),但115 ℃試驗組顏色并無變化;當溫度在125 ℃時,水分活度為0.80時反應體系OD值最高,即褐變程度最高且顏色最深呈棕色,相較于其他兩水分活度實驗組有顯著性差異(P<0.05),較于0.75和0.85組分別顯著升高了11.03%和10.73%。當水分活度在0.85、0.80和0.75時,隨著溫度的升高,美拉德反應模型OD值顯著升高即褐變程度顯著升高(P<0.05),模型色澤也逐步加深,從淺紅色到橘紅色,最后變成紫紅色甚至棕色,125 ℃溫度試驗組模型OD值較于115 ℃組在不同水分活度0.85、0.80、0.75分別升高了81.25%、78.10%和57.02%。Zhang等[20]研究了溫度80、100、120、140 ℃對大豆蛋白-核糖美拉德反應褐變程度的影響,溫度的升高使美拉德反應產物于420 nm的OD值和色澤顯著性升高。Lan[10]也研究發(fā)現(xiàn)大豆蛋白-木糖美拉德反應模型在80～130 ℃溫度下在420 nm處吸光度隨著溫度的升高而顯著升高。本研究顯示當溫度為125 ℃和水分活度為0.80時,產物OD值最大,即美拉德反應產物褐變程度最高且顏色最深。從主效應進行分析及方差分析結果得知,溫度和水分活度都對美拉德反應產物褐變程度有極顯著的影響(P<0.01),且溫度與水分活度的相互作用對美拉德反應產物褐變程度有極顯著影響(P<0.01)。

表5 美拉德反應模型褐變結果分析Table 5 Analysis of browning results of Maillard reaction model

美拉德反應褐變速率會受水分活度影響,水分活度低于反應最大褐變速率臨界值時,褐變速率受分子遷移率的影響,水分活度升高褐變速率便會加快,而水分活度高于反應最大褐變速率臨界值時,褐變速率主要受到水分子的影響,水分活度升高,水分子則越多而稀釋了底物濃度,褐變速率被抑制[21-23]。有研究者表明水分活度在0.55～0.70之間美拉德反應褐變速率達到最大值[24-25],然而Eichner等[26]表明最適褐變速率的水分活度條件取決于反應物的類型。模型褐變主效應分析結果中水分活度升高而模型褐變程度先增大后減小,可能就如Bell[27]研究中所說不同反應模型的最大反應褐變速率臨界值不同,而當水分活度高于當前反應體系最大褐變速率臨界值時,水分子稀釋了底物濃度,使分子間碰撞程度減弱,褐變速率減小。

2.3 溫度和水分活度對美拉德反應模型電子鼻檢測的影響

表6 美拉德反應模型電子鼻結果分析Table 6 Analysis results of the electronic nose of Maillard reaction model

從表6電子鼻析因結果可得,R1～R5傳感器信號值都低于1.5,故溫度和水分活度對美拉德反應模型產生的影響可能更多反映在R6～R10這幾類傳感器信號值中。

當溫度為115 ℃時,甲基類物質(R6傳感器)信號值隨著水分活度的降低而降低(P<0.05)。當水分活度為0.85和0.80時,甲基類物質(R6傳感器)信號值隨著溫度的升高而降低(P<0.05);水分活度為0.75時,甲基類物質(R6傳感器)信號值隨著溫度的升高而先升高后降低(P<0.05)。從主效應及方差分析結果顯示溫度和水分活度都對模型產生甲基類物質有極顯著的影響(P<0.01),且溫度與水分活度的交互作用對模型產生甲基類物質有極顯著影響(P<0.01)。豬肉主要風味物質中甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪以及2,6-二甲基吡嗪都是重要的甲基類物質,它們對反應模型中肉香味、堅果香、焦糖風味的產生貢獻很大[20],溫度和水分活度的改變使主要風味物質的產生發(fā)生變化。而對于模型中長鏈烷烴物質的產生,當溫度為115和120 ℃時,長鏈烷烴物質(R10傳感器)信號值隨水分活度的降低而降低(P<0.05);而當溫度為125 ℃時,長鏈烷烴物質(R10傳感器)信號值隨水分活度的降低而升高(P<0.05)。在水分活度為0.85和0.80時,長鏈烷烴物質(R10傳感器)信號值隨溫度的升高而降低(P<0.05)。主效應及方差分析結果也表明溫度和水分活度都對模型生成長鏈烷烴物質有極顯著的影響(P<0.01),且溫度與水分活度的相互作用對模型生成長鏈烷烴物質有極顯著影響(P<0.01)。烷烴類物質是美拉德反應模型中常見的風味物質,這些物質的產生大部分可能是由于添加豬肉提取液的原因,而試驗結果顯示溫度和水分活度的改變都對這類物質的產生有較大的影響。

在各溫度(115、120、125℃)下,醇類物質(R8傳感器)信號值隨水分活度的升高而無明顯變化。在水分活度為0.85時,醇類物質(R8傳感器)信號值隨溫度的升高也無明顯變化;水分活度為0.80和0.75時,醇類物質(R8傳感器)信號值隨溫度升高而顯著降低(P<0.05)。主效應及方差分析結果顯示,只有溫度對模型生成醇類物質有極顯著的影響(P<0.01)。美拉德反應模型中產生的醇類物質在整體風味的形成上也發(fā)揮了重要作用,模型風味形成中多數(shù)不飽和醇如1-辛烯-3-醇和1-戊烯-3-醇都對反應模型風味有重要貢獻[28],但它們幾乎是通過熱降解產生,故溫度對醇類生成有較大的影響。然而本研究中溫度的升高使醇類物質信號值降低,模型的感官香氣卻無明顯變化,可能是試驗溫度限制了香氣貢獻低的醇類熱降解反應的進行。

當溫度為115和120 ℃時,無機硫化物(R7傳感器)信號值隨水分活度降低而降低(P<0.05);而當溫度為125 ℃時,無機硫化物(R7傳感器)信號值隨著水分活度的降低而升高(P<0.05)。在水分活度為0.85和0.80時,無機硫化物(R7傳感器)信號值隨溫度升高而降低(P<0.05);水分活度為0.75時,無機硫化物(R7傳感器)信號值隨溫度升高而升高(P<0.05)。從主效應及方差分析結果可知,溫度和水分活度都對模型生成無機硫化物有極顯著的影響(P<0.01),且溫度與水分活度的交互作用對模型生成無機硫化物也有極顯著影響(P<0.01)。電子鼻R7傳感器檢測的無機硫化物主要是美拉德反應底物半胱氨酸和硫胺素通過Strecker降解反應產生的硫化氫類物質,而硫化氫類物質也可能在反應中生成有機硫化物[15],對于試驗中溫度和水分活度反應條件的改變使R7傳感器信號值和感官硫刺激性氣味都產生顯著性差異,可能是它們抑制或促進半胱氨酸底物的反應速率。

在溫度為115和120 ℃時,有機硫-芳香化合物(R9傳感器)信號值即隨水分活度的降低而降低(P<0.05);溫度為125 ℃時,有機硫-芳香化合物(R9傳感器)信號值卻隨水分活度的降低而升高(P<0.05)。當水分活度為0.85時,有機硫-芳香化合物(R9傳感器)信號值隨溫度的升高而降低(P<0.05);水分活度為0.80時,115 ℃實驗組的有機硫-芳香化合物(R9傳感器)信號值顯著高于其他兩溫度組(P<0.05);而水分活度為0.75時,125 ℃實驗組有機硫-芳香化合物(R9傳感器)信號值較于其他兩組有顯著性升高(P<0.05)。從主效應及方差分析結果可知,溫度和水分活度都對模型生成有機硫-芳香化合物有極顯著的影響(P<0.01),且溫度與水分活度的交互作用對模型生成有機硫-芳香化合物也有極顯著影響(P<0.01)。本研究中溫度對模型有機硫-芳香化合物生成的結果與Zhang等[20]研究的溫度與半胱氨酸對大豆蛋白-核糖美拉德反應模型產生有機硫-芳香化合物的結果基本一致。而含硫化合物及其衍生物也是美拉德模型中產生肉香味的重要風味物質[5],豬肉風味中存在許多重要的有機硫化物,如硫醇、噻吩、噻唑等,它們提供了重要的肉風味香氣,溫度和水分活度的升高都能引起這些物質的改變。

3 討論與結論

由本實驗結果可知,溫度和水分活度對美拉德反應模型的影響并非獨立的,研究反應中只考慮溫度而忽視水分活度的作用是不準確的,模型中水分活度對模型中色澤和風味也存在顯著性影響(P<0.05);而兩者中的交互作用更是不可忽視,水分活度和溫度的交互作用對美拉德反應模型色澤、焦糊風味、硫刺激風味以及產生的重要風味物質都有顯著性甚至極顯著的影響(P<0.05或P<0.01)。溫度對美拉德反應模型褐變程度的影響結果正如Zhang[20]和Lan[10]研究的結果一致,即隨著溫度的升高,模型褐變程度越高,色澤越深,而水分活度以及兩者交互作用雖不及溫度對色澤與褐變程度影響大,但也有顯著性影響(P<0.05);對于反應模型風味,溫度對焦糊風味有極顯著的影響(P<0.01),這可能是呋喃類物質在高溫下急劇增加的原因;交互作用對焦糊風味、硫刺激風味都有顯著性影響(P<0.05);對于受溫度影響巨大的反應模型電子鼻響應值,除醇類物質外,水分活度和交互作用都對其他幾種風味物質有極顯著的影響(P<0.01);總體而言,水分活度和交互作用也對反應模型色澤、風味有顯著性影響。本文中對于感官評分值和風味物質之間、褐變和色澤之間存在關系尚未加以分析,以及更低的水分活度條件影響,還需進行更多深入探究,但通過感官評定結果,暫定溫度120 ℃和水分活度0.75條件下能獲得更加理想的美拉德反應模型色澤及風味。