火絨草聯(lián)合黃芪對系膜增生性腎小球腎炎模型大鼠腎功能的改善作用及機制研究

齊越 仲坤 賈冬 李熒 袁龍 黃培池 單舒筠 楊彩瑜 高俠

摘 要 目的：研究火絨草聯(lián)合黃芪對系膜增生性腎小球腎炎（MsPGN）模型大鼠腎功能的改善作用及其可能機制。方法：將85只大鼠按體質量隨機分為假手術組（n=10）和造模組（n=75）。假手術組大鼠行假手術，造模組大鼠采用免疫學方法（弗氏佐劑+牛血清蛋白+脂多糖）復制MsPGN模型。選取造模成功的70只大鼠，按體質量隨機分為模型組，火絨草+黃芪高、中、低劑量組（4.05、2.03、1.02 g/kg，以生藥總量計），火絨草單用組（2.70 g/kg，以生藥量計），雷公藤多苷片組（陽性對照1，0.02 g/kg）和鹽酸貝那普利片組（陽性對照2，0.02 g/kg），每組10只。假手術組和模型組大鼠灌胃等體積生理鹽水，各給藥組大鼠灌胃相應藥液，每天給藥1次，灌胃體積均為15 mL/kg，連續(xù)給藥5周。末次給藥后，測定大鼠24 h尿蛋白、尿肌酐和血肌酐水平;稱定右側腎質量并采用蘇木精-伊紅染色法觀察腎組織病理形態(tài)學變化;采用免疫組化法檢測腎組織中核轉錄因子-κB p65（NF-κB p65）蛋白表達水平;采用Western blotting法測定腎組織中NF-κB、NF-κB抑制蛋白α（IκBα）、細胞外調節(jié)蛋白激酶（ERK）、磷酸化ERK（p-ERK）、p38絲裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）蛋白表達水平。結果：與假手術組比較，模型組大鼠右側腎質量、24 h尿蛋白、血肌酐水平以及腎組織中NF-κB p65、p-ERK、p38 MAPK蛋白表達水平均顯著升高（P<0.05或P<0.01）;尿肌酐水平和腎組織中IκBα蛋白表達水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01）;腎組織出現(xiàn)腎小球明顯肥大、系膜區(qū)細胞彌漫性增多、腎小管壞死等病理形態(tài)學變化。與模型組比較，火絨草單用組大鼠右側腎質量、血肌酐水平均顯著降低（P<0.05），尿肌酐水平顯著升高（P<0.05），但24 h尿蛋白水平差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）;火絨草+黃芪高劑量組大鼠右側腎質量、24 h尿蛋白、血肌酐水平以及腎組織中NF-κB p65、p-ERK、p38 MAPK蛋白表達水平均顯著降低（P<0.05），尿肌酐水平和腎組織中IκBα蛋白表達水平均顯著升高（P<0.05或P<0.01）;火絨草+黃芪中、低劑量組大鼠上述指標差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）;各給藥組大鼠腎組織病理變化均得到不同程度的改善，并以火絨草+黃芪高劑量組改善較明顯。結論：高劑量火絨草+黃芪可通過抑制MAPK/NF-κB信號途徑達到改善MsPGN模型大鼠腎功能的作用。

關鍵詞 火絨草;黃芪;系膜增生性腎小球腎炎;炎癥;腎功能;機制;p38絲裂原活化蛋白激酶;核轉錄因子-κB;大鼠

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To study the improvement effect and possible mechanism of Leontopodium leontopodioides combined with Astragalus membranaceus on the renal function of mesangial proliferative glomerulonephritis （MsPGN） model rats. METHODS： Totally 85 rats were randomly divided into sham operation group （n=10） and modeling group （n=75）. Sham operation group underwent sham operation， and MsPGN model was induced by immunological method [Freunds adjuvant+BSA +lipopolysaccharide （LPS）] in modeling group. After successfully modeling， 70 rats were randomly divided into model group， L. leontopodioides+A. membranaceus high-dose， medium-dose and low-dose groups （4.05， 2.03， 1.02 g/kg， by total crude drug）， L. leontopodioides alone group （2.70 g/kg， by crude drug）， Tripterygium glycosides tablet group （positive control 1， 0.02 g/kg）， Lotensin tablet group （positive control 2， 0.02 g/kg）， with 10 rats in each group. Sham operation group and model group were given constant volume of normal saline intragastrically; administration groups were given relevant drug solution intrasgastrcially at a volume of 15 mL/kg， once a day， for consecutive 5 weeks. At last administration， 24 h urinary protein， urine creatinine and serum creatinine were determined in rats. The right kidney was weighed， and HE staining was used to observe the pathomorphology? changes of renal tissue. Immunohistochemistry was used to detect the protein expression of NF-κB p65 in renal tissue. Western blotting assay was used to determine the protein expressions of NF-κB p65， IκBα， ERK， p-ERK and p38 MAPK in renal tissue. RESULTS： Compared with sham operation group， right kidney weight， 24 h urine protein and serum creatinine levels， protein expressions of NF-κB p65， p-ERK and p38 MAPK in renal tissue were increased significantly in model group （P<0.05 or P<0.01）; the level of urine creatinine and protein expression of IκBα in renal tissue were decreased significantly （P<0.05 or P<0.01）; there were obvious glomerular hypertrophy， diffuse increase of mesangial cells， necrosis of renal tubules and other pathomorphological changes in renal tissue. Compared with model group， right kidney weight and serum creatinine level were decreased significantly in L. leontopodioides alone group （P<0.05）， while urine creatinine level was increased significantly （P<0.05）， but there was no statistical significance in the level of 24 h urine protein （P>0.05）; the right kidney weight， 24 h urine protein， serum creatinine level and protein expression levels of NF-κB p65， p-ERK and p38 MAPK in renal tissue were decreased significantly in L. leontopodioides+A. membranaceus high-dose group （P<0.05）， while the urine creatinine level and protein expression level of IκBα in renal tissue were increased significantly （P<0.05 or P<0.01）; there was no statistical significance in above indexes in L. leontopodioides+A. membranaceus medium-dose， low-dose groups （P>0.05）; pathological changes of renal tissue were improved to different extents in administration groups， especially in L. leontopodioides+A. membranaceus high-dose group. CONCLUSIONS： High dose of L. leontopodioides+A. membranaceus can improve renal function of MsPGN model rats by inhibiting MAPK/NF-κB signal pathway.

KEYWORDS? ?Leontopodium leontopodioides; Astragalus membranaceus; Mesangial proliferative glomerulonephritis; Inflammation; Renal function; Mechanism; p38 MAPK; NF-κB; Rats

系膜增生性腎小球腎炎（Mesangial proliferative glomerulonephritis，MsPGN）是常見的腎小球疾病，為慢性腎炎的主要病型之一，主要特征是腎小球系膜細胞增殖和細胞外基質沉積[1]。目前，常見的治療藥物為腎上腺皮質激素、抗凝血劑及細胞毒性藥物等[2]，但由于這些藥物療效差，且并發(fā)癥和不良反應多，因此迫切需要找到更有效、安全的治療藥物。近年來，中藥在中醫(yī)辨證治療的基礎上，克服了化學藥治療的局限性，在MsPGN的治療方面取得了一定的療效[3]。

火絨草為菊科火絨草屬植物火絨草[Leontopodiumleontopodioides（Willd.） Beauv.]的全草，具有疏風解表、清熱解毒、涼血止血、益腎利水、消炎利尿之功效[4]，在東北民間常用于抗炎治療[5]。筆者在前期研究中發(fā)現(xiàn)，火絨草單煎液可降低MsPGN模型大鼠血肌酐和尿素氮水平，但對其尿蛋白的改善作用較差。而近年來的研究結果表明，蛋白尿對腎臟有直接的毒性作用，更是腎臟病變嚴重程度的重要標志，并且與MsPGN疾病的進展密切相關[6]。黃芪首載于《神農本草經(jīng)》，為豆科植物膜莢黃芪[Astragalus mongholicus （Bge.） Hsiao]的干燥根，具有消毒排膿、利水消腫的功效，常用于腎炎的治療，特別在降低蛋白尿作用方面療效顯著[7]。因此，筆者推測火絨草和黃芪聯(lián)用可能有益于MsPGN的治療。

MsPGN的發(fā)生發(fā)展與多種因素有關，其中炎癥反應被認為是MsPGN的一個關鍵路徑[8]。核轉錄因子-κB（NF-κB）作為一種核轉錄因子，可通過調節(jié)炎癥介質和細胞因子基因的轉錄，在腎小球腎炎、間質性腎炎和腎血管疾病的發(fā)病機制中發(fā)揮著重要作用[9]。細胞外信號調節(jié)激酶（ERK）和p38絲裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）作為MAPK的兩個亞單位，可增加下游NF-κB的表達，加速炎癥反應[10]。阻斷或抑制炎癥反應已成為防治MsPGN的關鍵。鑒于此，本研究旨在探討火絨草和黃芪聯(lián)用對MsPGN模型大鼠的改善作用，并從炎癥信號通路MAPK/NF-κB探討其可能的作用機制，為將其用于MsPGN的治療提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

BP221S型萬分之一分析天平（德國Sartorius公司）;Multiskan FC型酶標儀（德國Thermo Fisher Scientific公司）;Tanon 5200型全自動化學分光圖像分析系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）;BX-53型光學顯微鏡（日本Olympus公司）;RM2245型石蠟切片機、EG1150型包埋機（德國Leica公司）;TKY-TKA型烤片機（湖北泰康醫(yī)療設備有限公司）。

1.2 藥品與試劑

火絨草飲片（批號：170416，產地：遼寧）、黃芪飲片（批號：161121，產地：內蒙古）均購自遼寧中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院中藥藥劑科，經(jīng)該院藥物分析室尤獻民研究員鑒定均為真品;雷公藤多苷片（上海復旦復華藥業(yè)有限公司，批號：171201，規(guī)格：10 mg）;鹽酸貝那普利片（北京諾華制藥有限公司，批號：X2657，規(guī)格：10 mg）;牛血清白蛋白（BSA）、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑（美國 Sigma公司）;脂多糖（LPS，北京索萊寶科技有限公司，批號：1116L031）;尿蛋白定量試劑盒、血清總蛋白定量試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號：20180530、20180820）;兔抗NF-κB p65、ERK、NF-κB抑制蛋白α? ? （IκBα）、β-肌動蛋白（β-actin）多克隆抗體（北京博奧森生物技術有限公司，批號：bs-0465R、bsm-52259R、bs-1287R、bs-10966R）;辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）二抗（美國Abcam公司，批號：GR3208239-1）;免疫組化通用型試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司，批號：13J31H10J1022）;其余試劑均為分析純，水為純凈水。

1.3 動物

SPF級健康SD大鼠85只，雄性，體質量180～220 g，由遼寧長生生物技術有限公司提供，實驗動物生產合格證號：SCXY（遼）2015-0001。所有受試動物均飼養(yǎng)于遼寧中醫(yī)藥大學實驗動物中心，分籠飼養(yǎng)（每籠5只），飼養(yǎng)室溫度為20～23 ℃、相對濕度為50%～60%。本研究經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學動物倫理委員會批準，實驗操作符合《實驗動物管理條例》要求。

2 方法

2.1 藥物制備

2.1.1 火絨草單煎液 取火絨草150 g，加入1 500 mL水，浸泡30 min后，煎煮2 h，濾過，收集濾液;殘渣加? ? ?1 000 mL水，煎煮1 h，濾過，收集濾液;殘渣再加500 mL水，煎煮0.5 h，濾過，收集濾液。合并3次濾液，濃縮，得到終體積約為833 mL的濃縮液（得率約為0.18 g/mL，以生藥量計），于4 ℃下保存，待用。

2.1.2 火絨草-黃芪混煎液 取火絨草150 g、黃芪300 g，加4 500 mL水，浸泡30 min后，煎煮2 h，濾過，收集濾液;殘渣加3 000 mL水，煎煮1 h，濾過，收集濾液;殘渣再加1 500 mL水，煎煮0.5 h，濾過，收集濾液。合并3次濾液，濃縮，得到終體積約為1 666 mL的濃縮液（得率約為0.27 g/mL，以生藥總量計），于4 ℃下保存，待用。

2.2 MsPGN模型的制備

參考文獻方法[11]并加以改進。大鼠用10%水合氯醛（3.0 mL/kg）腹腔注射麻醉后，俯臥位放置于無菌操作臺上，備皮，手術部位依次涂抹碘伏、75%乙醇進行消毒后，沿左肋脊角入口逐層剪開大鼠皮膚及肌肉層，暴露腎臟，快速用手術線（75%乙醇提前浸泡）結扎左側腎臟的腎動脈、腎靜脈和輸尿管，剪下左側腎臟，并用青霉素鈉處理結扎處，逐層縫合傷口，消毒，涂抹火棉膠。術后第8天，每只大鼠皮下注射0.1 mg弗氏完全佐劑+3 mg BSA;術后第15、22 天，每只大鼠分別皮下注射0.1 mg弗氏不完全佐劑+3 mg BSA;術后第30天，每只大鼠連續(xù)4次腹腔注射BSA，每次間隔1 h，每次劑量分別為0.5、1.0、1.5、3.0 mg;術后第31 天，每只大鼠腹腔注射2.0 mg BSA;自術后第37天起，每只大鼠每日1次腹腔注射BSA，劑量從每只0.5 mg開始，每日增加0.5 mg，直至每只大鼠每日劑量達到5.0 mg;術后第46～87天，每只大鼠從每日腹腔注射BSA 5 mg開始，每7天增加1 mg，直到每日劑量達到10 mg為止。此外，于術后第43天，每只大鼠尾靜脈注射100 ?g LPS。于造模結束后（即術后第88天），采用代謝籠收集大鼠尿液，進行24 h尿蛋白檢測，若尿蛋白水平顯著升高則視為造模成功[12]。實驗造模及給藥過程中，對大鼠進行一般狀況觀察，并對死亡情況進行記錄。

2.3 分組與給藥

大鼠適應性飼養(yǎng)1周后，按體質量隨機分為假手術組（n=10）和造模組（n=75）。造模組大鼠按“2.1”項下操作復制MsPGN模型;假手術組大鼠在麻醉后開腹暴露左側腎臟，但不切除，其余步驟同造模組（皮下、腹腔、尾靜脈注射的均為生理鹽水）。造模組大鼠在手術過程中死亡2只（因手術線裂開、皮膚切口處感染導致），尾靜脈注射LPS引發(fā)超敏反應死亡2只，造模結束后24 h尿常規(guī)檢驗顯示尿蛋白為陰性1只，共有70只大鼠造模成功。將這70只大鼠按體質量隨機分為模型組，火絨草-黃芪高、中、低劑量組（4.05、2.03、1.02 g/kg，以生藥總量計），火絨草單用組（2.70 g/kg，以生藥量計），雷公藤多苷片組（陽性對照1，0.02 g/kg），鹽酸貝那普利片組（陽性對照2，0.02 g/kg），每組10只。各給藥組大鼠灌胃相應藥物，假手術組與模型組大鼠灌胃相應體積蒸餾水，每天1次，給藥體積均為15 mL/kg，連續(xù)給藥5周。參照火絨草民間用量為15 g，黃芪在2015年版《中國藥典》（一部）中的用量為9～30 g設置劑量?；鸾q草+黃芪給藥組劑量設置依據(jù)：按火絨草人用量15 g、黃芪人用量30 g計，大鼠用量為45 g×0.018（大鼠200 g與人70 kg體質量的系數(shù)比）×5=4.05 g/kg（以生藥總量計），以此為高劑量;倍比稀釋后，以其1/2、1/4倍劑量作為中、低劑量?；鸾q草單用組劑量設置依據(jù)：按火絨草人用量15 g計，大鼠用量為15 g×0.018（系數(shù)比同上）×5=1.35 g/kg（以生藥量計），以其2倍量（即2.7 g/kg，以生藥量計）為大鼠的給藥劑量。雷公藤多苷片組劑量設置依據(jù)：按雷公藤多苷片人用量0.1 g計，大鼠用量為0.1 g×0.018（系數(shù)比同上）×5=0.009 g/kg，其2倍量為0.018 g/kg，為便于給藥選擇0.02 g/kg作為大鼠的給藥劑量。鹽酸貝那普利片組劑量設置依據(jù)：大鼠給藥劑量為文獻用量[13]的2倍。

2.4 24 h尿蛋白和血肌酐、尿肌酐水平測定

于給藥結束的前1天，用代謝籠收集各組大鼠24 h尿液，按相應試劑盒方法檢測24 h尿蛋白、尿肌酐水平。末次給藥1 h后，以10%水合氯醛（3.0 mL/kg）腹腔注射麻醉大鼠，腹主動脈采血，然后以3 000 r/min離心10 min，取上層血清，按照相應試劑盒說明書操作測定血清中肌酐水平。

2.5 腎質量測定及腎組織病理形態(tài)學觀察

各組大鼠腹主動脈取血后立刻解剖摘取右側腎組織，剝離腎外膜，稱定腎組織質量。然后將大鼠右側腎組織的一半于-80 ℃下冷凍保存，另一半腎組織置于4%多聚甲醛中固定，常規(guī)脫臘脫水后制備切片（厚度為5 ?m），再行蘇木精-伊紅（HE）染色，在光學顯微鏡下觀察其病理形態(tài)學變化。

2.6 腎組織中NF-κB p65蛋白表達水平測定

采用免疫組織化學法。每組隨機選取6只大鼠的腎組織切片（“2.5”項下制備），于干燥箱中（溫度60 ℃）脫臘至水，以磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌2次，每次7 min;滴加3%過氧化氫溶液后，室溫放置10 min，水洗脫2 min×3次;將切片浸入0.01 mol/L枸櫞酸鹽溶液（pH 6.0）中，加熱至沸騰后取出，以PBS洗滌5 min×2次;滴加5%BSA封閉液，室溫孵育20 min;滴加NF-κB p65一抗（1 ∶ 100），4 ℃孵育過夜;PBS洗滌7 min×3次，滴加二抗（1 ∶ 4 000），37 ℃孵育20 min;PBS洗滌7 min×3次，加入二氨基聯(lián)苯胺顯色后以蘇木素復染;水清洗，脫水，透明，樹脂膠封片，在光學顯微鏡下進行觀察。細胞內棕黃色顆粒為NF-κB p65蛋白陽性表達。用JEOA 801D形態(tài)學圖像分析系統(tǒng)計算各組大鼠腎組織中陽性細胞的平均光密度值，用來表示目標蛋白表達水平。

2.7 腎組織中NF-κB p65、IκBα、ERK、p-ERK和p38 MAPK蛋白表達水平測定

采用Western blotting法檢測。每組隨機選取5只大鼠腎組織（“2.5”項下冷凍保存），解凍后加入RIPA裂解液，用剪刀快速將組織剪成小碎塊，勻漿，在4 ℃條件下以12 000 r/min離心20 min，采用二喹啉甲酸（BCA）法測定蛋白濃度。蛋白變性后，取50 ?g總蛋白進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳，然后以恒流（100 mA，2 h）電轉至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上;以5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，分別加入NF-κB p65（1 ∶ 400）、IκBα（1 ∶ 300）、ERK（1 ∶ 1 000）、p-ERK（1 ∶ 800）、p38 MAPK（1 ∶ 400）和β-actin（1 ∶ 1 000）一抗，4 ℃下孵育過夜;PBS洗膜10 min×3次，然后加入二抗（1 ∶ 4 000），室溫孵育2 h;PBS洗膜10 min×3次，加入發(fā)光液（ECL）進行曝光，在凝膠成像系統(tǒng)中顯影。用Image J? V1.8.0.112圖像分析軟件進行灰度值分析，以目標蛋白條帶與內參β-actin條帶的灰度值比值表示目標蛋白的表達水平。

2.8 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料以x±s表示。首先對數(shù)據(jù)進行正態(tài)性檢驗，符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)，多組間比較采用單因素方差分析，若方差齊性則采用LSD檢驗進行組間兩兩比較，若方差不齊性則采用Dunnetts T3檢驗進行組間兩兩比較;若不符合正態(tài)分布，則采用非參數(shù)檢驗進行組間比較。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 大鼠一般情況觀察結果

造模后，假手術組大鼠精神狀態(tài)良好，活動度佳，飲食正常;各造模大鼠出現(xiàn)飲食減少、倦怠懶動、精神萎靡、毛發(fā)無光澤等情況。灌胃給藥后，各給藥組大鼠的飲食和飲水量、毛發(fā)光澤度以及活動情況均較給藥前有所改善;模型組大鼠一般情況無明顯變化。

3.2 大鼠右側腎質量測定結果

與假手術組比較，模型組大鼠右側腎質量顯著增加（P<0.01）。與模型組比較，火絨草+黃芪高劑量組、火絨草單用組、雷公藤多苷片組和鹽酸貝那普利片組大鼠腎質量均顯著降低（P<0.05）。各組大鼠右側腎質量測定結果見表1。

3.3 大鼠24 h尿蛋白和血肌酐、尿肌酐水平測定結果

與假手術組比較，模型組大鼠24 h尿蛋白、血肌酐水平顯著升高（P<0.01），尿肌酐水平顯著降低（P<0.01）。與模型組比較，火絨草+黃芪高劑量組和雷公藤多苷片組大鼠24 h尿蛋白、血肌酐水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01），尿肌酐水平均顯著升高（P<0.01）;火絨草單用組大鼠血肌酐水平顯著降低（P<0.05），尿肌酐水平顯著升高（P<0.05），但24 h尿蛋白水平差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）;鹽酸貝那普利片組大鼠24 h尿蛋白水平顯著降低（P<0.05），尿肌酐水平顯著升高（P<0.01），但血肌酐水平差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。各組大鼠24 h尿蛋白和血肌酐、尿肌酐水平測定結果見表2。

3.4 大鼠腎組織病理形態(tài)學觀察結果

假手術組大鼠的腎小球結構無明顯變化，胞外基質及系膜細胞未見增多，無炎性細胞浸潤。模型組大鼠的腎小球明顯肥大，偶有腎小球萎縮，系膜區(qū)細胞呈彌漫性增多，腎間質可見炎性細胞浸潤、腎小管壞死?；鸾q草+黃芪高、中、低劑量組大鼠腎組織中可見腎小球結構、系膜細胞及基質分別呈現(xiàn)輕、中、重度變化;火絨草+黃芪高劑量組可見少量炎癥細胞浸潤;火絨草+黃芪中、低劑量組可見大量炎癥細胞浸潤。火絨草單用組可見腎小球結構輕度改變，系膜細胞、基質明顯增生，大量炎性細胞浸潤。雷公藤多苷片組可見輕微腎小球肥大，系膜細胞、基質輕度增生，炎性細胞浸潤不明顯。鹽酸貝那普利片組未見腎小球及毛細血管壁受損，可見系膜細胞輕度增生，胞外基質基本正常，未見炎性細胞浸潤。各組大鼠腎組織病理形態(tài)學觀察結果見圖1。

3.5 大鼠腎組織中NF-κB p65蛋白表達水平檢測結果

與假手術組比較，模型組大鼠腎組織中NF-κB p65的蛋白表達水平顯著升高（P<0.05）。與模型組比較，火絨草+黃芪高劑量組和鹽酸貝那普利片組大鼠腎組織中NF-κB p65的蛋白表達水平均顯著降低（P<0.05）。各組大鼠腎組織中NF-κB p65蛋白表達檢測結果見圖2、表3。

3.6 大鼠腎組織中NF-κB p65、IκBα、p-ERK、ERK和p38 MAPK蛋白表達水平檢測結果

與假手術組比較，模型組大鼠腎組織中NF-κB p65、p-ERK和p38 MAPK蛋白表達水平均顯著升高（P<0.01），IκBα蛋白表達水平顯著降低（P<0.05），ERK蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。與模型組比較，火絨草+黃芪高劑量組和鹽酸貝那普利片組大鼠腎組織中NF-κB p65、p-ERK和p38 MAPK蛋白表達水平均顯著降低（P<0.05），IκBα蛋白表達水平均顯著升高（P<0.05），其余各組上述指標差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。各組大鼠腎組織中NF-κB p65、IκBα、ERK、p-ERK和p38 MAPK蛋白表達的檢測結果見圖3、表4。

4 討論

血管緊張素Ⅱ（Agn Ⅱ）在MsPGN發(fā)病中起著關鍵作用，其可刺激腎小球內皮細胞及系膜細胞增生[14]。鹽酸貝那普利片具有抑制Agn Ⅱ生成的作用，可緩解MsPGN腎功能損害[15]。中醫(yī)學認為，MsPGN 屬“水腫、尿血”等范疇，其病機實為風邪外侵、水濕內停、氣滯血瘀等，治療時應遵循清熱利濕、祛瘀活血的辨證施治原則[16]。雷公藤多苷片作為非甾體免疫抑制劑，具有祛風除濕、通絡除痹等功效，其可改善腎小球濾過膜通透性、抑制系膜增生，從而有效地控制MsPGN的發(fā)展，故廣泛應用于MsPGN的治療[17-18]。因此，本研究選用鹽酸貝那普利片和雷公藤多苷片同時作為陽性對照藥。

24 h尿蛋白水平升高是腎小球疾病常見的臨床表現(xiàn)，該指標對腎臟疾病的診斷以及療效、預后的判定均起到關鍵作用[19]。研究表明，過量的蛋白尿可通過ERK、NF-κB p65和p38 MAPK途徑誘導促炎因子（如生長因子、細胞因子和趨化因子等）表達，進一步導致腎小球損傷，加重腎衰竭[20]。火絨草單用可降低MsPGN模型大鼠腎質量和血肌酐水平，升高其尿肌酐水平，但對MsPGN發(fā)病較為重要的因素——24 h尿蛋白——則沒有顯著影響?；鸾q草和黃芪聯(lián)用后，不僅可顯著改善MsPGN模型大鼠的上述指標，還可顯著降低24 h尿蛋白水平，在治療MsPGN方面，療效明顯優(yōu)于火絨草單獨應用，故在機制研究中僅考察了火絨草和黃芪聯(lián)用的作用機制。

NF-κB是一條經(jīng)典炎癥信號轉導通路。靜息狀態(tài)下，NF-κB p65與IκBα結合在一起;當有外源性刺激時， IκBα與NF-κB p65解離，IκBα表達減少，NF-κB p65進入細胞核內，啟動MsPGN的炎癥反應[21]。研究發(fā)現(xiàn)，NF-? κB p65活性的降低可以顯著抑制MsPGN模型大鼠腎組織中炎性因子的表達，抑制系膜細胞增殖和減少蛋白尿的產生[22]。本研究結果顯示，與假手術組比較，模型組大鼠腎組織中IκBα蛋白表達水平顯著降低，NF-κB p65蛋白表達水平顯著升高;給藥后，高劑量火絨草+黃芪干預后可以顯著上調MsPGN模型大鼠腎組織中IκBα蛋白表達，下調NF-κB p65蛋白表達。

[20] ANGELIAUE B，STEPHANIE B，DAMIEN S，et al. Spot urine protein-to-creatinine ratio as a diagnostic test in pre-eclampsia：a gold standard？[J]. Int J Gynecol Obstet，2020，149（1）：76-81.

[21] LUO M，YAN DS，SUN QS，et al. Ginsenoside Rg1 atte- nuates cardiomyocyte apoptosis and inflammation via the TLR4/NF-kB/NLRP3 pathway[J]. J Cell Biochem，2020，121（4）：2994-3004.

[22] CHALMERS SA，GARICIA SJ，REYNOLDS JA，et al. NF-kB signaling in myeloid cells mediates the pathogenesis of immune-mediated nephritis[J]. J Autoimmun，2019.DOI：10.1016/j.jaut.2018.11.004.

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[24] 徐文燕，管青聰，徐芳.丹參提取物對系膜增生性腎小球腎炎大鼠TGF-β1/p38MAPK信號通路的影響研究[J].新中醫(yī)，2020，52（2）：5-9.

[25] 于洋，楊玉清，田繼華.他克莫司對系膜增生性腎小球腎炎作用機制的研究[J].中國藥物與臨床，2019，19（14）：2354-2356.

（收稿日期：2020-03-09 修回日期：2020-06-21）

（編輯：林 靜）